CC BY
0
При л о ж ен и е 1
Материалы и методы. В исследование было включено 17 первичных больных ОМЛ группы промежуточного риска согласно ELN-2017, получавших терапию в ФГБУ «НМИЦ гематологии» МЗ РФ с 2017 по 2023 год. Медиана возраста составила 42,5 года (20 — 61), соотношение мужчин к женщинам составило 5:12 соответственно. В выборку были включены только больные с нормальным кариоти-пом, что было подтверждено стандартным цитогенетическим (20 метафаз) и FISH (200 метафаз) исследованиями, без мутаций-^Й^Т, СЕВРа и FLT3, а также с бластозом в костном мозге 40% и более. В качестве индукционной терапии почти всем больным был проведен курс по программе «7+3» (цитарабин 200 мг/м2 дни 1—7, дау-норубцин 60 мг/м2 дния 1—3), одному больному был проведен курс «азацитидин — венетоклакс» (азацидитн 75 мг/м2 дни 1—5, венеток-лакс 400 мг дни 1—28)учитывая возраст и сопутствующие патологии. В качестве исследуемой ДНК использовался материал, полученный при первичной диагностике из опухолевых клеток, в качестве контрольной — материал, полученный из санированного костного мозга (ремиссионный) или из буккального эпителия. Амплификация микросателлитов ДНК (short tandem repeat, STR) использовалась для поиска дополнительных аберраций. Исследуемые локусы были взяты из панели COrDIS PLUS diagnostic panel (ООО Гордиз, Россия),
которая включает маркеры к следующим 19 локусам: D1S1656, D2S441, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D10S1248, D12S391, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, D22S1045, CSF1PO, FGA, SE33,
ТН01, ТРОХ, VWA. Локусы STR были амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в соответствии с рекомендациями производителя COrDIS PLUS. Дальнейший фрагмент-ный анализ ПЦР-продуктов был выполнен на аппарате Нанофор-05 (ООО Синтол, Россия).
Результаты и обсуждение. Ремиссия после первого курса индукции была достигнутау 11 больных (64%), МРБ негативная толькоу 7 больных (41%). Разницы в STR профилях контрольной и опухолевой ДНК между двумя группами больных обнаружено не было.
Заключение. Высокая частота рефрактерности к первому курсу химиотерапии создает необходимость поиска молекулярных маркеров нестабильности генома. Одной из возможных причин такого течения заболевания может являться копийно-нейтральная потеря ге-терозиготности, которую не удалось выявить простым ЭТКанализом, но которая может быть обнаружена при помощи хромосомного микроматричного анализа (ХМА). Использование ХМА позволит более широко охарактеризовать молекулярный кариотип опухолевых клеток ОМЛ без четких генетических аномалий.
Бигильдеев А. Е., Карпенко Д. В., Цыганкова С. В., Булыгина Е. С., Королева Д. А., Звонков Е. Е. ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОДТИПА ЛИМФОМЫ ИЗ КЛЕТОК МАНТИИ
ФГБУ«НМИЦгематологии» Минздрава России
Введение. Основные подтипы лимфомы из клеток мантии (ЛКЖ): классический (сМ.СЬ) и лейкемический ненодальный (ппМСЬ). Для сМСЬ характерно агрессивное течение заболевания, В-симптомы и генерализованная лимфаденопатия. При ппМСЬ чаще наблюдается индолентное течение заболевания, поражение костного мозга (КМ.), лейкемизация и спленомегалия, незначительное увеличение размеров лимфатических узлов. Опухолевым субстратом сМСЬ служат В-клетки с неперестроенными генами ЮНУ^ и экспрессией 80X11, не прошедшие через герминативный центр фолликула лимфоузла. В ппМСЬ опухолевый субстрат состоит из В-клеток, прошедших герминативный центр лимфоузла, для которых характерны перестроенные гены ЮНУ и отсутствие экспрессии 80X11. Для определения варианта ЛКЖ используются клинико-лабораторные данные, им-муногистохимические и молекулярно-генетические исследования, включая модели, основанные на определении экспрессии десятков генов. Недавно было показано, что подтипы ЛКЖ можно определить, измерив степень метилирования трёх СрО (с^03А25785, с£07769421
и с§23892310) с помощью М08-секвенирования.
Цель работы. Цель работы: разработка эпигенетического подхода к определению подтипа ЛКЖ посредством анализа степени метилирования ограниченного числа СрО с помощью бисульфитной конверсии ДНК, ПЦР и секвенированием ПЦР-продуктов по Сэнгеру.
Материалы и методы. Для анализа были получены образцы периферической крови (ПК) (п= 39) и/или КЖ (п= 37), взятые в дебюте заболевания у пациентов с ЛКЖ (п=59), или биоптат лимфоузла (п=19). В качестве контроля были использованы клетки ПК пациентов с неопухолевыми заболеваниями системы крови (НЗСК) (п=3).
