CC BY
6
© Коллектив авторов, 2023 Масютина А.М.1, Пащенков М.В.1, 2
Транскрипционный ответ макрофагов на сочетанную стимуляцию NOD-подобного и Toll-подобного рецептора (сообщение 2)
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Сочетания агонистов NOD- и Toll-подобных рецепторов являются мощными активаторами макрофагов. Однако в литературе отсутствует подробная характеристика изменений транскриптомов макрофагов под действием данных сочетаний аго-нистов.
Цель исследования - выявить и сопоставить группы генов, характеризующихся увеличением и уменьшением экспрессии при сочетанной стимуляции макрофагов человека агонистами рецепторов NOD1 и TLR4 in vitro.
Материал и методы. Макрофаги, полученные из моноцитов крови здоровых доноров, стимулировали агонистами NOD1 и TLR4 раздельно и в сочетании в течение 1 и 4 ч. Транскриптомы анализировали с помощью высокопроизводительного секвениро-вания РНК (RNA-seq) и методов биоинформатики.
Результаты. При стимуляции макрофагов комбинацией агонистов NOD1 + TLR4 были идентифицированы 2 группы генов (> 500 генов в каждой), характеризующихся повышением и понижением экспрессии. Индуцибельная группа была обогащена генами, кодирующими ключевые медиаторы воспаления, за исключением типичных маркеров М1-активации. Репрессибельная группа была обогащена генами-регуляторами клеточного цикла. С помощью методов биоинформатики идентифицированы механизмы, которые могут лежать в основе транскрипционного репрограммирования макрофагов в данных условиях стимуляции.
Заключение. Сочетание агонистов рецепторов NOD1 и TLR4 вызывает транскриптом-ное репрограммирование макрофагов, соответствующее активации по врожденному типу.
Ключевые слова: макрофаги; транскриптом; NOD1; TLR4; мурамилпептиды; липополисахарид; секвениро-вание РНК
Статья получена 25.07.2023. Принята в печать 28.08.2023.
Для цитирования: Масютина А.М., Пащенков М.В. Транскрипционный ответ макрофагов на сочетанную стимуляцию NOD-подобного и Toll-подобного рецептора (сообщение 2). Иммунология. 2023; 44 (5): 534-544. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2023-44-5-534-544
Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 21-15-00211. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Постановка экспериментов и анализ результатов - Масютина А.М.; планирование экспериментов, анализ результатов и написание статьи - Пащенков М. В.
Для корреспонденции
Пащенков Михаил Владимирович -доктор медицинских наук, и.о. заведующего лабораторией клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6995-1790
Masyutina A.M.1, Pashenkov M.V.1, 2
Transcriptional response of macrophages to combined stimulation of NOD-like and Toll-like receptors (report 2)
1 National Research Center Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation
2 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation, 117997, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. Combinations of NOD-like and Toll-like receptor agonists are potent activators of macrophages. However, there is lack of detailed characteristics of transcriptional alterations occurring in macrophages stimulated by these agonists combinations.
Aim - to reveal and compare groups of genes characterized by increased and reduced expression upon combined stimulation of human macrophages with NOD1 and TLR4 agonists in vitro.
Material and methods. Macrophages generated from healthy donor monocytes were stimulated with NOD1 and TLR4 agonists separately or simultaneously during 1 or 4 hours. Transcriptomes were analysed using high-throughput RNA sequencing (RNA-seq) and bioinformatics.
Results. In macrophages stimulated with NOD1 + TLR4 agonist combination, we identified two groups of genes (> 500 genes each) characterized by either augmented or repressed mRNA expression. The inducible group was strongly enriched with genes encoding key inflammatory mediators, except for typical markers of M1 activation. The repressible group was enriched with genes coding for cell cycle regulators. Using bioinformatics approaches, we identified potential mechanisms that may underlie transcriptional reprogramming of macrophages in these activation conditions.
Conclusions. Combination of NOD1 and TLR4 agonists induces transcriptional reprogramming of macrophages compatible with innate type of activation.
Keywords: macrophages; transcriptome; NOD1; TLR4; muramyl peptides; lipopolysaccharide; RNA sequencing
Received 25.07.2023. Accepted 28.08.2023.
For citation: Masyutina A.M., Pashenkov M.V. Transcriptional response of macrophages to combined stimulation ofNOD-like and Toll-like receptors (report 2). Immunologiya. 2023; 44 (5): 534-44. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2023-44-5-534-544 (in Russian)
Funding. The work was supported by the Russian Science Foundation grant No. 21-15-00211. Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Conducting experiments and analysing results - Masyutina A.M.; designing experiments, analysing results and writing the article - Pashenkov M.V.
For correspondence
Mikhail V. Pashenkov -MD, PhD, Acting Head of the Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6995-1790
Введение
Сочетания агонистов NOD- и Toll-подобных рецепторов синергически активируют клетки врожденной иммунной системы [1-4] и успешно применяются в эксперименте для усиления врожденных и адаптивных механизмов иммунной защиты [5, 6]. В то же время неконтролируемое высвобождение этих аго-нистов из микробных клеток при острых инфекционных заболеваниях может приводить к избыточной активации врожденного иммунного ответа, повреждению тканей и неблагоприятному исходу заболевания [7, 8]. Таким образом, изучение механизмов кооперации NOD- и Toll-подобных рецепторов является актуальной задачей.
Большое функциональное значение имеет кооперация рецепторов NOD1 и TLR4, играющих центральную роль в распознавании грам-отрицательных бактерий [9, 10]. Используя высокопроизводительное секвенирование РНК (RNA-seq), в своей предыдущей работе мы показали, что при активации макрофагов человека комбинацией агонистов NOD1 + TLR4 в течение 1 ч возрастает экспрессия ~ 200 генов, а в течение 4 ч -> 500 генов; при этом у некоторых индуцибельных генов, кодирующих основные провоспалительные
цитокины и другие медиаторы воспаления, мы наблюдали синергическое усиление экспрессии (эффект сочетания агонистов на экспрессию этих генов больше, чем сумма эффектов двух агонистов по отдельности) [11]. В дополнение к предыдущей работе [11], посвященной особенностям синергически индуцируемых генов, в данной статье мы приводим более общие характеристики транскрипционного репрограммиро-вания макрофагов под действием сочетания агонистов NOD1 + TLR4.
