CC BY
20Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 23 (62). 2010. № 4. С. 239-244.
УДК 582.736.3: 546.23
КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ СЕЛЕНА КАЛЛУСНЫМИ КУЛЬТУРАМИ ASTRAGALUS DASIANTHUS (PALL.)
Юркова И.Н., Тайкова В.П., Бугара И.А., Теплицкая Л.М.
Таврический национальный университет им. В.И. Вернадского, Симферополь, Украина
E-mail: [email protected]
Исследованы закономерности накопления селена каллусными культурами Astragalus dasyanthus в зависимости от концентрации селена в питательной среде. Показано, что при ступенчатом увеличении концентрации селена в питательной среде значительно повышается степень концентрирования селена и ростовая активность. Максимальное содержание селена в каллусной биомассе увеличилось в 74 раза по сравнению с контролем.
Ключевые слова: каллусные культуры, Astragalus dasyanthus, селен, концентрирование.
ВВЕДЕНИЕ
В последнее время у исследователей резко повысился интерес к селену -микроэлементу, необходимому для жизнедеятельности организма. Спектр действия селена в организме широк. Он выполняет каталитическую, структурную и регуляторную функции, взаимодействует с витаминами, ферментами и биологическими мембранами [1], участвует в окислительно-восстановительных процессах, обмене жиров, белков и углеводов [2]. Миграция селена осуществляется по цепочке: почва - вода - пищевые продукты - человек.
Основными путями поступления селена в организм являются продукты животного и растительного происхождения, к которым относятся растения-концентраторы селена, в зависимости от его содержания в почве накапливающие до 15 г Se/кг а.с.в. [3]. Самая высокая биодоступность селена в составе различных растительных источников.
Однако во многих регионах, в том числе в Украине, в почвах сельскохозяйственного назначения фиксируется дефицит селена [4]. Этот дефицит увеличивается по мере внесения в почву серосодержащих удобрений. С целью получения органических форм селена разработаны технологии обогащения биомассы мироводорослей (спирулины) и дрожжей селеном. Однако для этих микроорганизмов селен в больших концентрациях является токсикантом, угнетающим рост биомассы [5, 6]. Кроме того, значительная часть селена накапливается микроорганизмами в процессе физической адсорбции селенитов полисахаридами клеточной стенки [7].
Из растений-концентраторов селена первое место занимают виды рода Astragalus, к которому относится Astragalus dasiantus Pall., внесенный в государственную Фармакопею как официальное лекарственное растение [8].
Экологически чистые ареалы произрастания астрагала шерстистоцветкового расположены в заповедных территориях Забайкалья. На фармацевтическом рынке присутствуют только препараты российского и американского производства (Фитоселен, драже Селеновый дар и др.), полученные на основе экстракции из дикорастущего астрагала селенсодержащих органических форм. Однако в Украине этот вид находится под угрозой уничтожения и занесен в Красную книгу Украины [9]. В связи с этим актуальным является получение клеточной биомассы астрагала в качестве источника биологически доступных форм органического селена.
Целью настоящей работы было исследование закономерностей концентрирования селена длительно пассируемыми каллусными культурами астрагала шерстистоцветкового.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследования служили калуссные культуры астрагала шерстистоцветкового Astragalus dasyanthus Pall. III-IV пассажа. При выполнении работы использовали методы, общепринятые в исследованиях по культуре изолированных тканей растений [10]. Каллусные культуры IV пассажа выращивали в течение 13 недель на модифицированной агаризованной питательной среде Мурасиге и Скуга, дополненной фитогормонами (2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой - 2,0 мг/дм3, 6-бензиламинопурин - 0,5 мг/дм3, кинетином - 0,5 мг/дм3 [11,12]) и селеном. Наименее токсичной и наиболее предпочитаемой растениями и микроорганизмами формой селена являются селениты щелочных металлов (IV) [13]. Поэтому источником селена в питательных средах служил селенит натрия (Na2SeO3) «ч.д.а.» в концентрациях 5-20 мг Se/дм3. Схема эксперимента приведена на Рис. 1.
В первой серии каллусные культуры III пассажа пассировали на питательную среду, содержащую селен в тех же концентрациях, что и в III пассаже: контроль (без селена), 5, 10 и 15 мг Se/дм3; во второй - использован метод последовательного повышения устойчивости от низких концентраций токсичных веществ до более высоких. В этой серии каллусные культуры астрагала пассировали на питательную среду, содержащую на 5 мг Se/дм3 больше, чем в предыдущем пассаже: 5 мг Se/дм3
3 3 3 3 3
=> 10 мг Se/дм , 10 мг Se/ дм => 15 мг Se/дм , 15мг Se/дм => 20 мг Se/дм .
Каллус культивировали в условиях термостатируемого помещения (25 оС) при относительной влажности воздуха 65-70 %, освещенности 2-3 тыс. люкс и 16-часовом фотопериоде [14].