Из всех образцов ткани и клеток была выделена ДНК. 18 пациентов с ЛКЖ (ПК, п=11; КЖ, п=6; биоптат лимфоузла, я=1) и 3 пациента с НЗСК были выбраны в качестве пробной подгруппы. На ДНК этих пациентов проводили бисульфитную конверсию с последующей амплификациейучастков генома, содержащих СрО с§03425785, с§07769421 и с§23892310. Продукт ПЦР очищали и секвенирова-ли по Сэнгеру. Степень метилирования всех СрО, содержащихся в ПЦР-продукте, определяли по ранее разработанной методике (001: 10.1089/^па.2019.5310). Для классификации подтипов ЛКЖ использовали данные только Зуказанных выше СрО.
Результаты и обсуждение. Из 5 исследованных образцов ПК, в которых наблюдался лимфоцитоз, разработанный метод позволил верно определить подтип ЛКЖ в 80% (у 4-х), из них: по 2 случая С1 и С2 подтипов. В 2 образцах КЖ наблюдалось повышенное содержание лимфоцитов. В одном из них, где лимфоцитоз был наибольшим (76%), метод верно определил подтип ЛКЖ (С1). В единственном образце, где в качестве источника ДНК была биопсия лимфоузла, подтип ЛКЖ был определен верно (С1).
Заключение. Эпигенетический подход показал перспективность, но, как показал первый этап работы, нуждается в усовершенствовании. Для повышения точности метода представляется целесообразным выделять ДНК не из суммарной клеточной популяции ПК или КЖ, а из мононуклеарных клеток или из фракции В-лимфоцитов. Это позволит увеличить долю опухолевых клеток в образце и повысит точность метода. Кроме того, целесообразно рассмотреть возможность использования альтернативного набора СрО для классификации подтипов ЛКЖ.
Бигильдеев А. Е.1, Карпенко Д. В.1, Миронов Р. В.2
ВВЕДЕНИЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ АЛЬФА МЫШАМ ВОССТАНАВЛИВАЕТ ОБРАЗОВАНИЕ ОЧАГОВ ЭКТОПИЧЕСКОГО КРОВЕТВОРЕНИЯ, УТРАЧЕННОЕ В РЕЗУЛЬТАТЕ СЕРИЙНЫХ КРОВОПОТЕРЬ
1ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, 2МГУ им М.Е
Введение. Фактор некроза опухолей альфа (ТМЕ-а) — мульти-функциональный белок, одна из ключевых функций которого заключается в активации воспаления. Работы последних лет указывают на то, что иммунная система и стволовые клетки значительно регулируют друг друга. Ранее показано, что еще один ключевой игрок воспаления — интерлейкин-1(3 (ИЛ-1(3) — ростовой фактор мезен-химных клеток-предшественниц костного мозга. Его введение мышам приводило к формированию увеличенных очагов эктопического кроветворения под капсулой почки у мышей. Поскольку экспрессия
Ломоносова, биологический факультет, кафедра иммунологии
ИЛ-1(3 может увеличиваться в клетках различной природы под воздействием ТМЕ-а, мы предположили, что он также может влиять на размер очагов эктопического кроветворения.
Цель работы. Исследовать роль ТМЕ-а в формировании очагов эктопического кроветворения у мышей, т.е. оценить влияние ТМЕ-а на функцию мезенхимных стволовых клеток и их потомков 1п и'шо.
Материалы и методы. В работе использовали самок мышей-гибридов первого поколения Е1 (СБА х С57В1/6). В эксперименте было три группы: контрольная {п=4, введение фосфатно-солевого
| ГЕМАТОЛОГИЯ ИТРАНСФУЗИОЛОГИЯ | RUSSIAN JOURNAL OF НЕМАТОLOGY AND TRANSFUSIOLOGY (GEMATOLOGIYA I TRANSFUSIOLOGIYA) | 2024; ТОМ69; №2 |
буфера), группа «БСА» {n=4, введение бычьего сывороточного альбумина), группа «TNF» {n=4, введение человеческого рекомбинантного TNF-a). Человеческий TNF-a способен связываться с мышиными рецепторами TNF-a и может быть использован в модельных экспериментах. Каждый фактор вводили в дозе 5 мкг/ мышь. Инъекции производили однократно, вну-трибрюшинно, за 48 часов до посадки очагов эктопического кроветворения. У каждой мыши отбирали кровь из хвоста за сутки до, через 2 часа и 48 часов после введения факторов. Объем забранной крови варьировал от животного к животному и составлял 50—300 мкл. Очаги эктопического кроветворения получали стандартным способом, имплантируя костный мозг одного бедра мыши-донора под капсулу почки мыши реципиента. Одна мышь-реципиент из группы БСА пала в день посадки очагов от послеоперационных осложнений.