Материал и методы
Реактивы. Синтетический агонист NOD1 -^ацетил^-мурамил^-аланил^-изоглутамил-.езо-диаминопимелиновая кислота (М-триДАП), а также высокоочищенный агонист TLR4 - липополисахарид (ЛПС) E. coli O111:B4 были закуплены у фирмы Invivo-Gen (США), рекомбинантный человеческий грануло-цитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) - у Miltenyi Biotec (ФРГ).
Доноры крови. Для проведения RNA-seq была получена венозная гепаринизированная кровь от трех здоровых доноров. Исследование было одобрено локальным Комитетом по этике ФГБУ «ГНЦ Институт
иммунологии» ФМБА России, протокол 10/2017. Все доноры дали информированное согласие на участие в исследовании.
Культивирование и стимуляция макрофагов. Макрофаги получали, как описано ранее [11], и инкубировали в течение 1 и 4 ч в присутствии М-триДАП (10 мкг/мл), ЛПС (10 нг/мл), их сочетания либо без агонистов для оценки базальной экспрессии генов. После инкубации клетки лизировали для выделения мРНК.
Исследование транскриптомов макрофагов с помощью RNA-seq. Процедура получения полнотранс-криптомных данных описана нами в предшествующих работах [11]. Для анализа были отобраны 11 839 наиболее представленных белок-кодирующих генов (> 50 «сырых» прочтений на ген хотя бы в одном образце у каждого из трех доноров). Нормализованную экспрессию генов выражали в виде числа прочтений, деленного на миллион всех прочтений в данной библиотеке и на длину гена в килобазах (reads per kilobase per million - RPKM).
Для каждого гена в каждом экспериментальном образце вычисляли индекс стимуляции (ИС) по формуле ИС = RPKM / RPKM, где RPKM -
•> агонист 0 агонист
экспрессия гена после стимуляции агонистом или их сочетанием, RKPM0 - базальная экспрессия данного гена у того же донора в той же временной точке. Уве -личение экспрессии гена по сравнению с базальной экспрессией считали биологически значимым при ИС > 2 у всех 3 доноров, уменьшение - при ИС < 0,5 у всех 3 доноров.
Было обнаружено 637 генов со значимым повышением экспрессии и 695 генов со значимым понижением экспрессии хотя бы в одной из точек при стимуляции хотя бы одним агонистом либо их сочетанием. Эти гены сформировали множества, соответственно, инду-цибельных и репрессибельных генов. Пересечение этих множеств составило 2 гена (ADRB2 и IFG1R); оба характеризовались значимым повышением экспрессии через 1 ч при различных видах стимуляции с возвратом к базальным значениям после 4 ч стимуляции ЛПС и М-триДАП + ЛПС и значимым понижением экспрессии после 4 ч стимуляции М-триДАП.
Взаимодействие сигналов от NOD1 и TLR4 оценивали по индексам потенцирования (ИП):
ИП = Ответ / (Ответ + Ответ ).
М-триДАП+ЛПС v М-триДАП ЛПС7
Ответы рассчитывали по формулам:
Ответ = ИС - 1
агонист агонист
(для индуцибельных генов);
Ответ = 1/ИС - 1
агонист агонист
(для репрессибельных генов).
ИП для данного гена/точки рассчитывали только при выполнении двух условий: 1) наличие биологи-
чески значимого изменения экспрессии при стимуляции хотя бы одним агонистом или их сочетанием; 2) отсутствие разнонаправленных изменений экспрессии при стимуляции отдельными агонистами и их сочетанием (второму условию удовлетворяли все индуцибельные и репрессибельные гены). Индукцию или репрессию гена считали синергической при ИП > 1,2 у всех трех доноров [11]. Значения ИП в интервале 0,5-1,0 указывали на инфрааддитивные взаимодействия (эффект сочетания агонистов выше, чем эффекты отдельно взятых агонистов, но меньше, чем их сумма).
Анализ функциональной принадлежности генов. Использовали аннотированные функциональные наборы генов, опубликованные на сайте Gene set enrichment analysis (https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/ genesets.jsp), из коллекций Hallmark (50 наборов генов, участвующих в основных биологических процессах), C3.TFT [1134 набора генов, являющихся мишенями факторов транскрипции (ФТ)], C3.MIR (2598 наборов генов, являющихся мишенями мкРНК), C5.GO (10 561 наборов, сформированных по генным онто-логиям). Из наборов исключали гены, не входящие в список 11 839 генов, экспрессируемых в макрофагах. Обогащение или обеднение представителей данного функционального набора в данном множестве генов по сравнению другим множеством оценивали с помощью теста х2. Множественность сравнений учитывали по процедуре Беньямини-Хохберга [12] с пороговым уровнем достоверности q = 0,05.
Анализ сайтов связывания ФТ. Использовали программу CiiiDER [13], как описано ранее [11]. Численность генов, содержащих в промоторе хотя бы один данный сайт связывания, в двух множествах генов сравнивали тестом х2. Учитывали сайты связывания только тех ФТ, которые экспрессировались в макрофагах (354 разновидности). Множественность сравнений учитывали по процедуре Беньямини-Хохберга с q = 0,05.
Анализ стабильности мРНК. Использовали нормализованные значения стабильности (T1/2) человеческих мРНК, полученные путем метаанализа 39 полнотранс-криптомных исследований [14]. Списки мРНК, содержащих аденин-уридин-богатые последовательности в 3'-нетранслируемых областях, были получены с сайта AREsite2 (http://rna.tbi.univie.ac.at/AREsite2/welcome). Списки генов-мишеней мкРНК были получены с сайта https://mirdb.org.
Анализ доменной организации белков. Информация по доменной организации интересующих белков была получена с сайта Uniprot (https://www.uniprot.org).
