CC BY
0
I ГЕМАТОЛОГИЯ ИТРАНСФУЗИОЛОГИЯ | RUSSIAN JOURNAL OF HEMATOLOGY AND TRANSFUSIOLOGY (GEMATOLOGIYA I TRANSFUSIOLOGIYA) | 2024; TOM69; №2 |
Карпенко Д. В., Бигильдеев А. Е.
ВОСПАЛЕНИЕ СТИМУЛИРУЕТ СТВОЛОВУЮ СИСТЕМУ В МОДЕЛИ ОЧАГОВ ЭКТОПИЧЕСКОГО КРОВЕТВОРЕНИЯ
ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России
Введение. Мезенхимные клетки (ЖК) являются компонентами различных тканей и органов млекопитающих. Стволовая система и ме-зенхимные стволовые клетки (ЖСК), в частности, отвечают за поддержание клеточного состава различных органов и тканей, и активируются при запросе на репарацию. Одной из моделей изучения стволовой системы и ЖК ¿n vivo является модель очагов эктопического кроветворения (ОЭК), формирующихся под капсулой почки мыши при имплантации фрагмента костного мозга. Ранее отмечалось, что в субле-тально облучённых реципиентах размер ОЭКувеличен. Аналогичный эффект наблюдается от системного введения ИЛ-ip.
Цель работы. Целью данной работы было проверить гипотезу о том, что системное воспаление может стимулировать рост кроветворной территории in vivo в модели ОЭК.
Материалы и методы. КЖ мышей-доноров трансплантировали под капсулу почки мыши-реципиента, как было описано ранее (10.3389/fcell.2022.993056). В качестве доноров были использованы нетрансгенные С57В1/6 мыши и трансгенные Nes-GFP (F1 от С57В1/6 х Nestin-GFP) мыши, для которых С57В1/6 является общей базовой линией. В качестве реципиентов были использованы мыши линии С57В1/6. Часть реципиентов была предварительно
иммунизирована в два этапа с использованием полного и неполного адъюванта Фрейнда, вместе с GFP или BSA или PBS. Через 42 дня после имплантации КЖ подсчитывали клеточность сформировавшихся очагов в камере Горяева.
Результаты и обсуждение. Были проанализированы данные по клеточности ОЭК в сериях экспериментов с иммунизацией (n=13 очагов) и без иммунизации (n=14 очагов). Иммунизация против GFP не приводила к уменьшению клеточности трансгенных ОЭК. Данные объединены в группы независимо от линии мыши-донора КЖ. В ОЭК, полученных в иммунизированных реципиентах, было отмеченоувеличение средней клеточности очага в2,3 раза (^=0,006).
Заключение. Мы выдвигаем предположение, что наблюдаемые ранееувеличения клеточности очагов под действием сублетального облучения и ИЛ1р, а также увеличение размера ОЭК в иммунизированных реципиентах могут иметь общий механизм, ассоциированный с системным воспалением. Стимуляция роста кроветворной территории под действием иммунизации ранее не демонстрировалась. Полученные результаты демонстрируют стимуляцию функции стволовой системы под действием воспалительного процесса на примере ОЭК.
Карпенко Д. В., Капранов Н. М., Бигильдеев А. Е.
ГИБРИДНЫЕ ОЧАГИ ЭКТОПИЧЕСКОГО КРОВЕТВОРЕНИЯ В НЕТРАНСГЕННЫХ МЫШАХ ЛИНИИ BIO ПОЗВОЛЯЮТ ВЫЖИВАНИЕ
КЛЕТОК, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХИММУНОГЕННЫЙ МАРКЕР GFP
ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России
Введение. Иммунные привилегии мезенхимных стволовых клеток (ЖСК) и других редких клеточных субпопуляций костного мозга (КЖ) у мышей были недавно продемонстрированы in vivo (10.3389/ fcell.2022.993056) с помощью модели очагов эктопического кроветворения. В этой модели КЖ трансгенных мышей-доноров Fl (С57В1/6 х Nestin-GFP) имплантировали под капсулу почки мышам-реципиентам нетрансгенной родительской линии С57В1/6 и показали формирование очагов и присутствие в них С045~0РР* ЖСК и CD45+GFP+ клеток через 42 дня после имплантации костного мозга. В описанной модели только малая доля клеток КЖ (0,10% ± 0,03%) экспрессирова-ла иммуногенный белок GFP. В линии мышей B10.GFP трансген экс-прессируется подуниверсальным промотором, что расширяет спектр клеточных популяций для исследования иммунных привилегий.