Ростовой индекс определяли морфометрическим методом по отношению среднего объема полученного каллуса к объему транспланта на 1-ю, 4-ю, 7-ю, 10-ю и 13-ю недели культивирования.
Содержание селена в каллусной биомассе, высушенной до абсолютно сухого веса (а.с.в.), определяли в конце эксперимента (13-я неделя культивирования) на атомно-абсорбционном спектрометре фирмы Perkin-Ermler.
Полученные данные обработаны статистически с использованием стандартного пакета статистики в Microsoft Office.
III пассаж
Контроль (без селена)
5.0 мг
10.0 мг
15.0 мг
IV пассаж
Контроль (без с еле на )
5.0 мг 10.0 мг 10.0 мг 15.0 мг 15.0 мг 20.0 мг
8е/дм3 8е/дм3 8е/дм3 8е/дм3 8е/дм3 8е/дм3
Рис. 1. Схема исследования влияния условий внесения селена в питательную среду на ростовые характеристики и концентрирование селена каллусными культурами астрагала шерстистоцветкового.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование закономерностей роста каллусных культур астрагала шерстистоцветкового в зависимости от условий внесения в питательную среду селена показало, что при пассировании каллуса на питательные среды с постоянной концентрацией селена снижение ростового индекса наблюдалось только при концентрации селена 15,0 мг/дм3 (рис. 2, крива 4) до 10-й недели культивирования. К 13-й недели значение ростового индекса в варианте 15,0 мг 8е/дм3 превысило контрольное (рис. 2, кривые 1 и 4).
Максимальный прирост биомассы отмечался во второй серии при ступенчатом увеличении концентрации селена с 10,0 до 15,0 мг/дм3 (рис. 2, кривая 6).
Как видно из приведенных результатов, устойчивость каллусных культур астрагала шерстистоцветкового к высоким концентрациям селена (15,0 - 20,0 мг/дм3) резко повышалась начиная с 7-й недели культивирования (рис. 2, кривые 3-6).
Тормозящее воздействие селена на рост наблюдалось лишь при пассировании каллуса на среду, содержащую 20,0 мг 8е/дм3, к концу 13-й недели эксперимента (рис. 2, кривая 7).
Закономерности, полученные при исследовании влияния условий внесения селена в питательные среды, хорошо согласуются с результатами концентрирования селена каллусной биомассой астрагала шерстистоцветкового (рис. 3).
Рис. 2. Динамика роста каллусных культур астрагала шерстистоцветкового в зависимости от условий внесения селена в питательную среду:
1- контроль (без 8е); 2 - 5,0 мг 8е/дм3; 3 - 10,0 мг 8е/дм3; 4 - 15,0 мг 8е/дм3; 5 - 10,0 мг 8е/дм3 (в предыдущем пассаже - 5,0 мг 8е/дм3); 6 - 15,0мг 8е/дм3 (в предыдущем пассаже - 10,0 мг 8е/дм3); 7 - 20 мг 8е/дм3 (в предыдущем пассаже - 15,0 мг 8е/дм3).
Как видно из приведенных на Рис. 3 данных, увеличение концентрации селена в питательной среде приводило к увеличению концентрирования селена каллусной биомассой как в первой, так и во второй сериях. Однако при ступенчатом увеличении концентрации селена этот эффект был наиболее выражен, особенно в варианте 20 мг 8е/дм3. В этом случае содержание селена в биомассе каллуса увеличилась в 74 раза по сравнению с контролем (небольшое количество селена в контроле объясняется его присутствием в качестве примесей в солях, используемых для приготовления питательной среды). Накопление селена в каллусных культурах при его концентрации в питательной среде 15-20 мг 8е/дм3 достигало 321,7-348,3 мг 8е/кг а.с.в., что значительно выше концентрирования селена микроводорослью БртИпа platensis и хлебопекарными дрожжами [5, 6].
400 -,
0 5 10 15 20
Концентрация селена в питательной среде, мг Бе/дм 3
Рис. 3. Концентрирование селена каллусными культурами астрагала шерстистоцветкового в зависимости от условий внесения селена в питательную среду: 1 - каллусные культуры, пассированные на питательную среду, содержащую селен в тех же концентрациях, что и в предыдущем пассаже;
2 - каллусные культуры, пассированные на питательную среду, содержащую на 5 мг 8е/дм3 больше, чем в предыдущем пассаже (5 мг 8е/дм3 => 10 мг 8е/дм3, 10 мг 8е/дм3 => 15 мг 8е/дм3, 15мг 8е/дм3 => 20 мг 8е/дм3).
ВЫВОДЫ
В результате проведенных исследований показано, что каллусные культуры астрагала шерстистоцветкового способны многократно концентрировать селен из питательной среды, содержащей до 20,0 мг 8е/дм3 (IV), при одновременном повышении ростовой активности.
Список литературы
1. Микроэлементозы человека: этиология, классификация, органопатология / [Авцын А.П., Жаворонков А.А., Риш М.А. и др]. - М., 1991. - 258 с.