Прочие методы статистического анализа и визуализации данных. Значения случайных величин в независимых выборках сравнивали t-тестом Стьюдента, в зависимых выборках - парным t-тестом. Различия считали значимыми при p < 0,05. Диаграммы Венна строили с помощью онлайн-программы http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/Venn/. Тепловые карты строили с помощью онлайн-программы Morpheus (https:// software.broadinstitute.org/morpheus/).
Таблица 1. Распределение индуцибельных и репрессибельных генов по характеру изменения экспрессии при стимуляции М-триДАП + ЛПС в течение 1 и 4 ч
Изменение экспрессии индуцибельных (репрессибельных) генов* Индуцибельные Репрессибельные
1 ч (И1) 4 ч (И4) 1 ч (Р1) 4 ч (Р4)
ИС > 2 (ИС < 0,5) 182 536 22 612
ИС > 5 (ИС < 0,2) 62 205 2 33
ИС > 10 (ИС < 0,1) 32 112 1 5
ИС > 100 (ИС < 0,01) 5 16 0 0
ИП > 1,2 (ИП > 1,2) 6 64 2 43
Примечание. * - данное изменение экспрессии имеет место у всех исследованных доноров.
Результаты
Сочетанная активация N001 и ТЬЯ4 вызывает разнонаправленные изменения экспрессии генов
В первые 4 ч после начала стимуляции макрофагов комбинацией агонистов NOD1 + TLR4 происходило как биологически значимое повышение, так и понижение экспрессии нескольких сотен генов (табл. 1). Соче-танная стимуляция вызывала понижение экспрессии большего числа генов, чем отдельно взятые агонисты (рис. 1 А, Б), что было отмечено нами ранее для индуцибельных генов [11]. Понижение экспрессии генов развивалось в более поздние сроки активации макрофага, чем повышение.
Так, через 1 ч после начала стимуляции М-триДАП + ЛПС было выявлено 182 индуцибельных гена и всего 22 репрессибельных; через 4 ч численность индуцибельных и репрессибельных генов была сопоставима. После 4 ч стимуляции сочетанием агонистов наблюдалась синергическая индукция и синергическая репрессия некоторых генов. Необходимо отметить, что число генов со значительным (> 5 раз) понижением экспрессии при стимуляции М-триДАП + ЛПС было в 31 раз (через 1 ч) и в 6,2 раз (через 4 ч) меньше, чем число генов с таким же повышением экспрессии. Множества генов с биологически значимой индукцией (И)
и репрессией (Р), сформировавшиеся через 1 и 4 ч стимуляции М-триДАП + ЛПС, далее называются И1, И4, Р1 и Р4 (см. табл. 1).
Основные функциональные характеристики генов множеств И1, И4, Р1 и Р4 приведены в табл. 2 и 3. Множества И1 и И4 были ожидаемо обогащены представителями функциональных наборов Hallmark_TNF_ signaling_via_NFKB, Hallmark_inflammatory_response и Hallmark_interferon_gamma_response, включающих эффекторные гены врожденного иммунного ответа, в том числе гены провоспалительных цитокинов IL1B, IL6, IL12B, IL23A, TNF (см. табл. 2 и 3). Однако в множествах И1 и И4 отсутствовали типичные маркеры М1-активации (CD86, IL12A, NOS2 и др.). В множестве Р1 более половины генов кодировали ДНК-связывающие белки, входящие в набор GOMF_ sequence_specific_DNA_binding (см. табл. 2). Множество Р4 было достоверно обогащено генами, участвующими в клеточном цикле и организации цитоскелета (см. табл. 3). В частности, в Р4 присутствовали гены, кодирующие такие ключевые регуляторы клеточного цикла, как циклины B2 и D2, митотические киназы Aurora A и BUB1B, а также многочисленные структурные и моторные белки цитоскелета, участвующие в митозе. За счет последней подгруппы генов имелось существенное пересечение подмножеств генов клеточ-
э
1 ч
%
4 ч
э
Р4
М-триДАП (5) ЛПС (0)
М-триДАП (348) ЛПС (47)
GOBP_cell_cycle_ GOBP_cytoskeleton_ process (72) organization (87)
М-триДАП + ЛПС (22)
М-триДАП + ЛПС (612)
Рис. 1. Численность генов, характеризующихся биологически значимым понижением экспрессии (репрессибельных) при стимуляции макрофагов агонистами NOD1, TLR4 и их сочетанием
А - через 1 ч; Б - через 4 ч после начала стимуляции; В - пересечение подмножеств генов клеточного цикла и цитоскелета, входящих в число репрессибельных генов через 4 ч после начала стимуляции М-триДАП + ЛПС (множество Р4).
Таблица 2. Представленность генов, входящих в функциональные наборы коллекций Hallmark и C5.GO, в множествах И1 и Р1
Функциональные наборы генов* Число генов в наборе
всего в множестве И1 (182 гена)** в множестве Р4 (22 гена)**
Hallmark TNF signaling via NFKB 188 79 î (p < 2 • 10-306) 0 (p = 0,553)
Hallmark inflammatory response 167 44 î (p = 1,49 • 10-153) 0 (p = 0,577)
Hallmark interferon gamma response 183 20 î (p = 1,09 • 10-25) 0 (p = 0,559)
GOMF sequence specific DNA binding 1068 27 î (p = 4,85 • 10-3) 13 î (p = 1,46 • 10-16)
Примечание. Здесь и в табл. 3: * - показаны только наборы, члены которых составляют > 10 % множеств И1 или Р1; ** - указаны значения р в тесте х2 для сравнений с экспрессирующимися генами, не входящими в множества И1 или Р1. Стрелки - достоверное обогащение (У) и обеднение ({) с учетом множественности сравнений.
ного цикла (GOBP_cell_cycle_process) и цитоскелета (GOBP_cytoskeleton_organization), входящих в множество Р4 (рис. 1В). При стимуляции отдельно взятыми агонистами обогащения представителей указанных наборов среди репрессибельных генов не наблюдалось (данные не представлены). В множествах Р1 и Р4 практически отсутствовали эффекторные гены врожденного иммунного ответа из наборов Hallmark_TNF_signaling_ via_NFKB, Hallmark_inflammatory_response и Hallmark_ interferon_gamma_response (см. табл. 2, 3).
