CC BY
272017, т. 7, № 3
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
УДК: 616-005.1-008.6:577.15:615.03:612-092.11.9
ИНГИБИТОРЫ ФЕРМЕНТОВ ПРОТЕОЛИЗА И АНТИОКСИДАНТЫ В ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ РЕПЕРФУЗИОННОГО СИНДРОМА, ОСЛОЖНЕННОГО КРОВОПОТЕРЕЙ
Харченко В. З.1, Жукова А. А.2, Кубышкин А. В.1, Смирнова С. Н.2, Лященко О. И.2
1 Кафедра общей и клинической патофизиологии
2 Кафедра биологии медицинской, Медицинская академия имени С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского», 295051, бул. Ленина, 5/7, Симферополь, Россия
Для корреспонденции: Жукова Анна Александровна, кандидат биологических наук, ассистент кафедры биологии медицинской Медицинской академии имени С. И. Георгиевского, е-mail: [email protected]
For correspondence: Anna A. Zhukova, PhD of the Department of medical biology, Medical Academy named after S. I. Georgievsky of Vernadsky CFU, е-mail: [email protected]
Information about authors
Kharchenko V. Z. http: // orcid.org/0000-0001-6607-1141 Zhukova A. A., http: // orcid.org./ 0000-0002-0725-2089 Kubyshkin A. V., http: // orcid.org./0000-000201309-4005 Smirnova S. N., http: // orcid.org/0000-0002-4460-0935 Lyashchenko O. I., http: // orcid.org/0000-0002-8832-5306
РЕЗЮМЕ
В ходе экспериментальных исследований на 97 крысах линии «Wistar» было выявлено, что развитие реперфузионного синдрома, осложненного кровопотерей, сопровождалось активацией протеолиза и реализацией его деструктивного действия. Применение ингибиторов протеиназ и антиоксидантов для патогенетической коррекции способствует нормализации показателей протеиназ-ингибиторной системы сыворотки крови и бронхоальвеолярного смыва крыс.
Ключевые слова: реперфузионный синдром, кровопотеря, полиорганная недостаточность, протеиназы, ингибиторы протеиназ, антиоксиданты.
PATHOGENETIC THERAPY OF REPERFUSION SYNDROME COMPLICATED WITH BLOOD LOSS BY ANTIOXIDANTS AND PROTEASE INHIBITORS
Kharchenko V. Z., Zhukova A. A., Kubyshkin A. V., Smirnova S. N., Lyashchenko O. I.
Medical Academy named after S. I. Georgievsky of Vernadsky CFU, Simferopol, Russia
SUMMARY
During the experimental research with using of 97 rats «Wistar, was found that the development of reperfusion injury complicated by blood loss, accompanied by activation of proteolysis that causes to the realization of the destructive effect of proteolytic enzymes. Application of proteinase inhibitors and antioxidants for the correction reperfusion injury complicated by blood loss, accompanied by the normalization of proteinase-inhibitory system of the blood serum and bronchoalveolar lavage fluid of rats.
Keywords: reperfusion injury, blood loss, multiple organ failure, protease inhibitors, antioxidants.
Реперфузионный синдром (РС) возникает в организме при ишемии (более 2 часов) мягких тканей. Подобное состояние имеет место в результате длительного наложения жгута на конечность, при сдавливающих гипсовых повязках, оперативных вмешательствах на сосудах, при сдавлении тканей обломками при землетрясениях, обвалах в шахтах и т. д. Довольно часто реперфузия тканей сопровождается кровотечением, что значительно увеличивает тяжесть развития реперфузионного синдрома [1, 2]. Несмотря на многочисленные работы отечественных и зарубежных авторов, многие вопросы патогенеза этого вида патологии остаются неизученными. Так, известно, что в патогенезе РС большое значение имеет активация системы
протеолиза, участвующая в кининообразова-нии, гемокоагуляции, фибринолизе, нарушении микроциркуляции [3, 4]. Однако роль ингибиторов протеиназ в патогенезе и патогенетической терапии реперфузионного синдрома, осложненного кровопотерей, изучены недостаточно.
Появляется воспалительный ответ, который при ишемии-реперфузии тканей обусловлен активацией каскада арахидоновой кислоты с образованием мощных вазоактивных и хемо-атрактантных медиаторов (тромбоксана, леко-триенов), продукцией лейкоцитарных адгезионных молекул, выбросом медиаторов в основном кишечного происхождения. При этом происходит активация нейтрофилов, что сопровождается выбросом во внеклеточное пространство
протеиназ и активных форм кислорода (АФК), обладающих значительным повреждающим действием на ткани организма, усиливая развитие полиорганной недостаточности [3, 5, 6].