7,0
Ь.О
о
С
5,0
Ь
Е 4,0
т
5
о 3,0
С
с
X
5 2,0
1
1,0
0,0
Рисунок, очагов
ФСБ БСА Т№Р Размеры индивидуальных кроветворения в
экспериментальных группах. В группе, получавшей БСА, из шести удачно имплантированных
фрагментов костного мозга сформировался только один очаг, размер которого был настолько мал, что достоверно оценить его не представлялось возможным
Через 42 дня после имплантации костного мозга оценивали наличие очагаи его клеточность.
Результаты и обсуждение. В группах ФСБ и БСА (таблица) частота формирования очагов оказалась аномально низкой (25% и 16,7%, соответственно) и была существенно ниже частоты в группе TNF (62,5%). При введении мышам hTNFa наблюдалась тенденция к формированию очагов увеличенного размера по сравнению с контрольной группой мышей-реципиентов, которым вводили ФСБ (рисунок).
Заключение. TNF-a — ещё один фактор воспаления, вероятно опосредованно влияющий на функцию стромальных клеток-предшественниц костного мозга, в том числе ЖСК. Его предварительное введение мышам восстанавливает способность формировать такие очаги в организме мышей-реципиентов, которая без введения TNFa утрачивается или сильно снижается вследствие серийных заборов периферической крови.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-25-00459, bttPs://rscf.ru/Project/22-25-00459/
Таблица. Результаты анализа очагов эктопического кроветворения
Группа Очагов выросло/посажено Клеточностьочага, 10Аклеток
Контроль (ФСБ) 2/8 1,3
1,7
БСА 1/6 N/A
TNF 5/8 3,5
2,2
2,1
3,7
6,5
Бигильдеев А. Е., Карпенко Д. Б. МЕЗЕНХИМНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ КОСТНОГО МОЗГА И ВРОЖДЕННЫЙ ИММУНИТЕТ
ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России
Введение. Недавние исследования показали, что стволовые клетки регулируют не только адаптивное звено иммунной системы, но и врожденный иммунитет и являются участниками процесса инфицирования и избавления от инфекционных агентов. Примером могут служить мезенхимные стволовые клетки (ЖСК). Их значимость во взаимодействии с вирусами и в регуляции врожденного иммунитета длительное время недооценивалась, но появляется всё больше работ, в которых она признается.
Цель работы. Продемонстрировать роль мезенхимных стволо-вых/стромальных клеток во врожденном иммунитете.
Материалы и методы. Анализ научной литературы.
Результаты и обсуждение. Известно, что часть МСК 1п — это перициты, которые плотно контактируют с кровеносными сосудами, что делает ЖСК идеальными стражами на пути инфекции и одновременно мишенями для вирусов [1]. Показано, что ЖСК могут быть заражены различными представителями семейства Негры у1ги)ае, вирусом птичьего гриппа Н5М1, вирусом Зика и другими [2]. Эти резервуары сложно устранимы иммунной системой, поскольку показано, что ЖСК костного мозга обладают иммунными привилегиями [3], что может являться частью иммунотолерантного микроокружения костного мозга [4, 5]. Таким образом, инфицирование ЖСК может способствовать длительным эффектам, создающим инфекционные осложнения, такие как реактивация вирусову людей с ослабленным иммунитетом, в том числе у пациентов с онкогематологическими заболеваниями, проходящими курсы таргетной или полихимиотерапии, индукционную и/ или консолидирующую терапию в качестве предтрансплантационной подготовки перед аллогенной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК), а также находящихся в агранулоцитозе
после ауто- или алло-ТГСК. Особенно важноучитывать возможность инфекции ЖСК, если в качестве источника трансплантата используются не мобилизованные С034+ клетки, а костный мозг, а также в тех случаях, когда ЖСК, их потомки или их производные используются в целях профилактики реакции трансплантат против хозяина. Вместе с тем ЖСК играют важную роль в ответе на инфекцию. Показано, что экзосомы ЖСК из пуповины обладают выраженным противовирусным действием против вируса гепатита С. Они могут ингибиро-вать репликацию вируса путем транспорта противовирусных экзо-сомальных микроРНК, включая т1К-145, т1К-221, т1К-199а и 1 е"Ъ-7£ в клетки-мишени. Недавно было высказано предположение, что ЖСК обладают сильным антимикробным действием за счет экспрессии им-муномодулирующих факторов и секреции антимикробных пептидов и белков. Кроме того, есть сведения, что ЖСК обладают также противогрибковой активностью.
Литература
1. Ь«р8:/Л1о1.ог£/10.1007/978-3-030-11093-2
2. https://doi.org/10.3390/ijms23148038
3. https://doi.org/10.3389/fcell.2022.993056
4. https://doi.org/10.1038/s43018-021-00179-8
5. https://doi.Org/10.1016/j.stem.2018.01.017
Заключение. ЖСК костного мозга — активный участник врожденного иммунитета. Необходимо тестировать ЖСК на инфици-рованность вирусами перед их клиническим применением. ЖСК или их производные могут быть новой нестандартной терапевтической опцией при инфекциях различной природы.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-25-0459, https://rscf.ru/project/22-25-00459/