Транскрипционный контроль индуцибельных и репрессибельных генов
Чтобы понять причины разнонаправленных изменений экспрессии индуцибельных и репрессибельных генов, мы проанализировали частоту встречаемости сайтов связывания ФТ в промоторах генов И4 и Р4. Дополнительным множеством сравнения служили гены с конститутивной экспрессией (2321 ген с увеличением или уменьшением экспрессии не более чем в 1,5 раза по сравнению с базальной при любом виде стимуляции у любого донора).
Как видно на рис. 2А, промоторы генов множества И4 были обогащены сайтами связывания ФТ семейств NF-kB (Nuclear Factor-кВ), AP-1 (Activation Protein-1), IRF (Interferon Response Factor), STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription), FOX (Forkhead Box, в частности подсемейство FOXO), известных как активаторы экспрессии провоспалительных генов [1519]. Наряду с этим в промоторах И4 была повышена представленность сайтов связывания ФТ из семейства ядерных рецепторов, обладающих противовоспалительной активностью: NR4A1 (Nuclear Receptor 4A1), RARA (Retinoic Acid Receptor Alpha), VDR (Vitamin D Receptor) [20-23].
Промоторы генов множества Р4 были обогащены сайтами связывания, имеющими в своей основе так называемый E-бокс (последовательность CANNTG, где N - любой нуклеотид). К этой группе ФТ относятся TFAP4 (Transcription Factor AP-4) и ряд других (рис. 2 А). Также в промоторах Р4 чаще встречались сайты связывания ФТ семейств E2F (E2F2), Early growth response (EGR2), Specificity protein (SP1-SP4). Общим свойством этих сайтов является наличие центральной части, образованной остатками гуанина и цитозина.
Наконец, при сравнении с конститутивными генами были выявлены ФТ, сайты связывания которых были представлены достоверно чаще как в Р4, так и в И4, в том числе несколько ФТ, связывающихся с E-боксом, некоторые представители семейства KRAB-ZFP (см. ниже) и ряд других (рис. 2А).
Кроме того, мы проследили изменения экспрессии генов, кодирующих сами ФТ (354 гена). После 1 ч стимуляции М-триДАП + ЛПС биологически значимое повышение экспрессии наблюдалось у 19 генов ФТ, понижение - у 1; после 4 ч стимуляции повышение -у 30 генов ФТ , понижение - у 23 (рис. 2Б). Эффект сочетания агонистов NOD1 + TLR4 в отношении всех перечисленных генов был выше, чем эффект любого из агонистов по отдельности (ИП > 0,5). В число генов ФТ с повышением экспрессии вошли многочисленные активаторы транскрипции провоспалительных цито-кинов, относящиеся к семействам NF-kB (NFKB1, NFKB2, RELA), IRF (IRF1, IRF7, IRF8), CAAT-enhancer-binding protein (CEBPD) [24], AP-1 (JUN, FOSL1).
Наряду с этим возрастала экспрессия ряда генов ФТ с антивоспалительной активностью, таких как MYC
[25], NFIL3 (Nuclear Factor Regulated by Interleukin 3)
[26], NR4A1 [20]. Среди ФТ, характеризующихся понижением экспрессии через 4 ч, выявлено несколько
Таблица 3. Представленность генов, входящих в функциональные наборы коллекций Hallmark и C5.GO, в множествах И4 и Р4
Функциональные наборы генов* Число генов в наборе
всего в множестве И4 (536 генов)** в множестве Р4 (612 генов)**
Hallmark TNF signaling via NFKB 188 104 î (p = 7,47 • 10-253) 3 i (p = 0,027)
Hallmark inflammatory response 167 78 î (p = 1,74 • 10-155) 1 i (p = 7,63 • 10-3)
Hallmark interferon gamma response 183 80 î (p = 2,08 • 10-147) 1 i (p = 4,7 • 10-3)
GOBP cell cycle 1384 55 (p = 0,333) 98 î (p = 4,16 • 10-4)
GOBP cytoskeleton organization 1026 49 (p = 0,632) 87 î (p = 3,13 • 10-7)
GOBP cell cycle_process 962 31 (p = 0,049) 72 î (p = 5,05 • 10-4)
э
Промоторы генов И4
AP-1: Jun, JunB, JunD, Fos, FosL1, FosL2, BATF3 IRF: 1, 2, З, 4, 5, 7, 8, 9 NF-KB: NFKB1, NFKB2, REL, RELA STAT: STAT1::STAT2
ETS: PU.l
FOX: J2, J3, K2, N3, Ol, O3, O4, P1
STAT: 1, 3, 4, 5a::5b, 6 Ядерные рецепторы: NR4A1, RARA, RXRA::VDR Прочие: NFIL3
Промоторы генов И4 и Р4
C/EBP: CEBPA, CEBPG E-box: ASCL2, POU2F2, SNAI1, SNAI3, TCF3, TCF4, TCF12) KRAB-ZFP: ZKSCAN1, ZNF75D, ZNF317
NFAT: NFAT5, NFATc3 Прочие: GFI1
T
Промоторы генов Р4 E2F: E2F2
E-box: MLX, MLXIPL, SREBF1 EGR: EGR2
ETS: ELF4, ETV5, ETV6 SP: SP1, SP2, SP3, SP4
Ядерные рецепторы
Промоторы конститутивных генов
э
1 ч
4 ч
Обогащение
1
o 2
3
М 1
+ 2
Л 3
_I
D
P1 BR
EG CE
LU_L,
L
Обеднение
I Активаторы провоспалительных генов I Репрессоры провоспалительных генов I Смешанная активность I Контроль клеточного цикла
log2 ИС
-4,oo
с П Т~°ТТ1 m
рч J < £
o,oo
о
6,oo
S^QoSSwrn
Рч « > Рч " • '
S
m и " н И
йниоик
Jsa^SBSs
!^«MMMHNNN
Рис. 2. Особенности транскрипционной регуляции генов множеств И4 и Р4 при стимуляции макрофагов сочетанием агонистов NOD1+ TLR4
А - ФТ, сайты связывания которых достоверно чаще представлены в промоторах генов множеств И4 и Р4. Клинья серого цвета обозначают направление сравнений и наличие обогащения/обеднения промоторов соответствующими сайтами. Ярко-красным и ярко-синим цветом выделены ФТ, для которых отмечено соответственно повышение и понижение экспрессии (по данным на рис. 2Б); Б - изменения экспрессии мРНК, кодирующих ФТ, через 1 и 4 ч после начала стимуляции М-триДАП (М), ЛПС (Л) и их сочетанием (М + Л). Цветными полосами выделены функциональные группы ФТ.