В настоящее время большое внимание уделяется вопросам профилактики и лечения осложнений, проявляющихся в виде реперфузи-онного синдрома, при сосудистой реконструкции, транспланциях органов и тканей. Учитывая важную роль протеиназ и оксидантов в патогенезе РС, осложненного кровопотерей, целесообразным является использование для патогенетической коррекции данного состояния ингибиторов, подавляющих активность эндогенных протеолитических ферментов и антиоксидантов, защищающих ингибиторы протеиназ от воздействия АФК [7,8]. В связи с этим целью нашей работы явилось установление роли процессов активации протеолиза в патогенезе РС, осложненного кровопоте-рей, и развитии органопатологии при данном состоянии, экспериментально обосновать патогенетическую коррекцию указанных состояний с помощью сочетанного применения ингибиторов протеиназ и антиоксидантов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Эксперимент был проведен на 97 белых крысах линии «Wistar» (массой 180-200 граммов). Острую кровопотерю вызывали с помощью забора крови из хвостовой вены из расчета 10 % ОЦК. Непосредственно после острой кровопо-тери формировали ишемию путем наложения резиновых жгутов на уровне паховой складки на задние конечности сроком 6 часов под легким эфирным наркозом. РС моделировали путем реваскуляризации ранее ишемизированных конечностей. Забор биологического материала производили через 24 часа после реваскуляри-зации конечностей. Кровь для исследований получали при декапитации наркотизированных крыс. Бронхоальвеолярный смыв (БАС) получали в результате промывания легких через трахею 10 мл физиологического раствора. Экспериментальные исследования проводились в соответствии с требованиями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются в исследовательских и других научных целях (Strasburg, 18.03.1986).
Исследуемые животные были разделены на 7 групп: I группа - контрольная, интакт-ные животные (n=12), II группа - ишемия 6 ч, без реперфузии (n=10), III группа - РС 24 ч, (n=15), IV группа - РС 24 ч, осложненный кровопотерей, без лечения, с внутрибрюшин-ным введением изотонического раствора NaCl из расчета 10 мл/кг (n=15), V группа - РС 24 ч,
осложненный кровопотерей с лечением путем введения корвитина внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг массы тела (n=15), VI группа - РС 24 ч, осложненный кровопотерей с лечением путем введения гордокса внутрибрюшинно в дозе 20000 КИЕД/кг (n=15), VII группа - РС 24 ч, осложненный кровопотерей с лечением путем сочетанного введения корвитина и гордокса внутрибрюшинно в указанных дозах (n=15). В эксперименте использовали ингибитор протеиназ гордокс (APROTININUM, «Gedeon Richter», Венгрия) и антиоксидант корвитин, являющийся водорастворимой формой бифла-воноида кверцетина (ЗАО НПЦ «Борщаговский химико-фармацевтический завод», г. Киев).
В сыворотке крови и БАС определяли показатели протеиназ-ингибиторной системы с использованием энзиматических методов [9], измерения проводили на спектрофотометре «Biomate 5» (Великобритания). Эласта-зоподобую активность (ЭПА) определяли по скорости ферментативного гидролиза синтетического субстрата N-т-бок-Ь-аланил-п-нитрофенилового эфира (BANFE) («Reanal», Венгрия), трипсиноподобную активность (ТПА) по скорости отщепления бензоил-аргинина от N-a-бензоил-Ь-аргинин-этилового эфира (BAEE) («Reanal»), антитриптическую активность (АТА) и кислотостабильные ингибиторы (КСИ) по торможению биологическим материалом ферментативного гидролиза трипсином («Spofa», Чехия) BAEE. Показатели протеиназ-ингибиторной системы БАС выражали в пересчете на 1 мг общего белка БАС. Концентрацию общего белка определяли по методу Лоури.
Все полученные результаты исследований подвергали статистической обработке методом вариационной статистики с выведением критерия достоверности Стьюдента, достоверными считали показатели при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Проведенные экспериментальные исследования показали, что моделирование ишемии нижних конечностей крыс сопровождалось увеличением протеолитической активности сыворотки крови. Было отмечено увеличение в сыворотке крови уровней ТПА на 29,7 % и ЭПА на 18,5 % по сравнению с контрольной группой. Данный рост происходил на уровне значительного снижения уровня КСИ сыворотки крови, которое было на 62,3 % ниже контрольных значений (Табл. 1).
