CC BY
164
DOI: 10.24411/2074-5036-2019-10027 УДК 574.577
Ключевые слова: ашваганда, астрагал, каллусные культуры, микроклоны, биологическая активность, цитотоксич-ность, фунгицидная активность
Key words: callus cultures, microclones, biological activity, cytotoxicity, fungicidal activity Astragalus Dasyanthus Pall, Withania somnifera L.
Калашникова Е.А.1, Киракосян Р.Н.1, Зайцева С.М.2
ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ И ФУНГИЦИДНАЯ АКТИВНОСТЬ ЭКСТРАКТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ РАСТЕНИЙ АШВАГАНДЫ И АСТРАГАЛА В УСЛОВИЯХ IN VITRO
CYTOTOXICITY AND FUNGICIDAL ACTIVITY OF EXTRACTS OBTAINED FROM PLANTS OF ASHWAGANDA AND ASTRAGALUS IN VITRO
Российский Государственный аграрный университет МСХА имени К.А. Тимирязева Адрес: 127550 Российская Федерация, г. Москва, ул. Тимирязевская, дом 49 Russian State agrarian university-MTAA named after K. A. Timiryazev Address: 127550 Russian Federation Moscow, Timiryazevskaya street, 49 2Московская Государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии МВА имени К.И. Скрябина Адрес: 109472, Российская Федерация, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23 Moscow state academy of veterinary medicine and biotechnology named after K. I. Skryabin Address: 109472, Russian Federation, Moscow, Akademika Skryabina street, d. 23
Калашникова Елена Анатольевна д.б.н. профессор. E-mail: Kalash0407@mail.ru Kalashnikova Elena Anatol'evna. Doctor in Biological Sciences, Professor. E-mail: Kalash0407@mail.ru
Киракосян Рима Нориковна, к.б.н., доцент. E-mail: Mia4129@mail.ru Kirakosyan Rima Norikovna. Associate Professor, PhD. In Biological Science. E-mail Mia4129@mail.ru Зайцева Светлана Михайловна к.б.н., доцент. E-mail: Smzaytseva@yandex.ru Zaytseva Svetlana Mikhailovna, Associate Professor, PhD. In Biological Science. E-mail: Smzaytseva@yandex.ru
Аннотация. При изучении микроклонов и каллусной ткани лекарственных растений выяснили, что в условиях in vitro сохраняются фунгицидная активность и цитотоксичность, присущая интактным растениям. Растительные экстракты, полученные из микроклонов растений Astragalus Dasyanthus Pall, Withania somnifera L., оказывали более высокое ци-тотоксическое действие на раковые клетки человека, чем экстракты, полученные из каллусной ткани. Фунгицидная активность экстративных веществ микроклонов также была выше, чем каллусных культур.
Summary. In the study of microclones and callus tissue of medicinal plants it was found that fungicidal activity and cytotoxicity inherent in intact plants is preserved in vitro. Plant extracts obtained from microclones of plants Astragalus Dasyanthus Pall, Withania somnifera L. have a higher cytotoxic effect on human cancer cells than extracts obtained from callus tissue. The fungicidal activity of extractive substances of microclones was also higher than that of callus cultures.
Введение
Благодаря физиолого-биохимическим особенностям растительного метаболизма, где помимо реакций первичного обмена, синтезируются разнообразные вещества вторичного происхождения, обладающие высокой биологической активностью, целебные свойства растений широко используются в фитотерапии. Растения образуют чрезвычайно разнообразный спектр вторичных веществ, обуславливающих обширное терапевтическое действие их экстрактивных веществ. В фитофармакогнозии - одной из основных фармацевтических наук, изучающей растительное сырье для научной меди-
цины, в том числе и ветеринарной, известны гепатопротекторные, нейрорегуляторные, капиляроукрепляющие, желчегонные и противоопухолевые и многие другие свойства растительного сырья [1].
Как правило наиболее ценные для фито-фармакогнозии растения характеризуются ограниченным ареалом и специфическими условиями произрастания и отнесены к малочисленным исчезающим видам. В связи с этим, одним из перспективных направлений биотехнологии является сохранение биоразнообразия редких, лекарственных, а также исчезающих форм растений и создание на их основе генетических банков
57
in vitro. Успешно решить эту задачу позволяет применение метода клонального микроразмножения, благодаря которому в кратчайшие сроки возможно получить большое количество растений-регенератов генетически идентичных исходному виду при ограниченных ресурсах исходного материала. Кроме того, растительные культуры in virto используются в биотехнологии не только в качестве модельного объекта, но в качестве источника ценных биологически активных веществ, которые успешно применяются в фармацевтической промышленности, а также для изучения вторичного метаболизма [5].
