CC BY
24Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 23 (62). 2010. № 2. С. 157-162.
УДК 582.736.3: 546.23
ВЛИЯНИЕ СЕЛЕНА НА РОСТОВЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ASTRAGALUS DASYANTHUS (PALL.) В КУЛЬТУРЕ IN VITRO
Тайкова В.П., Теплицкая Л.М.
Таврический национальный университет им. В. И. Вернадского, Симферополь, Украина
E-mail: [email protected]
Приведены данные о влиянии различных концентраций селенита натрия на ростовые показатели травянистого многолетника Astragalus dasyanthus. Показано, что в диапазоне концентраций 5-15 мг Se (1У)/л индекс роста в культуре клеток астрагала шерстистоцветкового уменьшался по отношению к контролю, а концентрация 15 мг/л вызывала максимальное снижение ростовой активности. Ключевые слова: астрагал шерстистоцветковый, культура клеток, индекс роста, селен.
ВВЕДЕНИЕ
В последние десятилетия в медицине и фармакологии существенно возросло использование лекарственных препаратов, получаемых из растительного сырья. Большая часть растений, необходимых для переработки, произрастает в природных фитоценозах. Увеличение сбора лекарственных растений из дикой природы приводит к истощению их запасов и практически полному уничтожению [1, 2]. В этой связи особенно актуальным является поиск альтернативных источников лекарственного сырья. Перспективным подходом к получению сырья является выращивание in vitro клеточных культур лекарственных растений, накапливающих биологически активные вещества вторичного метаболизма и концентрирующих определенные микроэлементы. Использование клеточной биомассы позволяет не только получать экологически чистое сырье, но и сохранять имеющийся генофонд лекарственных растений.
Астрагал шерстистоцветковый (Astragalus dasyanthus Pall.) - ценное лекарственное растение. Ранее этот вид был широко распространен в степных и лесостепных районах Украины. Однако в настоящее время ареал его стал разорванным, фрагментарным. С 1980 года астрагал шерстистоцветковый занесен в Красную книгу Украины [3, 4]. В растениях обнаружены тритерпеновые гликозиды, флавоноиды, полисахариды, дубильные вещества, аминокислоты, витамины, макро-и микроэлементы. Важной особенностью этого вида растений, так же как и других видов рода Astragalus, является способность избирательно накапливать органически связанный селен (Se). Селен представляет собой физиологически активный микроэлемент, незаменимый в питании человека и животных. Спектр действия Se в организме достаточно широк. Он выполняет каталитическую, антиоксидантную, структурную и регуляторную функции, взаимодействует с витаминами,
ферментами, биологическими мембранами, участвует в окислительно-восстановительных процессах, обмене веществ. Селен регулирует работу иммунной системы. Установлено, что с дефицитом Se в организме связаны различные заболевания. В связи с этим большое значение приобретает получение и накопление растительной биомассы как источника ценных вторичных метаболитов и Se [5, 6].
Целью настоящей работы являлось исследование ростовых характеристик и морфологических особенностей пересадочных клеточных культур в зависимости от содержания различных концентраций селена в искусственных питательных средах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследования служили длительно пассируемые каллусные культуры астрагала шерстистоцветкового. При выполнении экспериментальной работы использовали методы, общепринятые в исследованиях по культуре изолированных тканей растений [7]. Клеточные культуры II пассажа выращивали до стационарной фазы роста на модифицированных агаризованных питательных средах: Гамборга и Эвелега (B5), дополненной 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4-Д) - 2,0 мг/л и 6-бензиламинопурином (6-БАП) - 0,5 мг/л, а также на среде Мурасиге и Скуга (MS), дополненной 2,4-Д - 2,0 мг/л, 6-БАП - 0,5 мг/л и кинетином - 0,5 мг/л (табл. 1). Кроме того, питательные среды содержали Se(IV) в концентрациях 5, 10 и 15 мг/л. Источником Se(IV) в питательных средах служил селенит натрия (Na2SeO3). Каллус культивировали в условиях термостатированного помещения (25°С) при относительной влажности воздуха 65 - 70 %, освещенности 2-3 тыс. люкс и 16-часовом фотопериоде [8].
Индекс роста (отношение среднего объема каллусной культуры к исходному объему каллуса на 63-и сутки культивирования) определяли морфометрическим методом. Морфологию клеточной культуры астрагала шерстистоцветкового оценивали визуально. Результаты исследований были обработаны статистически с помощью программы Microsoft Office Excel 2003.
Таблица 1.
