CC BY
19УДК 615.811.1:612.128616-005.4:577.11/12:616-092.4
ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ И АНТИОКСИДАНТЫ В ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ОРГАНОПАТОЛОГИИ ПРИ РЕПЕРФУЗИОННОМ СИНДРОМЕ, ОСЛОЖНЕННОМ КРОВОПОТЕРЕЙ
В. З. Харченко1, А. В. Кубышкин1, Л. В. Анисимова1, И. И. Фомочкина1, Н. Л. Иванцова2,
А. А. Жукова3, А. А.Бекетов1 , А. А. Писарев1
1кафедра общей и клинической патофизиологии 2кафедра фармакологии 3кафедра биологии медицинской Медицинская академия имени С. И. Георгиевского
ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского»
Адрес переписки: бул. Ленина 5/7, г. Симферополь, 295006, Республика Крым, Российская Федерация
РЕЗЮМЕ
Экспериментальные исследования, проведенные на 79 белых крысах линии «Vistar» показали, что при ишемии задних конечностей крыс происходит инициация каскада патологических реакций организма, которые максимально реализуются в реперфузионную фазу процесса. При моделировании реперфузионного синдрома и реперфузионного синдрома, осложненного кровопотерей происходит активация протеолитических ферментов в супернатантах гомогенатов почек на фоне снижения уровня их ингибиторов. Дисбаланс протеиназ-ингибиторной системы ткани почки создает возможность реализации деструктивного потенциала протеиназ и способствуя развитию синдрома полиорганной недостаточности.
PROTEINASE INHIBITORS AND ANTIOXIDANTS IN THE PATHOGENIC THERAPY OF ORGANOPATHOLOGY CAUSED BY REPERFUSION SYNDROME COMPLICATED WITH
BLOOD LOSS.
V. Z. Kharchenko, A. V. Kubyshkin, L. V. Anisimova, I. I. Fomochkina, N. L. Ivantsova, A. A. Zhukova, A. A.Beketov, A. A.Pisarev
SUMMARY
Experimental study conducted on 76 white rats of Vistar lineage revealed that ischemia of hind limbs causes cascade of pathologic reactions culminating in reperfusion stage of the process. Modeling of reperfusion syndrome (RS) and RS complicated by the blood loss revealed that activation of proteolytic enzymes accompanied by decrease in their inhibitor activity happens in the supernatant of kidney tissue homogenate. This disbalance in proteinase inhibitory system of kidney tissue results in realization of destructive potential of proteinases and promotes development of the multi organ failure syndrome.
Ключевые слова: реперфузионный синдром, протеиназ-ингибиторная система, полиорганная недостаточность.
Реперфузионный синдром (РС) представляет при котором наиболее часто развивается син-
собой одну из наиболее актуальных и перспек- дром полиорганной недостаточности, одним из
тивных проблем патологической физиологии, ключевых органов мишений которой является
хирургии и интенсивной терапии. При восста- острая почечная недостаточность (ОПН) [4,11].
новлении кровообращения у пострадавших с Основными звеньями РС являются нарушение
травмами опорно-двигательного аппарата со системной гемодинамики и регионарной микро-
сдавлением мягких тканей, при выполнении циркуляции, резкому снижению фильтрации и
реконструктивно-восстановительных операций запуску ОПН. Вторым по значимости фактором,
на сердце и магистральных сосудах возникает определяющим развитие ОПН, является по-
РС, характеризующийся тяжелым течением и вреждение тканей (краш-синдром). При этих со-
высокой летальностью, достигающей по разным стояниях в кровь поступает большое количество
источникам 30-70% [4,10,11]. Важным факто- биологически активных веществ - гистамина,
ром, усугубляющим течение и прогноз РС, яв- серотонина, кининов и протеолитических фер-
ляется острая кровопотеря. Следует отметить, ментов, вызывающих поражение почек[9,12].
что частота комбинированных поражений, в Кроме того, при восстановлении кровообра-
том числе сочетание реперфузионных наруше- щения включается целый ряд гуморальных ме-
ний с острой кровопотерей, является типичным ханизмов, вызывающих повреждение органов
явлением при различных травмах и оператив- и систем и приводящих к гибели организма.