Перспективными объектами для изучения вторичного метаболизма, в том числе и в строго контролируемых условиях in vitro, являются такие растения, как астрагал (Astragalus Dasyanthus Pall.) и ашваганда (Withania somnifera L.). Особенности их вторичного метаболизма и способность к образованию богатого спектра веществ, в том числе и фенольной природы, обуславливает широкое терапевтическое действие экстрактивных веществ указанных растений [4]. Астрагал содержит флаваноиды, кумарины, тритерпеноидные сапонины, полисахариды и микроэлементы. На его основе получают настои для лечения начальных форм гипертонической болезни, недостаточности кровообращения и острых гламеруонефритов, отмечено фунгицидное действие. Растения ашваганды на протяжении нескольких тысячелетий применяют в народной медицине при лечении заболеваний, вызванных оксидативным стрессом. Ашваганда также известна под несколькими другими названиями, такими, как индийский женьшень и зимняя вишня. В аювердической медицине растения ашваганды считаются одной из самых ценных и основополагающих культур, обладающих иммуномодулирующими, регенеративными и омолаживающими свойствами. Это обусловлено тем, что во всех частях растения (листьях, коре, плодах, семенах, и в большей степени в корне) синтезируются разнообразные вещества вторичного метаболизма - полифенолы и их гликозиды, сапонины, стероидные лактоны, олигосахариды, витанолид, а также свобод-
58
ный витаферин А (агликон), обладающий цитотоксическим действием [8].
Помимо описанных выше терапевтических действий, с давних времен эти растения известны в ветеринарии как весьма ядовитые растения для пасущихся животных, которые способны причинить значительный экономический ущерб и от непосредственной гибели животных. Зачастую у животных отмечается пристрастие к астрагалу. Они с большим удовольствием поедают астрагал, выискивая его в травостое, несмотря на патологические последствия и высокую смертность вследствие отравления. Животные, отравившиеся астрагалом, становятся апатичными, вялыми с прогрессирующей общей слабостью, наблюдается угнетение дыхания, потеря голоса, кашель, скрежет зубами и затруднение проглатывания корма.
Токсикология ядовитых растений тесно связана с биологическими науками - ботаникой, физиологией и биохимией растений, а также ветеринарными дисциплинами, прежде всего, с кормопроизводством и кормлением сельскохозяйственных животных.
Таким образом, изучение вторичного метаболизма растений имеет важное значение не только для фитофармакогнозии, но и для токсикологии с целью обеспечения эффективного и безопасного кормопроизводства. Кроме того, вторичные метаболиты растений оказывают непосредственное влияние на успешность проведения исследований на культуре in virto. Такие культуры в дальнейшем могут быть использованы для воспроизводства растений-регенератов генетически идентичных исходному виду, а также служить источником уникальных биологически активных веществ для фармацевтической промышленности [6]. Однако данных об образовании соединений, обладающих фунги-цидными и цитотоксическими свойствами в интактных растениях и в культурах in vitro, не много.
В связи с тем, что в литературе практически отсутствуют данные об образовании вторичных веществ в микроклонах лекарственных растений Astragalus Dasyanthus Pall и Withania somnifera L., то целью нашего исследования являлось изучение морфоге-
нетического потенциала данных растений и установление биологической активности их экстрактов in vitro, в качестве потенциальных источников высокоэффективных лекарственных препаратов, применяемых и для ветеринарной медицины.
Методы и материалы
Материалом для работы служили растения астрагала (Astragalus Dasyanthus Pall) и ашваганды (Withania somnifera L.) произрастающих в природных условиях и на территории Главного ботанического сада РАН (Москва). В качестве эксплантов использовали семена, побеги, почки и листовые пластинки, которые культивировали на питательной среде Мурасига и Скуга, содержащей вещества с цитокининовой (БАП, 21р, кинетин (0,5 -1,0 мг/л)) и ауксиновой (НУК 0,5-1,0 мг/л, ИМК и ИУК 1-7 мг/л) активностью. Растительный материал выращивали в условиях световой комнаты, где поддерживалась температура 25±2°С, 16-часовой фотопериод, освещение белыми люминесцентными лампами OSRAM L36/25 с интенсивностью освещения 3,5 тыс. лк. Для укоренения микропобегов использовали модифицированную питательную среду Мурасиге и Скуга, содержащую % нормы макросолей, а также сахарозу 20 г/л и ИУК 1 мг/л.