известных репрессоров транскрипции провоспалительных цитокинов: FOS [27], FOXN3 [28], GFI1 [29], MAF [30], PPARG [31], RARA [21], VDR [22, 23]. Сайты связывания большинства перечисленных ФТ были обогащены в промоторах генов И4 (см. рис. 2 А).
Таким образом, при стимуляции макрофагов сочетанием агонистов NOD1 + TLR4 наблюдались 3 парал-
лельных процесса, влияющих на экспрессию провоспалительных генов множества И4: 1) «индукция активаторов», возникающая через 1 ч и усиливающаяся через 4 ч после начала стимуляции; 2) «индукция репрессоров», выраженная примерно в равной степени через 1 и 4 ч; 3) «репрессия репрессоров», развивающаяся через 4 ч (рис. 2Б). Первый и третий процессы,
1 ч 4 ч
О M Л М+Л О M Л М+Л
0 -0,34 -0,34 -0,57 0 -0,34 -0,43 -0,67 log2 ИС ±0,34 ±0,4 ±0,49 ±0,44 ±0,53 ±0,70 (М ± g)
10-ii8 g • 10-107 3 • 10-1« 3 • 10-89 3 • 10-100 10-127 p
Гены KRAB-ZFP с биологически значимой репрессией при стимуляции М-триДАП + ЛПС
log2 ИС
-0,00 ^00
Рис. 3. Изменения экспрессии 296 генов, кодирующих белки семейства KRAB-ZFP, при стимуляции макрофагов М-три-ДАП (М), ЛПС (Л) и их сочетанием (М + Л) в течение 1 и 4 ч. Синей полосой выделены гены с биологически значимой репрессией при стимуляции М-триДАП + ЛПС (эти гены входят в множества Р1 и/или Р4). Значения M ± a log2 ИС рассчитаны по всем генам/донорам для данного условия стимуляции. Значения p получены в парном i-тесте при сравнении с нестиму-лированными клетками
представляя собой примеры положительной обратной связи, направлены на увеличение экспрессии провоспалительных генов множества И4 и развиваются в те же сроки, что и синергическое усиление экспрессии провоспалительных генов - между 1 и 4 ч после начала стимуляции [1, 11]. Мы полагаем, что «индукция активаторов» и «репрессия репрессоров» являются одной из причин мощного провоспалительного ответа макрофагов при стимуляции данным сочетанием агонистов.
Напротив, уровни мРНК большинства ФТ, контролирующих экспрессию генов множества Р4, не менялись
или снижались (рис. 2А). Как отмечено выше, множество Р4 включает многочисленные гены клеточного цикла, основными регуляторами экспрессии которых являются ФТ TFAP4 и Myc (сайты их связывания включают E-бокс), а также представители семейств AP-1 и E2F [32-35]. Интересно, что промоторы генов Р4 были достоверно обогащены сайтами связывания TFAP4 и E2F2 (семейство E2F) (см. рис. 2А); при этом экспрессия мРНК, кодирующих TFAP4, E2F2, а также Fos (семейство AP-1) в процессе активации макрофагов уменьшалась (см. рис. 2Б). Кроме этого, как видно на рис. 2Б, в точке 1 ч имело место преходящее увеличение экспрессии мРНК E2F7 - антагониста E2F2 [33], а в точках 1 и 4 ч отмечалось также повышение экспрессии SNAI1 -транскрипционного репрессора, который связывается с E-боксами и может вытеснять из этих сайтов другие ФТ [36]. Можно предположить, что данный комплекс изменений экспрессии ФТ приводит к понижению экспрессии генов множества Р4, в частности генов клеточного цикла, в процессе активации макрофагов.
Таким образом, выявлены существенные различия механизмов регуляции экспрессии генов И4 и Р4.
Экспрессия генов семейства KRAB-ZFP
Белки семейства KRAB-ZFP (Krüppel-Associated Box-Zinc Finger Proteins), содержащие KRAB-домен и цинковые пальцы, являются мощными репрессо-рами транскрипции [37]. Главная функция этих белков состоит в подавлении экспрессии ретроэлементов, присутствующих в геноме, однако они могут ингибировать экспрессию и собственных генов клетки. С помощью цинковых пальцев эти белки узнают целевые последовательности ДНК, тогда как KRAB-домен при помощи адапторного белка KAP-1 привлекает негативные регуляторы транскрипции, в частности гистоновую метилтрансферазу SETDB1 и ДНК-метилтрансферазу DNMT1 [37]. Макрофаги экспрессируют 296 генов KRAB-ZFP (рис. 3). Обращает на себя внимание, что гены KRAB-ZFP составили половину (11 из 22) генов множества Р1 (см. рис. 3), что достоверно больше, чем доля генов KRAB-ZFP среди всех экспрессирующихся генов (p = 2,8 • 10-46). В целом, для множества генов KRAB-ZFP наблюдается статистически значимое понижение экспрессии при стимуляции как отдельными аго-нистами, так и в особенности сочетанием агонистов, хотя биологически значимое снижение экспрессии (> 2 раз у 3 доноров) достигается лишь для небольшой части генов (см. рис. 3). При этом гены KRAB-ZFP полностью отсутствуют среди индуцибельных генов как после 1 ч, так и после 4 ч стимуляции. Можно предположить, что понижение экспрессии KRAB-ZFP способствует общему «растормаживанию» транскрипции эффекторных генов при сочетанной стимуляции макрофагов, приводя в том числе к развитию синергических эффектов.