Цель работы. Расширить представления об иммунных привилегиях клеточных субпопуляций КЖ и возможности формирования очагов эктопического кроветворения мезенхимными клетками, несущими иммуногенный маркер.
Материалы и методы. В работе использовали мышей линий BIO и B10.GFP в возрасте 18—32 недель. Процедуру имплантации КМ под капсулу почки выполняли стандартно, как описано ранее (10.3389/fcell.2022.993056), с тем исключением, что перед имплантацией смешивали КМ 1 бедра BIO и B10.GFP (10 очагов в 5 реципиентах). Отрицательным контролем были очаги, полученные из 2 бёдер BIO в BIO реципиенте (4 очага в 2 реципиентах), а положительным контролем — полученные из 2 бёдер B10.GFP в B10.GFP реципиенте (4 очага в 2 реципиентах). Через 42 дня оценивали наличие очага
и подсчитывали его клеточность. Клетки КМ из бедер мыши-реципиента и клетки очагов окрашивали антителом к CD45 и анализировали содержание GFP+ клеток в CD45" и CD45+ субпопуляциях с помощью многоцветной проточной цитофлуориметрии (МПЦ).
Результаты и обсуждение. Гибридные очагиуспешно сформировались в 6/10 случаев, в группе положительного контроля сформировались 2/4 очагов, а в группе отрицательного контроля — 4/4. Не было выявлено статистически значимых отличий клеточности гибридных очагов (медиана 1,1 х 10б, диапазон 0,1—3,7 х 10б клеток в очаге) от контрольных сингенных очагов в BIO мышах (медиана 2,0 х 10б, диапазон 1,1—2,9 х 10б клеток в очаге). Пять очагов было использовано для оценки содержания GFP+ клеток с помощью МПЦ. CD45+GFP+ и CD45"GFP+ клетки наблюдали в 5/5 и 4/5 гибридных очагов, соответственно. В КМ всех мышей-реципиентов гибридных очагов наблюдали CD45+GFP+ клетки. Изучение клеток КМ от трансгенного донора показало наличие GFP" клеток.
Заключение. Мы показали возможность формирования гибридных очагов. В сформировавшихся очагах мы подтвердили наличие GFP+ клеток. Наличие GFP" клеток в KM B10.GFP не позволяет исключить возможность наличия таких трансгенных GFP" клеток в очаге и их вклада в формирование GFP+ популяции. Мы также отмечаем миграцию трансгенных клеток донора в КМ реципиента, где мы детектируем GFP+CD45+ клетки. Как итог, мы дополнили список моделей, в которых демонстрируются иммунные привилегии клеток в КМ. Представленные результаты создают основу для дальнейших исследований с использованием гибридной схемы посадки.
Карташова А. С., Февралева И. С., Кузьмина Е. А., Бидерман Б. В., Степанова Е.А., Большаков И. В., Челышева Е. Ю.,
Туркина А. Г., Судариков А. Б.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МУТАЦИЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ТЕРАПИИ ИНГИБИТОРАМИ ТИРОЗИНКИНАЗ В ХИМЕРНОМ ГЕНЕ BCR::ABLI ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ МИЕЛОЛЕЙКОЗЕ МЕТОДОМ АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России Введение. Основная причина развития резистентности к терапии дальнейшей терапии. Чаще всего у больных ХМЛ резистентных ингибиторами тирозинкиназ (ИТК) у больных хроническим миело- к иматинибу встречаются мутации BCR::ABL1 Е255К (11—21%), F359V лейкозом (ХМЛ) — возникновение мутаций в домене ABL химер- (11%), M244V (10%), при которых эффективны ИТК 2 поколения, ного гена BCR::ABL1. Наличие некоторых мутаций влияет на выбор Значительную проблему составляет «панрезистентная» мутация
При л о ж ен и е 1
Т3151 (7—15%), при которой иматиниб и ИТК 2 поколения не эффективны, и целесообразно назначение ИТК третьего поколения (пона-тиниба или асциминиба). В качестве метода для чувствительного, специфичного и быстрого определения клинически значимых мутаций мы предлагаем использовать полимеразную цепную реакцию в реальном времени с аллель-специфичными праймерами (АС-ПЦР).