Для определения цитотоксического эффекта растительных экстрактов использовали МТТ-тест. Работу проводили в 96-лу-ночном плейте. В каждую лунку вносили раковые клетки в количестве 2*104 клеток/ лунка, добавляли 100 мкл питательной среды и инкубировали в течение 1 часа. Лиофиль-но высушенные спиртовые экстракты рас-тений-регенерантов (ашваганды и астрагала) растворяли в DMSO до концентрации 5000 мкг/мл, после чего проводили разбавление раствора до 50 мкг/мл и полученные концентрации в дальнейшем наносили на раковые клетки человека. К содержимому каждой лунки добавляли по 25 мкл МТТ (4 мг/мл в PBS), который первоначально был профильтрован, после чего проводили инкубацию в СО2-инкубаторе в течение 4 часов. После этого в каждую лунку добавляли по
50 мкл SDS (20% SDS на воде с 0,02 N HCl или H2SO4) и инкубировали в течение ночи. Затем измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 570 и 650 нм. В качестве объекта исследования была взята линия клеток M-^La (эпители-оидная карцинома шейки матки человека, сублиния ^La, клон М ^La, коллекция Института цитологии РАН, Санкт-Петербург). В контрольном варианте экстракты не вносили.
Определение фунгицидной активности растительных экстрактов проводили на чистой культуре грибов рода Fusarium, в частности Fusarium culmorum (штамм M-10-1, выделенный из растений пшеницы, 2009, Московская область) и Fusarium sporotrichioides Sherd (штамм OP-14-1, выделенный из растений пшеницы, 2014, Орловская область).
Данные штаммы были выделены и идентифицированы сотрудниками лаборатории микологии Института фитопатологии РАН.
Для эксперимента использовали живые культуры грибов рода Fusarium L. (Fusarium culmorum, Fusarium sporotrichioides), длительно хранившиеся в холодильнике при температуре +40С, первоначально размножали на питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи МС, не содержащей фитогор-моны. Выращивали грибы в чашках Петри в условиях световой комнаты при температуре 250С, 16-часовом фотопериоде, при интенсивности света 3000 лк. Пересадку осуществляли при необходимости на 5-7 сутки в ламинарном боксе. Растворенный в DMSO сухой растительный остаток, полученный из экстрактов, добавляли в состав питательной среды уже после ее автоклавирования.
Концентрация экстракта составила 30, 60, 100 мг/л. Контролем служила среда без экстракта, а также чистый растворитель (DMSO). Фунгицидную активность растительных экстрактов определяли по росту мицелий гриба. Для этого на 7-е сутки культивирования проводили измерение диаметра гриба в двух плоскостях.
Результаты и обсуждения
Поскольку растения Astragalus Dasyanthus Pall, Withania somnifera L. относятся к цен-
59
ным немногочисленным видам и имеют ограниченный ареал распространения в природе, то большое практическое значение приобретает получение культур in vitro, как возможных источников биологически активных веществ и лекарственных препаратов. Известно, что каллусогенез является сложным процессом, который непосредственно зависит от применяемых гормонов, их концентрации, типа первичного экспланта и исследуемого генотипа. Отмечены некоторые особенности и закономерности в способности листовых эксплантов к каллусогенезу. Как правило, этот процесс начинался с периферийной зоны листа, а также в местах прикрепления черешка. По мере культивирования дифференцированные клетки листа полностью превращались в дедифференци-рованные и было отмечено активное формирование каллусной ткани.
Исследования показали, что гормональный состав питательной среды приводил к изменению морфофизиологических процессов, которые проявлялись в формировании каллусной ткани в основании первичного экспланта с последующей регенерацией растений, в индукции развития меристем. Микроклоны во всех случаях характеризовались интенсивным ростом, формированием мощной надземной биомассы и высоким коэффициентом размножения (Рис.1 А-F).
На основании многоплановых исследований по влиянию различных регуляторов роста на клональное микроразмножение изучаемых растений были установлены наилучшие сочетания гормонов и их концентрации, приводящие к максимальному пролифера-тивному эффекту. Для этих растений высокий коэффициент размножения, интенсивный рост пазушных меристем и формирование хорошо развитых побегов были отмечены на среде, содержащей БАП 0,5 мг/л в сочетании с ИУК 0,5 мг/л. Кроме того, для ашваганды высокие положительные результаты были получены и на среде, содержащей препарат Дропп (0,01 мг/л).
Как следует из анализа литературных источников, для растений ашваганды (Withania somnifera) и астрагала (Astragalus Dasyanthus Pall) в комплексе вторичных метаболитов превалируют такие вещества, как полифенолы, обладающие в том числе фунгицидным действием и противораковой активностью [7].