Вклад посттранскрипционных механизмов в понижение уровней мРНК
Уровни мРНК определяются не только скоростью синтеза de novo, но и скоростью деградации уже син-
Таблица 4. Нормализованные значения стабильности (периода полужизни) мРНК репрессибельных, индуцибельных и конститутивных генов (по данным из [14]), M ± а.
Гены Все** Содержат мотив WWWUUUWWW
да нет p***
Конститутивные (n = 2321) 2,69 ± 4,85 1,86 ± 4,64 4,72 ± 4,78 2,08 • 10-36
Репрессибельные (Р4) (n = 612) -2,43 ± 3,61 (p = 2,62 • 10-121) -2,73 ± 3,54 -1,59 ± 3,67 2,15 • 10-3
Синергически репрессибельные (n = 43)* -4,85 ± 4,53 (p = 3,68 • 10-12) -5,26 ± 4,55 -3,35 ± 4,41 0,304
Индуцибельные (И4) (n = 536) -2,69 ± 4,85 (p = 4,88 • 10-77) -3,14 ± 4,83 -0,43 ± 4,34 4,93 • 10-6
Синергически индуцибельные (n = 64)* -4,78 ± 6,4 (p = 1,22 • 10-10) -5,55 ± 6,2 -0,12 ± 5,91 0,054
Примечание. * При стимуляции М-триДАП + ЛПС в течение 4 ч. ** В скобках - значение р в 1-тесте при сравнении с конститутивными генами. *** Для сравнения генов, содержащих и не содержащих данный мотив, между собой ^-тест).
тезированной мРНК вследствие ее нестабильности и/или связывания с некодирующими РНК. Мы сопоставили стабильность мРНК генов множеств Р4, И4 и конститутивных, используя транскриптомные данные по стабильности мРНК из работы [14]. Оказалось, что наиболее стабильны конститутивные мРНК, тогда как мРНК как репрессибельных, так и индуцибельных генов характеризуются одинаково сниженной стабильностью. Интересно, что наиболее низкой была стабильность мРНК синергически индуцибельных и синерги-чески репрессибельных генов. Объяснить этот парадокс можно исходя из работ, где показано, что основной вклад в изменения уровней мРНК при активации клеток врожденного иммунитета вносит синтез мРНК de novo (транскрипция + сплайсинг), а не стабильность мРНК [38]. Учитывая данные по различиям транскрип-томной регуляции генов И4 и Р4 (см. рис. 2), можно полагать, что скорость синтеза мРНК генов И4 при активации макрофага возрастает и превышает скорость деградации, тогда как у генов Р4 скорость синтеза мРНК не меняется или снижается и процессы деградации преобладают. Интересно, что мРНК репрессибельных ФТ, регулирующих клеточный цикл (E2F2, FOS и TFAP4) характеризовались более низкими значениями стабильности (-5,66, -13,05 и -6,4 [14]), чем среднее значение по множеству Р4 (табл. 4).
На стабильность мРНК негативно влияют аденин-уридин-богатые мотивы вида UUAUUUAUU в 3'-не-транслируемой области мРНК (или, в более общем виде, WWWUUUWWW, где W - аденин или уридин) [39]. Как видно из табл. 4, мРНК, содержащие такой мотив, были действительно менее стабильны, чем не содержащие его, причем как среди конститутивных генов, так и во множествах Р4 и И4. Таким образом, наличие данного мотива является значимой, но не единственной причиной низкой стабильности индуцибельных и репрес-сибельных мРНК.
Кроме того, множество генов Р4 было достоверно обогащено мишенями мкРНК miR-138, miR-302_3P, miR-337, miR-372_3P, miR-373_3P, miR-4292, miR-4315, miR-4505, miR-4731_5P, miR-520_3P, miR-6791_5P, miR-7154_3P. Мы не изучали экспрессию мкРНК, однако из литературы известно, что miR-138, miR-302_3P и miR-520_3P экспрессируются в ЛПС-активированных макрофагах [40-42]. В совокупности
эти 3 мкРНК таргетировали 54 из 612 генов Р4; обогащение по сравнению с экспрессируемыми генами, не входящими в множество Р4, было достоверным (р = 1,79*10-7). По данным предсказательных алгоритмов т 8Шсо (https://mirdb.org), т1Р-302_3Р и т1Я-520_3Р тар-гетируют мРНК ранее упомянутых регуляторов клеточного цикла TFAP4 и E2F2, а также рецептор витамина Б (УОЯ). Экспериментальные данные подтверждают способность miR-302 ингибировать экспрессию мРНК ТЕЛР4 и Е2Е2 [43, 44], а miR-520 - экспрессию мРНК Е2Е2 [45]. Таким образом, наблюдаемое при активации макрофагов понижение экспрессии мРНК ТЕЛР4 и Е2Е2 может быть следствием активности мкРНК.
Обсуждение
При оценке функциональной значимости транскрип-томных данных необходимо учитывать, что между экспрессией мРНК и экспрессией соответствующих белковых продуктов, через которые реализуются функции генов, нет абсолютной корреляции [46]. Глобальный анализ транскриптома и протеома фибробластов позволил выделить 4 группы генов: 1) гены со стабильными мРНК и стабильными белками, обеспечивающие конститутивные метаболические процессы; 2) гены с нестабильными мРНК и нестабильными белками, кодирующие, в частности, ФТ, регуляторы врожденного иммунного ответа и регуляторы клеточного цикла;
3) гены с нестабильными мРНК и стабильными белками, кодирующие регуляторы процессинга РНК;
4) гены со стабильными мРНК и нестабильными белками, кодирующие молекулы адгезии, а также компоненты сигнальных путей [46]. Закономерности, выявленные в работе [46], позволяют более корректно интерпретировать результаты нашей работы.