ных вмешательствах [6,9]. РС, по мнению мно- К таким механизмам относят чрезмерную ак-
гих авторов, одно из критических состояний, тивацию протеолиза и процессов перекисного
2016, т. 6, №2
КРЫМСКИЙ ЖУРНАЛ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ
окисления липидов (ПОЛ) [7,8,10,13]. Это обусловило усиление интереса к изучению роли нарушений баланса протеиназ-ингибиторной и прооксидантно-антиоксидантной систем в генезе РС и к поискам препаратов полифункциональных ингибиторов протеолитических ферментов и антиоксидантов средств для контроля и ограничения избыточного протеолиза и свободно-радикального окисления (СРО), играющих универсальную роль в развитии различных функциональных органно-системных расстройств, приводящих к развитию синдрома полиорганной недостаточности (СПОН) [1,6].
Следует отметить, что многие вопросы, касающиеся роли активации протеолиза и СРО в развитии органопатологии при РС, осложненного кровопотерей, остаются дискутабельными. В связи с этим требуют дальнейшего изучения и вопросы, касающиеся возможности использования антиоксидантов и ингибиторов проте-иназ для патогенетической коррекции изучаемой патологии профилактики развития СПОН.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследования были проведены на 79 белых крысах линии «Vistar» (массой 180-200 граммов). Острую кровопотерю вызывали с помощью забора крови из хвостовой вены из расчета 10 % от ОЦК. Непосредственно после острой кровопотери формировали ишемию, путем наложения резиновых жгутов на уровне паховой складки на обе задние конечности сроком 6 часов под легким эфирным наркозом. РС моделировали путем реваскуляризации ранее ишемизированных конечностей. Изучение эффективности экспериментальной коррекции с использованием ингибитора протеиназ и ан-тиоксиданта проводилось путем однократного внутрибрюшинного введения препаратов перед снятием жгутов. В качестве ингибитора проте-иназ применяли гордокс (aprotininum, Gedeon Richter, Венгрия). В качестве антиоксиданта использовали корвитин, являющийся водорастворимой формой биофлавоноида кверцетина (ЗАО НПЦ "Борщаговский химико-фармацевтический завод", г. Киев). Гордокс вводили в дозе 20000 КИЕД/кг, разведенный в изотоническом растворе натрия хлорида, из расчета 10 мл/кг массы. Корвитин вводили в дозе 10 мг/ кг массы тела, разведенный в изотоническом растворе натрия хлорида, из расчета 10 мл/кг массы. Крысам контрольной и экспериментальных групп без лечения вводили изотонический раствор натрия хлорида из расчета 10 мл/кг.
Забор биологического материала производили через 12 часов после реваскуляриза-
ции конечностей. Гомогенаты тканей печени и почки получали по методике, описанной В.А. Барабой и соавторами [2]. Экспериментальные исследования проводились в соответствии с требованиями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются в исследовательских и других научных целях» (Strasburg, 18.03.1986).
Исследуемые животные были разделены на 7 групп: I группа - контрольная, интактные животные (n=12), II группа - ишемия 6ч, без реперфузии(п=10), III группа - РС 12ч, (n=10), IV группа - РС 12ч, осложненный кровопоте-рей (п=11), V группа - РС 12ч, осложненный кровопотерей+корвитин (n=12), VI группа -РС 12ч, осложненный кровопотерей+гордокс (n=12), VII группа - РС 12ч, осложненный кровопотерей +корвитин+гордокс (n=12).
Активность протеиназ и их ингибиторов исследовали с использованием энзиматиче-ских методов [5]. Протеолитическую активность оценивали по уровню эластазоподоб-ной активности (ЭПА) и трипсиноподобной активности (ТПА) супернатантов гомогенатов почек крыс. Оценку активности ингибиторов протеиназ осуществляли по уровню антитрип-тической активности (АТА) и уровню кисло-тостабильных ингибиторов (КСИ) суперна-тантов гомогенатов почек крыс. Полученные результаты определения показателей в супер-натантах гомогенатов почек пересчитывали на 1г белка, который определяли методом Лоури.
Все полученные результаты исследований подвергали статистической обработке методом вариационной статистики, с выведением критерия достоверности Стьюдента, достоверными считали показатели при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе изучения протеиназ-ингибиторного системы супернатантов гомогенатов почек крыс с развитием ишемии была выявлена тенденция к росту ТПА, ЭПА, АТА, КСИ по сравнению с показателями интактных животных (табл.1).
