CC BY
16УДК: 616-092:616.15:616-008.64
СИСТЕМА ПРОТЕОЛИЗА СЫВОРОТКИ КРОВИ В ФОРМИРОВАНИИ СИНДРОМА
ПОЛИОРГАННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ
Л. В. Анисимова, В. З. Харченко, М. И. Федосов, А. В. Кубышкин
Кафедра общей и клинической патофизиологии
Медицинская академия имени С. И. Георгиевского
ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского»
Адрес переписки: бул. Ленина, 5/7, г. Симферополь, 295006, Республика Крым, Российская Федерация
E-mail: [email protected]
РЕЗЮМЕ
Одним из неизбежных осложнений при критических состояниях является сочетание недостаточности функций различных органов и систем - синдром полиорганной недостаточности (СПОН), который является более тяжелой фазой развития системного воспалительного ответа (ССВО). Экспериментальные исследования, проведенные на 34 белых крысах-самцах линии «Wistar» массой 180-210 г., выявили, что при формировании СПОН развивается дисбаланс в протеиназ-ингибиторной системе, характеризующийся ростом активности протеиназ и угнетением ингибиторного потенциала независимо от первичной патологии, приведшей к формированию СПОН.
THE ROLE OF PROTEINASE-INHIBITORY SYSTEM OF BLOOD SERUM IN FORMATION OF THE SYNDROME OF POLYORGAN INSUFFICIENCY
L. V. Anisimova, V. Z. Kharchenko, M. I. Fedosov, A. V. Kubyshkin
SUMMARY
The multiple organ dysfunction syndrome (MODS) - one of the fatal complications at critical states is the combination of insufficiency of organs and systems, which is the more severe phase of the systemic inflammatory response syndrome (SIRS). The experimental research made on 34 white male rats "Wistar" with mass of 180-210 g. has revealed, that during MODS -formation the disbalance in the proteinase-inhibitory system appears; it is characterized by rise of the proteinase activity and regardless of the primary pathology, which caused MODS. The rise of the proteinase content indicates the strengthening of destructive processes in the organism, while the reduction of inhibitory potential's activity indicates the suppression of the protective abilities of the organism.
Ключевые слова: полиорганная недостаточность, протеиназ-ингибиторная система, патогенез
Синдром полиорганной недостаточности (СПОН) на сегодняшний день относят к одному из наиболее серьезных осложнений критических состояний, которое развивается на фоне синдрома системного воспалительного ответа (ССВО). Считается, что СПОН представляет собой неспецифическую стресс-реакцию организма крайне тяжелой степени, которая обусловлена прогрессирующим нарушением метаболизма в органах с развитием синдрома их гиперметаболической гипоксии и последующим высоким риском летальных исходов или инвалидизации у выживших [7, 8, 10].
Как известно, в исследованиях механизмов адаптивной регуляции функций и состояний человека до настоящего времени широко используются системы медицинского контроля, включающие регистрацию общепринятых ге-модинамических и вегетативных показателей, клинико-лабораторные и биохимические исследования крови и мочи [11]. Такой подход в большей или меньшей степени позволяет судить о грубых системных нарушениях при острых заболеваниях, но имеет существен-
ные ограничения, обладает низкой специфичностью и недостаточно надежен для ранней и точной диагностики СПОН. В то же время, поиск более информативных маркеров развития СПОН остается в числе актуальных задач медицины критических состояний [12, 13].
Определение неспецифических протеиназ и их ингибиторов рассматривается как одно из перспективных направлений поиска маркеров тканевого повреждения, а, следовательно, и развития СПОН. Это, прежде всего, связано с участием неспецифических протеиназ в развитии необратимых реакций, образовании биологически активных веществ, обеспечении быстрого ответа клетки на действие раздражителей эндогенной и экзогенной природы и участия в формировании различной патологии [1-3,9]. Таким образом, протеиназ-ингибитор-ную систему можно отнести к группе факторов, которые отражают степень деструкции тканей при различных патологических процессах, в связи, с чем их определение может дать представление об общих закономерностях развития СПОН как тяжелого осложнения ССВО.
Целью нашей работы явилась выявить возможность использования показателей активности протеиназ-ингибиторной системы в качестве маркеров оценки развития критических состояний приводящих к развитию СПОН.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Экспериментальные исследования проведены на 34 белых крысах-самцах линии «Wistar» массой 180-210 г в соответствии с принципами биоэтики.
Формирование синдрома полиорганной недостаточности (СПОН) проводили путем моделирования двух экстремальных клинических состояний: первый - реперфузионный синдром (РС), второй - острый разлитой перитонит (ОРП).
РС моделировали путём наложения резиновых жгутов на обе задние конечности на уровне паховой складки сроком на 6 часов. Ширина пережатия тканей составила 2-3 мм. Показателем правильности наложения жгута являлось отсутствие отёка конечностей и бледность их окраски. Реваскуляризация производилась одномоментно путём рассечения жгутов через 6 часов после их наложения.