Поэтому изучение действия экстрактов данных растений на раковые клетки человека, являться актуальным направлением и может служить косвенным признаком биосинтетической способности растений к образованию вторичных веществ обладающих не только биологической активностью, но и ци-тотоксическим действием. В нашей работе была изучена цитотоксичность экстрактов,
C
Рис. 1. А - каллусная такань ашваганды, В - регенерация растений на каллусной ткани ашваганды, С, D - микроклон ашваганды Е - каллусная ткань астрагала, Б - микроклон астрагала
60
полученных из растении-регенерантов ашваганды и астрагала, а также каллусной ткани ашваганды (Рис 2).
В результате проведенных исследований было установлено, что растительные экстракты, полученные из растений-регене-рантов ашваганды и астрагала, при разных концентрациях обладают различной цито-токсичностью. Как следует из полученных результатов, малые концентрации экстрактов (50 мкг/мл) были не токсичны для исследуемых раковых клеток, о чем свидетельствует 100%-ное их выживание при использовании двух изучаемых экстрактов. Однако, по мере повышения концентрации цитотоксический эффект экстрактов начинал проявляться. Для экстрактов ашваганды, уже при концентрации 250 мкг/мл наблюдали гибель более 40% раковых клеток, а при концентрации 500 мкг/л и выше гибель раковых клеток была в пределах 90-95%.
Что касается экстрактов астрагала, то наибольшей цитотоксичностью обладали экстракты при концентрации 1000 мкг/л, когда выживаемость исследуемых раковых клеток составляла менее 10%, при этом концентрации экстракта 500 мкг/л также характеризовалась высоким цитотоксическим эффектом.
Так как наибольшей цитотоксичностью обладали растения - регенеранты ашваган-ды, было принято решение именно на культуре каллусной ткани этого растения проследить изменения цитотоксического эффекта в недефференцированных клетках. Результаты наших исследований растительных экстрактов, полученных из каллусной ткани, свидетельствуют, что цитотоксический эффект был слабо выражен и максимальная гибель раковых клеток (не более 24%) была отмечена лишь при самых высоких концентрациях экстракта - 5000 мкг/мл (Рис. 3). О том, что на основе продуктов вторичного метаболизма растений получают высокоэффективные лекарственные препараты для успешной терапии онкологических заболеваний, не раз сообщалось в литературе.
Полученные результаты могут служить косвенным признаком, характеризующим биосинтетический потенциал культур in vitro к образованию продуктов вторичного синте-
я микроклоны ашваганды ■ микроклоны астрагала
250 мкг 500 мкг
концентрация экстрактов
Рис. 2. Влияние различных концентраций растительных экстрактов микроклонов ашваганды и астрагала на жизнеспособность раковых клеток человека
Рис. 3. Влияние различных концентраций растительных экстрактов микроклонов и каллусной ткани ашва-ганды на жизнеспособность раковых клеток человека
за. Выявленные особенности клеток к синтезу вторичных метаболитов, обладающих цитотоксичностью, обусловлены тем, что в клетках целого растения вторичные метаболиты образуются в строго дифференцированных клетках и этот процесс находится под контролем регуляторных систем растительного организма. Иное дело обстоит с дедифференцированными клетками (каллус-ная ткань), которые постоянно делятся и не переходят в дифференцированное состояние. Вследствие чего в каллусной ткани биосинтез ряда вторичных метаболитов может быть нивелирован, вплоть до его полного терминирования. Об изменении и угнетении вторичного метаболизма каллусных тканей еще несколько десятилетий назад сообщалось в научной литературе [3]. Согласно многочисленным исследованиям, данным процессом можно эффективно управлять, изменяя условия культивирования, например, химические факторы питательной среды (минеральные соли, гормоны), физические внешние факторы (спектральный состав света и
61
Рис. 4. Влияние различных концентраций экстрактов ашваганды на рост Fusarium culmorum, штамм М-10-1: а -экстракт, полученный из каллусной ткани, б - экстракт, полученный из растений - регенерантов
его интенсивность, рН питательной среды, температурный режим выращивания) или создавая стрессовые условия (присутствие факторов абиотической и биотической природы).
Кроме того, наши исследования показали, что изучаемые экстракты обладают антифунгицидной активностью, которая зависит от источника получения экстракта, его концентрации, а также от исследуемого штамма фитопатогена. Так, было установлено, что исследуемые экстракты оказали различное токсическое действие на рост мицелия гриба Fusarium culmorum и Fusarium sporotrichioides Sherd. Следует отметить, что экстракты, полученные из каллусной ткани, обладали меньшей антифунгицидной активностью (Рис. 4), по сравнению с экстрактами, полученными из растений-регенерантов. Причем данная ответная реакция изучаемых фитопатогенов (Fusarium sporotrichioides Sherd, Fusarium culmorum) на действие двух экстрактов различных видов растений была практически одинаковой (Рис 5).