Цель работы. Подобрать и синтезировать аллель-специфичные праймеры и флюоресцентные зонды для выявления мутаций Т3151, Е255К, ¥359У, М244У гена ВСК::АВЬ1 методом АС-ПЦР. Результаты сравнить с данными, полученными методом высокопроизводительного секвенирования (ВПС)
Материалы и методы. Аллель-специфичные праймеры и флюоресцентные зонды для поиска мутаций Т3151г Е255КГ Р359УГ М244У были подобраны авторами и синтезированы в компании «Синтол» (Россия). В исследование включены 15 образцов ДНК больных ХМЛ на разных этапах терапии ИТК, проходивших обследование и лечение на базе ФГБУ «НМИЦ гематологии« МЗ РФ 2020 по 2023 г. Мониторинг химерного транскрипта ВСК::АВЫ у больных ХМЛ про -водили с помощью набора «АмплиСенс Лейкоз Квант М-Бсг-ЕИТ» (Интерлабсервис, Россия).
Результаты и обсуждение. 15 образцов ДНК, выделенной из образцов периферической крови пациентов с резистентностью к ИТК,
были проанализированы методом АС-ПЦР на вышеназванные мутации. Уровень транскрипта ВСК::АВЫ на момент анализа составлял от 2,18% до 87,70%. Мутация Т3151 была выявлена в 8 образцах из 15, Е255К в 1 образце, Р359У в 2 образцах, М244У в 1 образце. В 5 образцах мутаций выявлено не было. При этом у двух пациентов были выявлены сочетанные мутации: у одного и а у второго
Т3151, Р359Уи Е255К. Все 15 образцов ДНК были исследованы методом ВПС для выявления мутаций в тирозинкиназном домене химерного гена ВСК::АВЫ. Мутация Т3151 была выявлена в тех же 8 образцах, что и при анализе с помощью АС-ПЦР, мутация Р255К в 2 образцах, РЗЗУУ в 2 из 15 образцах, М244Ув 1. Сравнение результатов, полученных двумя методами, показывает их полную идентичность, за исключением того, что в одном образце ДНК больного, в котором методом ВПС была выявлена мутация Е255К, методом АС-ПЦР она не была обнаружена. Это разногласие требует дополнительной проверки.
Заключение. Сравнение результатов, полученных методами АС-ПЦР с разработанными нами праймерами и ВПС для выявления мутаций Т3151г Е255КГ Р359УГ М244УГ показало их практически полную идентичность. Однако, метод АС-ПЦР для ДНК быстрее, проще в постановке и дешевле, чем ВПС. Также его можно использовать при анализе архивных материалов, оценки ответа на терапию и раннего прогнозирования резистентности к ИТК.
Каххарова Н. X.
ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА His 166Arg В ГЕНЕ FCG&A ПРИ МИЕЛОМНОЙ НЕЙРОПАТИИ
РСНПМЦ гематологии, Ташкент, Узбекистан
Введение. FCGR2A (CD32) входит в группу рецепторов для Fc-конца иммуноглобулинов класса G. Данный рецептор локализован на моноцитах, гранулоцитах, эозинофилах, макрофагах и В-лимфоцитах. CD32 обладает невысокой аффинностью и способен связывать только агрегированные IgG. Как правило, взаимодействие иммуноглобулинов с соответствующими рецепторами приводит к перераспределению последних на поверхности клетки и поглощению комплекса клеткой.
Цель работы. Изучение полиморфизм His 166Arg в гене FCGR2A при миеломном нейропатии.