ОРП вызвали путем внутрибрю-шинного введения в брюшную полость 1 мл 10% гомогенной каловой суспензии на 100г массы тела животного [4].
Эвтаназию животных осуществляли под тиопенталовым наркозом путём декапита-ции через 24 часа после реперфузии (n=12), и через 24 часа после введения каловой суспензии (n=10). В качестве контроля служила группа интактных животных (n=12).
Определение активности компонентов про-теиназ-ингибиторной системы проводили с использованием энзиматических методов [6] на спектрофотометре "Biomat 5» (Великобритания). Трипсиноподобную активность (ТПА) определяли по скорости отщепления N-бензоил-Ь-аргинина от синтетического субстрата этилового эфира N-a-Benzoil-L-arginine ethyl ester hydrochloride (BAEE) (Sigma). Определение эластазоподобной активности (ЭПА) проводили на основании изучения скорости гидролиза синтетического субстрата Boc-L-alanine-4-nitrophenil ester (Boc-Ala-ONp) (Sigma). Определение концентрации альфа-1-ингибитора протеиназ (АТА) проводили на основании торможения расщепления трипсином BAEE. Аналогично определялась активность кислотостабильных ингибиторов (КСИ) после предварительной подготовки сыворотки путём прогревания в кислой среде.
Статистическая обработка полученных данных проведена с применением методов
вариационной статистики с вычислением средних величин (M), оценкой вероятности расхождений (m), оценкой достоверности изменений с использованием t-критерия Стьюдента. За достоверную принималась разность средних значений при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Морфологические исследования ключевых органов-мишеней при формировании СПОН, а именно ткань легких, печени, почек, миокарда, кишечника выявили, что у экспериментальных животных с моделями РС и ОРП отмечаются характерные признаки, проявляющиеся в основном, гемодинамическими расстройствами и дистрофическими изменениями функциональных клеток с явлениями альтерации. Наиболее выраженные нарушения кровообращения и некротические процессы наблюдали в ткани легких, где обнаруживали признаки диффузного альвеолярого повреждения, особенно в группе с РС. Выявленные патоморфологиче-ские сдвиги отмечались также в желудке, различных отделах кишечника (в первую очередь толстом), а также в печени и миокарде. Наряду с наличием фибриновых и эритроцитарных тромбов в сосудах микроциркуляторного русла указанных органов определяются участки инфаркта, фибриноидный некроз стенок сосудов, периваскулярные кровоизлияния и лимфолей-коцитарные инфильтраты. В группе экспериментальных животных с моделированной ОРП наблюдалась тромботическую ангиопатию в брыжеечных артериях, эрозии и острые язвы в слизистой желудочно-кишечного тракта и мелкокапельная жировая дистрофия гепатоцитов. Выявленные нами изменения показывают, что главной причиной дисфункции органов при СПОН являются гемодинамические нарушения, проявляющиеся тромботическими микро-ангиопатиями. Расстройства микроциркуляции усугубляются отеком стромы органов, набуханием и некрозом функциональных клеток и периваскулярными кровоизлияниями в ткани.
Изучение показателей протеиназ-ингиби-торного баланса сыворотки крови у животных с экспериментальными моделями РС и ОРП показало, что в процессе формирования СПОН независимо от этиологического фактора происходит повышение активности ТПА на фоне угнетения АТА и КСИ.
Исследование протеолитической активности сыворотки крови на модели РС выявило, что у животных через 24 часа после реваску-ляризации конечности ТПА относительно контроля увеличилась - в 1,8 раза (р<0,01), активность эластазоподобных протеиназ, на-
оборот, снизилась - в 1,5 раза (р<0,01) (рис.1). При моделировании ОРП у экспериментальных животных через 24 часа от момента введения каловой суспензии ТПА увеличивалась в 2,7 раза (р<0,001), а ЭПА в 1,9 раза (р<0,001)
относительно группы контроля. Снижение уровня ЭПА при РС по нашему мнению связано с более выраженным угнетением анти-протеазной активности, чем при ОРП, что не противоречит литературным данным [5].
о с
£ -00
■100 реперфушонньш синдром Перитонит
Рис. 1. Изменение протеиназ-ингибиторной системы сыворотки крови при экспериментальном ре-
перфузионном синдроме и перитоните
Рост активности протеиназ сопровождался угнетением ингибиторного потенциала. Видимо такая реакция со стороны ингибиторов отражает угнетение их протекторной функции и степень активности протеиназ. Так при моделировании РС в экспериментальной группе в которую вошли животные через 24 часа после восстановления кровотока уровень АТА относительно контроля снизился в 1,7 раза, однако эти изменения были статистически недостоверны, в то же время уровень КСИ статистически достоверно снизился в 2,6 раза (р<0,001). Моделирование ОРП у экспериментальных животных через 24 часа от момента введения каловой суспензии приводило к уменьшения АТА сыворотки крови относительно контроля в 1,1 раза (р<0,001), а КСИ в 2,3 раза (р<0,001).