Моделирование РС, продолжительностью 12 часов (III группа) также вызвало недостоверный рост ТПА и ЭПА на фоне снижения уровней АТА и КСИ по сравнению с показателями контрольной группы животных. При развитии РС, осложненного кровопотерей (IV группа) было отмечено более выраженное повышение уровней неспецифических протеиназ и снижение их ингибиторов по сравнению животными контрольной группы. Так, ТПА была на 21,4 % выше, а уровнь АТА на 25,4 %, КСИ - на 34,2 % ниже показателей интактных животных.
Таблица 1
Динамика изменений протеиназ-ингибиторной системы супернатантов гомогенатов почек крыс при РС, осложненном кровопотерей и при комбинированном лечении
Группа Показатель
ТПА ЭПА АТА КСИ
мкМоль/мг*мин мИЕ/мг*мин ИЕ/мг*мин
I группа 6,07±0,30 24,62±3,64 46,45±4,66 9,04±0,71
II группа 6,27±0,92 26,67±1,58 48,77±4,77 10,45±0,52
III группа 7,96±1,11 28,37±3,03 42,80±4,23 5,95±0,23*
IV группа 7,37±0,33* 27,36±1,58 34,64±2,40* 3,49±0,73*
V группа 6,15±0,59** 23,69±1,72 38,73±3,24* 5,43±0,69*
VI группа 3,97±0,26*,** 20,08±1,34** 46,96±2,62** 10,97±0,93**
VII группа 5,30±0,55** 20,33±1,31** 42,16±2,52** 11,56±0,57**
Примечание: *р<0,05, по сравнению с группой контроля; **р<0,05 по сравнению с группой без лечения
Через 12 часов после реваскуляризации конечностей крыс с моделированием РС, осложненного кровопотерей в супернатантах гомогенатов почек на фоне применения антиоксидан-та (V группа) было выявлено снижение ТПА на 16,5 % по сравнению с группой без лечения. Использование ингибитора протеиназ (VI группа) привело к более выраженному снижению изучаемого показателя на 46,1 % по сравнению со значениями группы без лечения и на 34,6% по сравнению со значениями группы интактных животных. Сочетанное применение антиок-сиданта и ингибитора протеиназ (VII группа) вызвало снижение уровня ТПА в супернатан-тах гомогенатов почек на 28,1 % (р<0,001) по сравнению со значениями группы без лечения. Патогенетическая коррекция РС, осложненного кровопотерей, к 12-му часу исследований вызвала снижение ЭПА в супернатантах гомогенатов почек всех трех групп по сравнению с аналогичной группой без лечения. Причем уровень ЭПА в данных группах достоверно не отличался от уровня ЭПА в крови здоровых крыс. Применение ингибитора протеиназ и антиокси-данта вызвало рост АТА во всех группах с лечением по сравнению с группой без лечения. Причем наиболее выраженный рост АТА был отмечен при использовании ингибитора про-теиназ. АТА в данной группе выросла на 35,6 % (р<0,001) по сравнению со значениями группы без лечения. Наиболее существенный рост КСИ был отмечен в группах с применением ингибитора протеиназ и сочетанным применением ингибитора протеиназ и антиоксиданта. Так в данных группах уровень КСИ вырос в 3 раза по сравнению со значениями группы без лечения. При этом уровни КСИ в данных группах пре-
вышали значения контрольной группы соответственно на 21,3 % (р>0,1) и на 27,9 % (р<0,01).
Таким образом, в ходе проведенных исследований можно предположить, что при ишемии задних конечностей крыс происходит инициация каскада патологических реакций организма, которые максимально реализуются в реперфузионную фазу процесса. При моделировании РС и РС, осложненного кровопоте-рей происходит активация протеолитических ферментов в супернатантах гомогенатов почек на фоне снижения уровня их ингибиторов. Дисбаланс протеиназ-ингибиторной системы ткани почки создает возможность реализации деструктивного потенциала протеиназ (повреждение эндотелия, других структурных элементов сосудистой стенки и гибель клеток) и способствуя развитию органопатологии.