2. Ермаков В.В. Биологическое значение селена / В.В. Ермаков, В.А. Ковальский. - М., 1974. - 189 с.
3. Давидова О. С. Фiзiолого-бiохiмiчнi та стреспротекторш функцп селену в рослинах / О.С Давидова., В.А Вешицький, П.П. Яворшський // Физиология и биохимия культурных растений. - 2009. - Т.41, № 2. - С. 109-122.
4. Серегина И.И. Биологическая роль селена в растениях / И.И. Серегина, Н.Т. Ниловская // Агрохимия. - 2002. - № 10. - С. 76-85.
5. Влияние селена на рост микроводоросли Spirulina platensis (Nords.) в накопительной и квазинепрерывной культурах / Г.С. Минюк, Р.П. Тренкеншу, А.В. Алисиевич [и др.] // Экология моря. - 2000. - Вып. 54. - С. 42-49.
6. Физиологические и биохимические особенности культивирования хлебопекарных дрожжей на средах, содержащих минеральный селен / К.И. Жакова, С.Л. Романов, Л.Ф. Коваленко [и др.] // Весщ Нацыянальнай акадэми навук Бшорусг Серыя аграрних навук. - 2005. - № 4. - С. 120-123.
7. Oyamada N. Methylation of inorganic selenium compounds by freshwater green algae Ankistrodesmus sp., Chlorella vulgaris and Selenastrum sp. / N. Oyamada, G. Takahashi, M. Ishizaki // Eisei Kagaku. -1991. - V. 37, № 2. - P. 83-88.
8. Государственная фармакопея Украины. - Харьков, 2008. - 617 с.
9. Аюмов 1.К. Червона книжка Украши. / Аюмов 1.К. - Глобалконсалтинг, 2009. - 1536 с.
10. Калинин Ф.Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений / Ф.Л. Калинин, В.В. Сарнацкая, В.Е. Полищук. - Киев.: Наук. думка, 1986. - С. 34-36.
11. Пат. № 36368 Украина, МПК6 С 12 N 5/04. Споаб культивування калуо^ тканини астрагала шерстистоквггкового (Astragalus dasyanthus Pall.) / Бугара 1.О., Юркова 1.М., Бугара О.М.; заявитель и патентообладатель Таврический нац. ун-т. - № 200805928: заявл. 07.05.08; опубл. 27.10.08. Бюл. № 20.
12. Бугара И.А. Получение и цитологический анализ каллусных культур астрагала шерстистоцветкового (Astragalus dasyanthus Pall) / И.А. Бугара, И.Н. Юркова, А.М. Бугара // Ученые записки Таврич. нац. ун-та. Серия «Биология, химия». - 2008. - Т. 21(60), № 2. - С. 9-14.
13. Zhou Z. Study on the accumulation of selenium and its binding to the proteins, polysaccarides and lipids from Spirulina maxima, S. platensis and S. subsalsa / Z. Zhou, P. Li, Z. Liu // Oceanol. Limnol. Sin. Haiyang Yu Huzhao. - 1997. - V. 28, № 4. - P. 363-370.
14. Высоцкий В.А. Клональное микроразмножение растений / В.А. Высоцкий // Культура клеток растений и биотехнология. - М.: Наука, 1986. - С. 34-36.
Юркова 1М. Концентрування селену калу сними культурами Astragalus dasianthus (Pall.)./ 1.М. Юркова, В.П. Тайкова, Ю. Бугара, Л.М. Теплицька // Вчет записки Тавршського нацюнального ушверситету iM. В.1. Вернадського. Сeрiя „Бюлопя, хiмiя". - 2010. - Т. 23 (62), № 4. -С. 239-244.
Дослщжено закожмрноста накопичення селену у калусних культурах Astragalus dasyanthus в залежносп ввд концентрацй селену в живильному середовищг Показано, що при стушнчастому збшьшент концентрацй селену в живильному середовищi значно тдвищуеться стутнь концентрування селену i ростова актившсть. Максимальний вмют селену в калуснш бюмаи збшьшився в 74 рази в поргвнянш з контролем.
Krn4oei слова: астрагал шерстистокмтковий, калуснi культури, концентрування селену.
Yurkova I. The selenium concentration in callus culture of Astragalus dasianthus (Pall.) / I. Yurkova, V. Taikova, I. Bugara, L.Teplitskaya // Scientific Notes OF Taurida V.Vernadsky National University. -Series: Biology, chemistry. - 2010. - Vol. 23 (62), No 4. - Р. 239-244.
The regularities of selenium accumulations in callus cultures of Astragalus dasyanthus of selenium concentration in culture medium was depending. The stepped increase of selenium concentration in culture medium significantly increased the degree of concentration of selenium and the growth activity was shown. The maximum selenium content in callus biomass increased of 74 degree compared with the control. Keywords: callus culture, Astragalus dasyanthus, selenium, concentration.
Поступила в редакцию 13.11.2010 г.