Состав модифицированных питательных сред Гамборга и Эвелега и Мурасиге
и Скуга
Компоненты Концентрация
Среда Гамборга и Эвелега Мурасиге и Скуга
1 2 3
Макроэлементы, мг/л
KNO3 2500 1900
NH4NO3 - 1650
MgSO4-7H2O 250 370
CaCl2-2H2O 150 440
(NH4)2SO4 134 -
NaH2PO4 150 -
KH2PO4 - 170
FeSO4-7H2O 27,8 27,8
Na EDTA-2H2O 37,8 37,8
Продолжение таблицы 1.
1 2 3
Микроэлементы, мг/л
KJ 0,75 0,75
H3BO3 3,0 6,2
MnSO4-4H2O 10,0 22,3
ZnSO4-7H2O 2,0 8,6
NaMoO4-2H2O 0,25 0,25
CuSO4-5H2O 0,025 0,025
CoCl2-6H2O 0,025 0,025
Органические добавки, мг/л
Мезоинозит 100 100
Витамин РР 1,0 0,5
Витамин В6 1,0 0,5
Витамин В1 10,0 0,1
Глицин - 2,0
Сахароза 20000 20000
Аскорбиновая кислота 5,0 5,0
Фитогормоны, мг/л
2,4-Д 2,0 2,0
6-БАП 0,5 0,5
кинетин - 0,5
рН 5,5 - 5,8 5,5 - 5,8
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Культивирование каллусных культур астрагала in vitro позволило выявить закономерности роста в зависимости от внесения в питательную среду различных концентраций селена.
Несмотря на достаточно высокие концентрации селена в питательной среде, ни в одном из вариантов опыта не было зарегистрировано прекращение роста культуры [9]. В обоих вариантах питательных сред наблюдалось снижение индекса роста каллусной культуры по мере увеличения концентрации селена в среде.
В первом варианте питательной среды Гамборга и Эвелега В5 (I), содержащей Se в концентрации 5,0 мг/л индекс роста каллусной культуры снижался до 3,4 по сравнению с контрольным вариантом (5,2). Второй вариант среды В5 (II) содержал Se в концентрации 10,0 мг/л, что также приводило к достоверному снижению ростового индекса до 2,7 по сравнению с контролем. В третьем варианте питательной среды В5 (III), концентрация Se 15,0 мг/л приводила к наибольшему уменьшению ростовой активности каллуса до 1,2 по сравнению с контрольным вариантом (табл. 2).
Таблица 2.
Зависимость индекса роста Astragalus dasyanthus в вариантах модифицированной среды Гамборга и Эвелега (В5) от концентрации Se в среде
Вариант опыта Концентрация Se в питательной среде, мг/л Индекс роста
В5 (контроль) - 5,2 ± 1,0
В5 (I) 5,0 3,4 ± 0,9
В5 (II) 10,0 2,7 ± 0,5
В5 (III) 15,0 1,2 ± 0,3
Аналогичная зависимость индекса роста от концентрации 8е в питательной среде наблюдалась в опытных вариантах на среде Мурасиге и Скуга. В варианте питательной среды Мурасиге и Скуга М8 (I), содержащей 8е в концентрации 5,0 мг/л индекс роста каллусной культуры снижался до 4,2 по сравнению с контрольным вариантом (6,0). Второй вариант среды М8 (II) содержал 8е в концентрации 10,0 мг/л, что приводило к достоверному снижению ростового индекса до 3,6 по сравнению с контролем. В третьем варианте питательной среды М8 (III), концентрация 8е 15,0 мг/л максимально ингибировала ростовую активность каллуса до 1,5 по сравнению с контролем (табл. 3).
Таблица 3.
Зависимость индекса роста Astragalus dasyanthus в вариантах модифицированной среды Мурасиге и Скуга (MS) от концентрации Se в среде
Вариант опыта Концентрация Se в питательной среде, мг/л Индекс роста
MS (контроль) - 6,0 ± 0,4
MS (I) 5,0 4,2 ± 0,7
MS (II) 10,0 3,6 ± 0,9
MS (III) 15,0 1,5 ± 0,2
Анализируя полученные результаты, следует отметить, что в диапазоне концентраций 5-15 мг 8е (ГУ)/л индекс роста в культуре клеток астрагала шерстистоцветкового достоверно снижался по отношению к контролю, а селен в концентрации 15 мг/л оказывал максимальное тормозящее воздействие на рост культуры клеток астрагала. Таким образом, культура клеток астрагала шерстистоцветкового способна переносить высокие концентрации селенита натрия без ущерба для своей жизнедеятельности.
В ходе выполнения работы был проведен морфологический анализ каллуса астрагала, культивируемого на различных вариантах искусственной питательной среды Мурасиге и Скуга, дополненной 2,4-Д - 2,0 мг/л; 6-БАП - 0,5 мг/л; кинетином - 0,5 мг/л и содержащей 8е в концентрациях 5, 10 и 15 мг/л [8]. Анализ показал, что каллусная культура во всех вариантах питательной среды
характеризовалась рыхлой консистенцией, умеренной оводненностью, ее цвет в процессе роста изменялся от светло-зеленого до светло-коричневого (рис. 1-4).