Введение антиоксиданта, ингибитора про-теиназ и сочетанное применение этих препаратов для патогенететической коррекции РС, продолжительностью 12 часов, осложненного кровопотерей, способствовало снижению ТПА, ЭПА и нормализации уровней ингибиторов в супернатантах гомогенатов почек экспериментальных крыс. Причем, сочетан-ное применение антиоксиданта и ингибитора протеиназ для патогенетической коррекции РС, осложненного кровопотерей, оказалось наиболее эффективным для снижения уровня протеолитических ферментов и повышения уровня их ингибиторов в ткани почек.
ВЫВОДЫ
1. Ишемия нижних конечностей в течение 6 ч у крыс приводит к росту уровня преолити-ческих ферментов и их ингибиторов в суперна-
2016, т. 6, №2
КРЫМСКИЙ ЖУРНАЛ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ
тантах гомогенатов почек, что свидетельствует об активации защитных сил организма и компенсации действия повреждающего фактора.
2. Развивающийся дисбаланс протеиназ-ингибиторной системы может свидетельствовать о тяжести критического состояния и указывать на степень деструктивных повреждений.
3. Развитие РС и РС, осложненного кровопотерей сопровождается развитием дисбаланса протеиназ-ингибитор-ной системы в супернатантах гомогена-тов почек, способствуя развитию СПОН.
4. Назначение комбинации препаратов ингибиторов протеиназ и антиокси-дантов позволяет снизить возможность развития СПОН в период реперфузии.
Работа выполнена при поддержке Минобрнауки РФ в рамках базовой части госзадания по проекту №3884.
ЛИТЕРАТУРА
1. Анисимова Л.В. Роль активации неспецифических протеиназ сыворотки крови в формировании синдрома полиорганной недостаточности. Вестник неотложной и восстановительной медицины.2013; 14(2): 193-195.
2. Барабой В.А., Сутковой Д.А. Окислительно-антиоксидантный гомеостаз в норме и патологии. Киев: Чернобыль-интеринформ; 1997.
3. Брюсов П.Г Лечение острой массивной крово-потери. Военно-медицинский журнал. 2008; 1: 17-22.
4. Хунафина Д.Х., Галиева А.Т. Инфекционно-ток-сический шок в клинике геморрагической лихорадки с почечным синдромом Успехи современного естествознания. 2011; 1: 108-110.
5. Кубышкин А.В., Фомочкина И.И. Эластолитиче-ская активность бронхоальвеолярного лаважа при моделировании воспалительного процесса в легких. Укр. биохим.журн. 2008; 80(1): 89-95.
6. Бугаенко О.А., Михайличенко В.Ю., Анисимова Л.В., Кубышкин А.В. Локальные и дистантные реакции неспецифических протеиназ и их ингибиторов при остром экспериментальном панкреатите. Таврический медико-биологический вестник. 2014; 17(4): 9-12.
7. Лукьянова Л.Д., Германова Э.Л., Лыско А.И. Энерготропное, антигипоксическое и антиоксидантное действие флаваноидов. Вестник Российской АМН. 2007; 2: 55-63.
8. Ландышев Ю.С., Целуйко С.С., Щербань Н.А. Морфологические особенности поражения респираторной системы при хронической почечной недостаточности (экспериментальное исследование). Дальневосточный медицинский журнал. 2011; 2: 81-83.
9. Колесников С.В., Борисов А.С. Острое почечное повреждение: новые аспекты известной проблемы. Патология кровообращения и кардиохирургия. 2013;4: 69-73.
10. Соболева Е.Л., Орлов Ю.П. О возможных путях профилактики реперфузии при критических состояниях. Сибирский медицинский журнал. 2012; 1: 13-16.
11. Харченко В.З., Кубышкин А.В., Фомочкина И.И. и др. Молекулярные механизмы развития экстремальных состояний и их коррекция. Симферополь; 2001.
12. Gueret G., Lion F., Guriec N. et al. Acute renal dysfunction after cardiac surgery with cardiopulmonary bypass is associated with plasmatic IL6 increase. Cytokine. 2009; 45 (2): 92-98.
13. Siwik D. A. Oxidative stress regulates collagen synthesis and matrix mttalloproteinase activitiy cagdiac fibroblasts. Am. J. Physiol. 2001; Vol. 280: 53-60.