При развитии РС и РС, осложненного кро-вопотерей, было выявлено увеличение ТПА сыворотки крови на 24,3 % и 32,8 % выше контроля соответственно, которое сопровождалось снижением уровня обоих ингибиторов
2017, т. 7, № 3
крымскии журнал экспериментальном и клиническои медицины
Таблица 1
Динамика изменений протеиназ-ингибиторной системы сыворотки крови при РС, осложненном кро-
вопотерей и при комбинированном лечении
Показатель ТПА Мк/Мл*мин. ЭПА МкМ/ мл*мин. АТА ИЕ/мл*мин. КСИ ИЕ/мл*мин.
серия
Контроль 0,37±0,05 2,48±0,15 39,3±2,5 11,4±0,14
Ишемия 6 часов 0,26±0,01* 2,02±0,19* 44,1±1,5 4,3±0,69*
Реперфузионный синдром 24 ч 0,46±0,02 1,43±0,11* 18,7±1,8* 3,5±0,19*
РС, осложненный кровопотерей, 24 ч 0,49±0,04* 0,89±0,05* 20,3±2,9* 4,9±0,27*
РС, осложненный кровопотерей, 24 ч +корвитин 0,34±0,04** 1,01±0,04* 30,6±1,6*,** 4,9±0,28*
РС, осложненный кровопотерей, 24 ч +гордокс 0,26±0,06** 0,89±0,15* 48,7±1,2*,** 6,9±0,22*,**
РС, осложненный кровопотерей, 24 ч+корвитин+гордокс 0,25±0,01*,** 0,94±0,07* 54,4±1,9*,** 7,1±1,3*,**
Примечания: звездочками показана достоверность различий (Р): * - по отношению к контролю (Р<0,05); ** - по отношению к группе с реперфузионным синдромом 24 ч, осложненным кровопо-терей, без лечения (Р<0,05).
протеиназ. Введение антиоксиданта, ингибитора протеиназ и сочетанное применение этих препаратов способствовало снижению ТПА ниже контрольных значений и нормализации уровней АТА и КСИ в сыворотке крови. Причем самые высокие уровни ингибиторов протеиназ сыворотки крови были зафиксированы при использовании ингибитора протеиназ и сочетанном применении этих препаратов.
При исследовании протеиназ-ингиби-торной системы БАС при ишемии было выявлено увеличение активности протеоли-тических ферментов: ТПА на 93,9 %, ЭПА на 31,8 % по сравнению с контрольными показателями. Также было выявлено снижение АТА на 36,6 % и незначительное увеличение уровня КСИ бронхоальвеолярных смывов по сравнению с контролем (Табл. 2).
Развитие РС и РС, осложненного кровопоте-рей, сопровождалось увеличением уровня про-теиназ и снижением уровней ингибиторов БАС. При этом отмечалось наиболее выраженное повышение ТПА - на 50,2 % - и снижение АТА на 41,8 %, КСИ на 73,6 % по сравнению с контролем при РС, осложненном кровопотерей. Использование антиоксиданта, ингибитора про-теиназ и сочетанное применение этих препаратов способствовало нормализации показателей ТПА, ЭПА и АТА. Патогенетическая коррекция способствовала увеличению уровня КСИ,
но содержание данного ингибитора осталось ниже нормы во всех трех группах с лечением.
Таким образом, в ходе проведенных исследований было выявлено, что при моделировании ишемии задних конечностей у крыс происходит снижение активности протеиназ в сыворотке крови и их увеличение в БАС. Данные показатели сопровождались увеличением уровней АТА в сыворотке крови и КСИ в брон-хоальвеолярном секрете. Можно предположить, что увеличение АТА в сыворотке крови при ишемии является защитной реакцией организма, направленной на ограничение проте-олиза. Об этом также может свидетельствовать увеличение активности КСИ в БАС, что, возможно, является одним из локальных механизмов защиты от протеолитического повреждения. Увеличение активности протеолитических ферментов и снижение ингибиторов протеиназ при РС и РС, осложненном кровопотерей, в сыворотке крови и БАС очевидно свидетельствует об истощении компенсаторных возможностей организма и может способствовать развитию ОРДС. Увеличение активности эластазо-подобных протеиназ в БАС на фоне снижения ингибиторного потенциала может приводить к повреждению эластиновых волокон соединительной ткани легких и её деструкции [5, 6].