Рис.2
ipiff
Рис. 2. Внешний вид каллусной культуры Astragalus dasyanthus на среде Мурасиге и Скуга, Se - 5,0 мг/л.
IllllUfl
Рис. 4. Внешний вид каллусной культуры Astragalus dasyanthus на среде Мурасиге и Скуга, Se - 15 мг/л
ВЫВОДЫ
1. Изучена зависимость изменения величины индекса роста от содержания различных концентраций селена в питательных средах Гамборга и Эвелега и Мурасиге и Скуга. Показано, что в диапазоне концентраций 5-15 мг Se (ГУ)/л индекс роста в культуре клеток астрагала шерстистоцветкового достоверно уменьшался по отношению к контролю, а концентрация 15 мг/л вызывала максимальное снижение ростовой активности.
2. Проведен морфологический анализ и дана характеристика каллусных культур астрагала в процессе их роста. Показано, что основные морфологические параметры культуры не зависят от концентрации селена в питательной среде.
Рис. 1. Внешний вид каллусной культуры Astragalus dasyanthus на среде Мурасиге и Скуга без Se.
Рис.3
Рис. 3. Внешний вид каллусной культуры Astragalus dasyanthus на среде Мурасиге и Скуга, Se - 10 мг/л
Список литературы
1. Шаин С.С. Биорегуляция продуктивности растений / Шаин С.С. - М.: «ОВЕРЛЕЙ», 2005. - 228 с.
2. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения / Р.Г. Бутенко // Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986. С. 3-20.
3. Заверуха Б.В. Охраняемые растения Украины / Заверуха Б.В., Андриенко Т.Л., Протопопова В.В. -Киев: Наукова думка, 1983. - 176 с.
4. Определитель высших растений Украины / [Доброчаева Д.Н., Котов М.И., Прокудин Ю.Н. и др.] -Киев: Наукова думка, 1987. - 548 с.
5. Печенникова Е.В. О биологическом значении микроэлементов / Е.В. Печенникова, В.В. Вашкова, Е.А. Можаев // Гигиена и санитария. - 1997. - № 4. - С. 41-43.
6. Микроэлемент селен: роль в процессах жизнедеятельности / И. В. Гмошинский, В. К. Мазо, В. А. Тутельян [и др.] // Экология моря. - 2000. - 54. - С. 5-19.
7. Калинин Ф. Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений / Калинин Ф. Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. - К.: Наук. думка, 1980. - 488 с.
8. Высоцкий В.А. Клональное микроразмножение растений / В.А. Высоцкий // Культура клеток растений и биотехнология - М.: Наука, 1986. - С. 34-36.
9. Влияние селена на рост микроводоросли Spirulina platensis (Nords.) в накопительной и квазинепрерывной культурах / Г.С. Минюк, Р.П. Тренкеншу, А.В. Алисиевич [и др.] // Экология моря. - 2000. - 54. - С. 42-49.
Тайкова В.П. Вплив селену на pocTOBi характеристики Astragalus dasyanthus (Pall.) в культурi in vitro / В.П. Тайкова, Л.М. Теплицька // Вчеш записки Тавршського нацюнального ушверситету ш. В.1. Вернадського. Сер1я „Бюлопя, хiмiя". - 2010. - Т. 23 (62). - № 2. - С. 157-162. Наведено дат про вплив рiзних концентрацш селешту натрта на ростовi показники трав'янистого багатолгтника Astragalus dasyanthus. Показано, що в дiапазонi концентрацш 5-15 мг Se (IV) / л шдекс зростання в культурi клгтин астрагала шерстистоквгткового знижувався по вщношенню до контролю, а концентрац1я 15 мг / л викликала максимальне зменшення ростово! активносп. KnwHoei слова: астрагал шерстистоквгтковий, культура клгтин, шдекс зростання, селен.
Taikova V. Effect of selenium on the growth characteristics of Astragalus dasyanthus (Pall.) in culture in vitro / V. Taikova, L. Teplitskaya // Scientific Notes of Taurida V.Vernadsky National University. -Series: Biology, chemistry. - 2010. - V.23 (62). - № 2. - Р. 157-162.
The data on the effect of different concentrations of sodium selenite on growth rates herbaceous perennials Astragalus dasyanthus are listed here. It is shown that in the range of 5-15 mg Se (IV) / l index of growth in cultured cells of Astragalus dasyanthus decreased relative to control, and the concentration of 15 mg / l caused maximum decrease of growth activity.
Keywords: Astragalus dasyanthus, cell culture, growth index, selenium.
Поступила в редакцию 19.04.2010 г.