Материалы и методы. Работа выполнена при РСНПМЦ гематологии в клинических отделениях. Ообследованы 94 пациента с достоверно установленным диагнозом множественная миелома в возрасте от 24 до 79 лет, из них 47 женщины (50%) и 47 мужчины (50%). Наибольшее количество больных составляли женщины в возрасте свыше 60 лет (39,4%). Полимофризм генов определяли по стандартной методике, выделение ДНК из ядер лимфоцитов, концентрация и чистота ДНК оценивалась при измерении оптической плотности при длине волны 260 и 280 нм против ТЕ, Амплификацию проводили на программируемом термоциклере фирмы "AppliedBiosystems",
при следующих условиях: предварительная денатурация — 940 °С (4 мин), 33 циклов амплификации: 940 °С (45 сек) — денатурация, 580 °С (45 сек) — отжиг праймеров, 720 °С (45 сек) — элонгация, и заключительный синтез 720 °С (3 мин). Статистическая обработка полученных данных по генотипированию полиморфныхучастков цито-кинов проводили с помощью пакет прикладных программ «OpenEpi 2009, Version 2.3» и компьютерной программы для анализа генетических данных "GenePop". Оценка отклонения распределений генотипов изученных полиморфизмов ДНК от канонического распределения Харди — Вайнберга проводилась с помощью компьютерной программы для анализа генетических данных "GenePop".
Результаты и обсуждение. Аллели и генотипы в основной и в контрольной группе распределялись относительно одинаковы, Н аллель в основной группе 61,2% а в контрольной группе 77,2%, А аллель 38,8% в основной и в контрольной группе 22,8% случаев. Статистические данные показали отношение шансов было равно 2,2, а доверительный интервал был равен 1,37—3,38, ^=0,01, эти результаты говорят, что А аллельувеличили шансы развития нейропатии в 2 раза.
Заключение. Данная мутация имеет высокие шансы развития миеломной нейропатии.
Каюмов А. А., Ачилова О. У.
АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ МОБИЛИЗАЦИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У ПАЦИЕНТОВ С МИЕЛОМНОЙ
БОЛЕЗНЬЮ И ЛИМФОМОЙ В УЗБЕКИСТАНЕ
РСНПМЦ гематологии, Ташкент, Узбекистан
Введение. В Узбекистане, как и во многих странах мира, развивается трансплантация костного мозга. Эта процедура дает возможность достичь длительной ремиссии пациентам в потенциально неизлечимых случаях, таких как миеломная болезнь и злокачественные лимфомы. Однако нередко неудачи в мобилизации стволовых клеток костного мозга могут ограничить применение данного метода терапии.
Цель работы. Определить частоту неудач, хороший результатов и предрасполагающих к неудаче факторов в мобилизации стволовых клеток (СБ34+) при миеломной болезни и лимфомах в Узбекистане.
Материалы и методы. Проанализированы результаты анализов 45 взрослых пациентов (11 с лимфомой и 34 с ММ) ретроспективно. Все пациенты получали О-СЭЕ, как традиционный режим мобилизации. Подсчет СБ34+ проводился методом цитофлуометрии.
Результаты и обсуждение. В исследовании у 10 пациентов с ММ и бти с лимфомой была отмечена плохая мобилизация. СБ34+ се11/рЬ составляла не более 8, позднее 5-го дня мобилизации. А к 7-му дня вовсе составляли не более 6 се11/рЬ. Исследование показало, что недостаточное количество С034 + менне 20се11/рЬ на 6-й день является предиктором плохой мобилизации стволовых клеток и требует применения Плериксофора. При этому 2 пациентов несмотря на низкий уровень С034+ проведены сеансы афе-реза. В первом случае СИ34+ составили 12 сеП/рЬ и за 2 сеанса собрано 2,99х10б СИ34+ клеток/кг. Во втором случае СИ34+ составили 11 се11/рЬ и за 2 сеанса не было собрано целевых 2,0х10б СБ34 +клеток/кг. У остальных 29 пациентов (24 с ММ и 5 с лимфомой) мобилизация и сбор были удачными. В среднем С034+ на 5-й день составил более 35±5се11/рЬ, а количество собранных С034+