Сочетание агонистов N001 + TLR4 является мощным активатором макрофагов, вызывающим ярко выраженные изменения экспрессии генов. Мы исследовали относительно краткосрочные (развивающиеся в течение 4 ч) эффекты данного сочетания агонистов на макрофаги. В этих условиях четко выделяются 3 группы генов: 1) индуцибельные гены, кодирующие в том числе медиаторы воспаления и ряд ФТ (см. табл. 2 и 3, рис. 2Б, работу [11]); 2) репрессибельные гены, кодирующие в том числе регуляторы клеточного цикла, белки цитоскелета и некоторые ФТ (см. табл. 2 и 3,
рис. 2Б); 3) конститутивные гены, в число которых входят многие «гены домашнего хозяйства» (данные не представлены). Очевидно, что и индуцибельные, и репрессибельные гены, выявленные в нашей работе, относятся к группе 2 из работы [46] и по своим функциональным характеристикам (кодируют ФТ, регуляторы врожденного иммунного ответа, регуляторы клеточного цикла), и по свойствам мРНК (низкая стабильность по сравнению с конститутивными генами; см. табл. 4). Учитывая низкую стабильность белков, кодируемых генами группы 2 [46], можно полагать, что и повышение, и понижение уровней их мРНК будет достаточно быстро реализовываться в виде соответствующих изменений уровней белков и, следовательно, функций клетки.
Наряду с перечисленными выше сходствами, имеются существенные различия в регуляции экспрессии индуцибельных и репрессибельных генов, позволяющие объяснить различное поведение тех и других в процессе активации макрофага (см. рис. 2А). Индуци-бельные гены ожидаемо регулируются активирующими ФТ семейств NF-kB, AP-1, IRF, STAT. Дополнительный вклад в увеличение экспрессии индуцибельных генов могут вносить механизмы положительной обратной связи, проявляющиеся в индукции позитивных регуляторов и репрессии негативных регуляторов (см. рис. 2Б). Схожие изменения, например повышение экспрессии NF-kB p65 (RelA) и понижение экспрессии VDR при активации макрофагов ЛПС, уже были описаны ранее [47, 48]. Скорость транскрипции индуцибельных генов в этих условиях может резко возрастать, перевешивая низкую стабильность мРНК [38]. Наоборот, экспрессия ФТ, контролирующих репрессибельные гены, в процессе активации макрофагов либо не меняется, либо снижается, как в случае E2F2 и TFAP4 (см. рис. 2). В свою очередь, снижению экспрессии мРНК E2F2 и TFAP4 может способствовать низкая стабильность их мРНК и влияние мкРНК, в частности miR-302_3P и miR-520_3P. Эти процессы могут вызывать уменьшение
■ Литература/References
1. Budikhina A.S., Murugina N.E., Maximchik P. V., Dagil Y.A., Nikolaeva A.M., Balyasova L.S., Murugin V.V., Selezneva E.M., Pash-chenkova Y.G., Chkadua G.Z., Pinegin B.V., Pashenkov M.V. Interplay between NOD1 and TLR4 Receptors in Macrophages: Nonsyner-gistic Activation of Signaling Pathways Results in Synergistic Induction of Proinflammatory Gene Expression. J Immunol. 2021; 206 (9): 2206-20. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.2000692
2. Fritz J.H., Girardin S.E., Fitting C., Werts C., Mengin-Lecreulx D., Caroff M., Cavaillon J.M., Philpott D.J., Adib-Conquy M. Synergistic stimulation of human monocytes and dendritic cells by Toll-like receptor 4 and NOD1- and NOD2-activating agonists. Eur J Immunol. 2005; 35 (8): 2459-70. DOI: https://doi.org/10.1002/eji.200526286
3. van Heel D.A., Ghosh S., Butler M., Hunt K., Foxwell B.M.J., Mengin-Lecreulx D., Playford R.J. Synergistic enhancement of Toll-like receptor responses by NOD1 activation. Eur J Immunol. 2005; 35 (8): 2471-6. DOI: https://doi.org/10.1002/eji.200526296
4. Пичугин А.В., Багаев А.В., Лебедева Е.С., Чулкина М., Атаул-лаханов Р.И. Синергическая продукция цитокинов дендритными клетками в ответ на одновременную активацию парами агонистов различных рецепторов врожденного иммунитета. Иммунология. 2017; 38 (2): 118-23. DOI: https://doi.org/10.18821/0206-4952-2017-
транскрипции репрессибельных генов, что в совокупности с низкой стабильностью их мРНК может приводит к наблюдаемому снижению экспрессии.
Представляется, что снижение экспрессии генов позволяет макрофагу отключить ненужные в данный момент биологические процессы и перенаправить свои ресурсы на выполнение эффекторных функций, контролируемых индуцибельными генами. Выявленная нами репрессия генов клеточного цикла согласуется с литературными данными: известно, что макрофагальные ростовые факторы ГМ-КСФ (использованный в нашей работе) и М-КСФ вызывают ограниченную пролиферацию макрофагов, тогда как провоспалительные стимулы ее отменяют [34, 49].
Поведение макрофагов обычно пытаются рассматривать в рамках парадигмы М1/М2, или классической и альтернативной активации. По нашим наблюдениям, в макрофагах, активированных как отдельно взятыми агонистами NOD1 и TLR4, так и их сочетанием, не происходит биологически значимого повышения экспрессии генов ключевых маркеров М1-активации -CD86, IL12A, NOS2 и ряда других. Классическим индуктором М1-активации является ИФН-у в сочетании с ЛПС, тогда как активация под действием агонистов NOD1 + TLR4, характеризующаяся повышением экспрессии генов провоспалительных цитокинов (но не IL12A), удовлетворяет критериям «врожденной активации», индукторами которой являются агонисты пат-терн-распознающих рецепторов в отсутствие ИФН [50].
Выводы
1. Комбинация агонистов рецепторов NOD1 и TLR4 вызывает транскрипционное репрограммирование макрофагов человека по врожденному типу.
2. С помощью методов биоинформатики выявлены особенности функциональных свойств и регуляции индуцибельных и репрессибельных генов при активации макрофагов данным сочетанием агонистов.