Было установлено, что использование ингибиторов протеиназ и антиоксидантов в патоге-
Таблица 2
Динамика изменений протеиназ-ингибиторной системы БАС при РС, осложненном кровопотерей и
при комбинированном лечении
Показатель ТПА Мк/Мл*мин. ЭПА МкМ/ мл*мин. АТА ИЕ/мл*мин. КСИ ИЕ/мл*мин.
серия
Контроль 18,2±1,2 59,9±4,0 222,8±22,0 206,1±36,6
Ишемия 6 часов 35,3±3,5* 79,0±3,7* 141,1±29,5* 262,4±8,2
Реперфузионный синдром 24 ч 19,0±3,1 77,3±1,9* 155,4±12,4* 71,6±5,6*
РС, осложненный кровопотерей, 24 ч 27,3±0,8* 72,7±4,0* 129,7±16,4* 54,4±7,1*
РС, осложненный кровопотерей, 24 ч +корвитин 14,5±1,9** 59,9±3,0** 202,0±16,8** 55,9±8,5*
РС, осложненный кровопотерей ,24 ч +гордокс 15,5±1,08** 35,9±1,1*,** 232,9±20,6** 120,7±7,3*,**
РС, осложненный кровопотерей, 24 ч +корвитин+гордокс 10,4±1,2*,** 33,4±3,0*,** 242,9±18,8** 126,4±3,9*,**
Примечания: звездочками показана достоверность различий (Р): * - по отношению к контролю (Р<0,05); ** - по отношению к группе с реперфузионным синдромом 24 ч, осложненным кровопотерей, без лечения (Р<0,05).
нетической коррекции РС и РС, осложненного кровопотерей, приводит к снижению уровня протеиназ и увеличению уровня их ингибиторов как в сыворотке крови, так и в БАС. Причем наилучший эффект достигается при сочетан-ном использовании данных препаратов. Это, по-видимому, связано с тем, что ингибиторы протеиназ оказывают прямой эффект, способствуя снижению уровня эндогенных протеиназ и увеличению ингибиторного потенциала организма. В свою очередь антиоксидант кверцетин способствует защите ингибиторов протеиназ, активность которых снижается под действием активных форм кислорода. Также кверцетин оказывает ингибирующее действие на мембра-нотропные ферфенты, в том числе на 5-липо-оксигеназу, вызывая снижение синтеза лейко-триенов [8]. Таким образом, сочетанное применение ингибиторов протеиназ и антиоксидан-тов является патогенетически обоснованным методом коррекции РС, осложненного крово-потерей, а определение показателей протеиназ-ингибиторной системы может служить объективным критерием оценки состояния защитных систем организма, а также свидетельствовать об эффективности проводимого лечения.
ВЫВОДЫ
1. Моделирование ишемии задних конечностей у экспериментальных крыс сопровожда-
ется тенденцией к росту ингибиторов протеи-наз в сыворотке крови и в бронхоальвеоляр-ном смыве, что, возможно, связано с активацией компенсаторных механизмов организма.
2. Развитие реперфузионного синдрома и реперфузионного синдрома, осложненного кровопотерей, вызывает истощение компенсаторных механизмов, проявляющееся в активации протеолиза и снижении ингибиторного потенциала сыворотки крови и бронхоаль-веолярного смыва, что приводит к реализации деструктивного влияния протеолитиче-ских ферментов и развитию органопатологии.
3. Применение ингибиторов протеиназ и антиоксидантов для коррекции реперфузионн-ного синдрома, осложненного кровопотерей, способствует нормализации показателей про-теиназ-ингибиторной системы сыворотки крови и бронхоальвеолярного смыва крыс, причем наибольший эффект достигается при со-четанном применении указанных препаратов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Корейба К. А., Клюшкин И. В., Максимов А. В. Реперфузионный синдром при сосудистой реконструкции больных с синдромом диабетической стопы. Вестник современной клинической медицины. 2013; 6.(5): С. 67-70.
2. Маршалов Д. В., Петренко А. П., Глушач И. А. Реперфузионный синдром: понятие, определение,
2017, т. 7, № 3
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
классификация. Патология кровообращения и кардиохирургия. 2008; 3:67-72.