Полученные экспериментальные данные показывают, что при формировании СПОН развивается дисбаланс в протеиназ-ингиби-торной системе, который характеризуется ростом активности протеиназ и угнетением ингибиторного потенциала. Следует также отметить, что при РС рост ТПА менее выражен, чем при ОРП. Однако, вместе с этим, при развитии РС, происходит более существенный дефицит инибиторного потенциала, чем при ОРП.
Сопоставление результатов состояния про-теиназ-ингибиторной системы у экспериментальных животных показало, что имеется одинаковая динамика изменений активности протеиназ и их ингибиторов независимо от первичной патологии, приведшей к формированию СПОН. Увеличение уровня протеиназ свидетельствует об усилении деструктивных
процессов в организме, а снижение активности ингибиторного потенциала говорит об угнетении протекторных свойств организма.
ВЫВОДЫ
1. Рост активности трипсиноподобных протеиназ на фоне снижения АТА и КСИ, которые не способны компенсировать действие про-теиназ, является характерной реакцией для РС и ОРП и способствует формированию СПОН.
2. Определение показателей пртеи-наз-ингибиторной системы может быть эффективным диагностически-прогностическим маркером в процессе развития СПОН.
Работа выполнена при поддержке Миноб-рнауки РФ в рамках базовой части госзадания по проекту №3884 и в рамках реализации проекта сети академической мобильности «Развитие научных исследований в области экспериментальной медицины - РНИЭМ»
ЛИТЕРАТУРА
1. Анисимова Л.В. Роль активации неспецифических протеиназ сыворотки крови в формировании синдрома полиорганной недостаточности. Вестник неотложной и восстановительной медицины. 2013;14(2):193-195.
2. Анисимова Л.В., Кубышкин А.В. Неспецифические протеиназы и их ингибиторы при синдроме острого повреждения легких в эксперименте. Вестник неотложной и восстановительной медицины. 2014;15(2):296-299.
3. Бугаенко О.А., Анисимова Л.В., Кубышкин А.В. Состояние протеиназ-ингибиторного баланса перито-нального секрета у больных с панкреатитом и другими формами острой абдоминальной патологии. Тавриче-
ский медико-биологический вестник. 2012;15 (3 ч 2):51-54.
4. Гостищев В. К., Сажин В. П., Авдовенко А. Л. Перитонит. М.: ГЭОТАР - Медиа; 2002.240 с.
5. Белова Л.А., Оглобина О.Г., Саталкин А.А. и др. Дисбаланс протеиназно-ингибиторной системы при акушерском сепсисе и септическим шоке. Клиническая лаборторная диагностика. 2003;7:13-16.
6. Кубышкин А.В., Харченко В.З., Семенець П.Ф., Алиев Л.Л., Фомочкина И.И, Анисимова Л.В. Методы определения активности неспецифических протеиназ и их ингибиторов в сыворотке крови и биологических гидкостях. Киев; 2010.28 с.
7. Бугаенко О.А., Михайличенко В.Ю., Анисимова Л.В., Кубышкин А.В. Локальные и дистантные реакции неспецифических протеиназ и их ингибиторов при остром экспериментальном панкреатите. Таврический медико-биологический вестник. 2014; 17(4):9-12.
8. Никонов В.В., Павленко А.Ю., Белецкий А.В. Синдром полиорганной недостаточности: «шоковое легкое». Медицина неотложных состояний. 2011;7-8:9-16.
9. Смолиенко В.Н., Анисимова Л.В., Притуло О.А., Кубышкин А.В. Роль процессов протеолиза в развитии трофических язв при варикозной болезни. Актуальные проблемы транспортной медицины. 2013;2(32-2):57-60.
10. Harr JN, Moore EE, Johnson J et all. Antiplatelet Therapy Is Associated With Decreased Transfusion-Associated Risk of Lung Dysfunction, Multiple Organ Failure, and Mortality in Trauma Patients. Critical Care Medicine. 2013;41:399-404.
11. Cohen MJ, Call М, Nelson М et all. Critical Role of Activated Protein C in Early Coagulopathy and Later Organ Failure, Infection and Death in Trauma Patients. Ann Surg. 2012;255(2):379-385.
12. Teoh H, Quan A, Creighton AK et all. BRCA1 gene therapy reduces systemic inflammatory response and multiple organ failure and improves survival in experimental sepsis. Gene Therapy. 2013;20:51-61.
13. Valparaiso AP, Vicente DA, Bograd BA et all. Modeling acute traumatic injury. Journal of Surgical Research. 2015;194:220-232