Заключение
На основе изложенного выше, можно заключить что культуры in vitro исследованных растений обладают способностью к биосин-
тезу вторичных соединений, обладающих высокой цитотоксичностью и фунгицид ной активностью, что, несомненно, имеет важное практическое значение как потенциальный источник ценных биологически активных веществ для фарминдустрии. Причем в условиях in vitro при образовании биологически активных веществ сохраняется специфичность, приуроченная к организованным тканям интактных растений, но в менее выраженной степени [2]. Указанные свойства растительных тканей, произрастающих в строго контролируемых условиях, находят подтверждение и в цитотоксических исследованиях, когда дедифференцированные кал-лусные культуры отличались наименьшим
Рис. 5. Влияние растительных экстрактов микроклонов ашваганды и астрагала в концентрациях 100 мг/л на рост мицелия грибов рода Fusarium L.
62
эффектом. Наши исследования показали, что вторичные метаболиты могут оказывать не только ингибирующий эффект на рост раковых клеток человека, но и могут быть стимуляторами различных морфофизиологиче-ских процессов, о чем свидетельствует ряд литературных источников [9,10].
Список литературы
1. Алексеева, Г.М. Фармакогнозия. Лекарственное сырье растительного и животного происхождения. Санкт-Петербург. СпецЛит. - 2013.
2. Доан Тху Тхуи. О способности микроклонов лекарственных растений на примере Бюзсогеа саиса$1са Ь1р$ку к образованию биофлаваноидов / Доан Тху Тхуи, Е.А. Калашникова, С.М. Зайцева, Р.Н. Киракосян // Естественные и технические науки. - 2018. - №2. - С. 38.
3. Запрометов М.Н. Образование фенольных соединений в процессе дифференциации в каллусной культуре чайного растения / М.Н. Запрометов, Н.В. Загоскина, В.Ю. Стрекова, Г.А. Морозова // Физиология растений. - 1979. - №26. - С. 485-491.
4. Куркин, В.А. Фенилпропаноиды - перспективные природные биологически активные соединения /
B.А. Куркин // Самара: Изд. Гос. Мед. Ун-т. - 1996.-
C. 31-37.
5. Носов, А.М. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений / А.М. Носов // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. Под редакцией Р.Г. Бутенко. - М.: Наука. - 1991.
6. Носов А.М. Использование клеточных технологий для промышленного получения биологически активных веществ растительного происхождения / А.М. Носов // Биотехнология, - 2010. - №5. - С. 8-28.
7. Alves C.T. Antifungal activity of phenolic compounds identified in flowers from North Eastern Portugal against Candida species / Alves C.T., Ferreira I., Barros L., Silva S., Azeredo J., Henriques M. // Future Microbiol. - 2014. - 9(2). Р. 139-146
8. Devi, P.U. Withania somnifera dunal (ashwagandha): potential plant source of a promising drug for cancer chemotherapy and radiosensitization. / P.U.Devi // Indian J. Exp Biol. - 1996. - 34. - Р. 927-932.
9. Jeong, H. Molecular Discrimination of Medicinal Astragali Radix by RAPD Analysis. Immunopharmacology and Immunotoxicology / H. Jeong, J. Um, S. Kim, K. Koh, W. Hwang, K. Lee, C. Kim, H. Kim // Pakistan Journal of Biological Sciences, - 2015. - 310 р.
10. Zengqi Li. The synthesis and storage of phenolic compounds in the root and rhizome of Echinacea purpurea / Zengqi Li, Tiexin Tang, Shejian Liang, Xiping Ning, Mei Bai, Hong Wu // American journal of Plant Sciences. -2012. - 3- Р. 551-558.
I
ЧОУДПО«ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ БИОЛОГИИ» г. Санкт-Петербург
Курсы повышения квалификации
Ветеринарная кардиология - 4 ступени Л абораторная диагностика Ветеринарная офтальмология Ветеринарная рентгенология - 2 ступени [Ветеринарная ультразвуковая диагностика -4 ступени
Ветеринарная фармация
Предварительная регистрация обязательна! Справки по тел. (812) 612-13-334 или (812) 232-55-92 доб. 208 График проведения и информация на сайте: www.invetbio.spb.ru/seminars.html
Лицензия Комитета по образованию Санкт-Петербурга на осуществление образовательной деятельности по образовательным программам дополнительного профессионального образования № 1093 от 04.08.2014 г.