3. Алиханов Р Б., Кубышкин В. А. Патофизиологические аспекты реперфузионных повреждений печени. Кубанский научный медицинский вестник. 2013; 7: 170-172.
4. Харченко В. З., Кубышкин А. В., Фомочкина И. И. Молекулярные механизмы развития экстремальных состояний и их коррекция. Симферополь: Доля; 2011.
5. Шутов Ю. М., Щедрин А. С., Мезенцев Е. Н. Вариантная анатомия патогенеза компартмент-синдро-ма. Медицина и образование в Сибири. 2015; 1: 42-45.
6. Завалий А. А., Кубышкин А. В., Жукова А. А. Динамика показателей неспецифических протеиназ и их ингибиторов при лечении больных острым гнойным риносинуситом мукоактивными препаратами. Бюллетень сибирской медицины. 2017. 16 (1):27-35. Doi: 10.205 38/ 1682-0363-2017-1-27-35
7. Лаптева Е. А. Состояние системы протеолиза при хронической обструктивной болезни легких. Журнал Гродненского государственного медицинского университета. 2016; 3 (55): 90-93.
8. Жукова А. А., Харченко В. З., Кубышкин А. В. и др. Патогенетическое обоснование сочетанного применения ингибиторов протеиназ и антиоксидантов при осложненном реперфузионном синдроме. Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины. 2014; 4 (6): 18-21.
9. Гапонова Т. И., Кобеляцкий Ю. Ю., Панченко Г. В. Роль корвитина и латрена в профилактике и терапии реперфузионного синдрома при реконструктивных операциях у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей. Медицина неотложных состояний. 2015; 2 (65): 120-123.
10. Кубышкин А. В., Фомочкина И. И. Эластоли-тическая активность бронхоальвеолярного лаважа при моделировании воспалительного процесса в легких. Укр. б^м. журн. 2008; 80 (1): 89-95.
REFERENCES
1. Koreyba K A, Klyushkin IV, Maksimov A V et al Reperfusion syndrome at vascular reconstruction at
patients with the syndrome of diabetic foot The Bulletin of Contemporary Clinical Medicine 2013,6(5): 67-70. (In Russ).
2. Marshalov DV, Petrenko AP, Glushach IA. Reperfusion syndrome: notion, definition, classification Circulation Pathology and Cardiac Surgery 2008, 3:67-72 (In Russ)
3. Alikhanov RB, Kubyshkin VA. Pathophisiology aspects of reperfusion injury of liver Kubanskii nauchnyi meditsinskii vestnik, 2013,7:170-172 (In Russ)
4. Kharchenko VZ, Kubyshkin AV, Fomochkina I.I et al. Molecular mechanisms of development of extreme States and their correction. Simferopol, "Dolya"; 2011. (In Russ)
5. Shutov YM, Shchedrin AS, Mezentsev EN. Alternative anatomy of pathogenesis of compartment-syndrome Medicine and Education in Siberia, 2015, 1:4545. (In Russ)
6. Zavaliy АА., Kubyshkin AV, Zhukova AA Changes in non-specific proteases and their inhibitors in the course of acute rhinosinusitis treatment with mucoactive drugs Bulletin of Siberian Medicine, 2017; 16(1): 27-35. (In Russ). Doi: 10.205 38/ 1682-0363-2017-1-27-35
7. Lapteva EA State of proteolysis system in chronic obstructive pulmonary disease Journal of the Grodno State Medical University, 2016, 55:90-93. (In Russ)
8. Zhukova AA, Kharchenko VZ, Kubyshkin AV et al. Pathogenetic basis of the combined application of proteinase inhibitors and oxidants in complicated reperfusion injury Crimea Journal of Experimental and Clinical Medicine, 2014, 6:18-21. (In Russ).
9. Haponova TI, Kobeliatskyi Yu.Yu., Panchenko HV. Role of corvitin and latren in the prevention and treatment for reperfusion syndrome in reconstructive surgeries in patient with chronic lower ischemia Emergency medicine, 2015, 65:120-123. (In Russ).
10. Kubyshkin A.V., Fomochkina I.I Elastoliticheskaya aktivnost' bronkhoal'veolarnogo lavazha pri modelirovanii vospalitel'nogo protsessa v legkikh [Elastolytic activity of bronchoalveolar lavage in modeling of the inflammatory process in lungs]. Ucr. biokhim. zhurnal - Ucrainian Biochemical Journal, 2008; 80 (1): 89-95 (In Rus).