38-2-118-123 [Pichugin A.V., Bagaev A.V., Lebedeva E.S., Chulkina M., Ataullakhanov R.I. Synergistic cytokine production by murine dendritic cells in response to their simultaneous activation with pairs of agonists of different innate immune receptors. Immunologiya. 2017; 38 (2): 118-23. DOI: https://doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-2-118-123 (in Russian)]
5. Tukhvatulin A., Dzharullaeva A., Erokhova A., Zemskaya A., Balyasin M., OzharovskaiaT., Zubkova O., ShevlyaginaN., Zhukhovitsky V., Fedyakina I., Pruss I., Shcheblyakov D., Naroditsky B., Logunov D., Gintsburg A. Adjuvantation of an influenza hemagglutinin antigen with TLR4 and NOD2 agonists encapsulated in poly(D,l-lactide-co-glycolide) nanoparticles enhances immunogenicity and protection against lethal influenza virus infection in mice. Vaccines. 2020; 8 (3): 1-28. DOI: https://doi. org/10.3390/vaccines8030519
6. Tukhvatulin A.I., Gitlin I.I., Shcheblyakov D. V., Artemicheva N.M., Burdely L.G., Shmarov M.M., Naroditsky B.S., Gudkov A.V., Gints-burg A.L., Logunov D.Y. Combined stimulation of Toll-like receptor 5 and Nod1 strongly potentiates activity of NF-kB, resulting in enhanced innate immune reactions and resistance to Salmonella enterica serovar typhimurium infection. Infect. Immun. 2013; 81 (10): 3855-64. DOI: https://doi.org/10.1128/IAI.00525-13
7. Takada H., Galanos C. Enhancement of endotoxin lethality and generation of anaphylactoid reactions by lipopolysaccharides in muramyl-dipeptide-treated mice. Infect. Immun. 1987; 55 (2): 409-13. DOI: https:// doi.org/10.1128/iai.55.2.409-413.1987
8. Murch O., Abdelrahman M., Kapoor A., Thiemermann C. Muramyl dipeptide enhances the response to endotoxin to cause multiple organ injury in the anesthetized rat. Shock. 2008; 29 (3): 388-94. DOI: https:// doi.org/10.1097/SHK.0b013e3181453e59
9. Poltorak A., He X., Smirnova I., Liu M.Y., Van Huffel C., Du X., Birdwell D., Alejos E., Silva M., Galanos C., Freudenberg M., Ricciardi-Castagnoli P., Layton B., Beutler B. Defective LPS signaling in C3H/ HeJ and C57BL/10ScCr mice: Mutations in Tlr4 gene. Science 1998; 282 (5396): 2085-8. DOI: https://doi.org/10.1126/science.282.5396.2085
10. Girardin S.E., Travassos L.H., Hervé M., Blanot D., Boneca I.G., Philpott D.J., Sansonetti P.J., Mengin-Lecreulx D. . Peptidoglycan Molecular Requirements Allowing Detection by Nod1 and Nod2. J Biol Chem. 2003; 278 (43): 41702-8. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.M307198200
11. Масютина А.М., Пащенков М.В. Транскрипционный ответ макрофагов на сочетанную стимуляцию NOD-подобного и Toll-подобного рецептора. Иммунология 2023; 44 (4): 408-18. DOI: https:// doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-4-408-418 [Masyutina A.M., Pash-enkov M.V. Transcriptional response of macrophages to combined stimulation of a NOD-like and a Toll-like receptor. Immunologiya. 2023; 44 (4): 408-18. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-4-408-418 (in Russian)]
12. Benjamini Y., Hochberg Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. J R Stat Soc Ser
B. 1995; 57 (1): 289-300. DOI: https://doi.org/10.1111/j.2517-6161.1995. tb02031.x
13. Gearing L.J., Cumming H.E., Chapman R., Finkel A.M., Wood-house I.B., Luu K., Gould J.A., Forster S.C., Hertzog P.J. Cillder: A tool for predicting and analysing transcription factor binding sites. PLoS One. 2019; 14 (9): e0215495. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0215495
14. Agarwal V., Kelley D.R. The genetic and biochemical determinants of mRNA degradation rates in mammals. Genome Biol. 2022; 23 (1): 245. DOI: https://doi.org/10.1186/S13059-022-02811-X
15. Vallabhapurapu S., Karin M. Regulation and function of NF-kB transcription factors in the immune system. Annu Rev Immunol. 2009; 27: 693-733. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev.immunol.021908.132641
16. Wang Q., Ni H., Lan L., Wei X., Xiang R., Wang Y. Fra-1 protoon-cogene regulates IL-6 expression in macrophages and promotes the generation of M2d macrophages. Cell Res. 2010; 20 (6): 701-12. DOI: https://doi. org/10.1038/CR.2010.52
17. Matsumoto M., Einhaus D., Gold E.S., Aderem A. Simvastatin augments lipopolysaccharide-induced proinflammatory responses in macrophages by differential regulation of the c-Fos and c-Jun transcription factors. J Immunol. 2004; 172 (12): 7377-84. DOI: https://doi.org/10.4049/ jimmunol.172.12.7377
18. Chistiakov D.A., Myasoedova V.A., Revin V. V., Orekhov A.N., Bobryshev Y.V. The impact of interferon-regulatory factors to macrophage differentiation and polarization into M1 and M2. Immunobiology. 2018; 223 (1): 101-11. DOI: https://doi.org/10.1016/j.imbio.2017.10.005
19. Graves D.T., Milovanova T.N. Mucosal Immunity and the FOXO1 Transcription Factors. Front Immunol. 2019; 10: 2530. DOI: https://doi. org/10.3389/fimmu.2019.02530
20. Murphy E.P., Crean D. Molecular interactions between NR4A orphan nuclear receptors and NF-kB are required for appropriate inflammatory responses and immune cell homeostasis. Biomolecules. 2015; 5 (3): 1302-18. DOI: https://doi.org/10.3390/biom5031302
21. Galvin K.C., Dyck L., Marshall N.A., Stefanska A.M., Walsh K.P., Moran B., Higgins S.C., Dungan L.S., Mills K.H.G. Blocking retinoic acid receptor-a enhances the efficacy of a dendritic cell vaccine against tumours by suppressing the induction of regulatory T cells. Cancer Immunol Immu-nother. 2013; 62 (7): 1273-82. DOI: https://doi.org/10.1007/S00262-013-1432-8
22. Gynther P., Toropainen S., Matilainen J.M., Seuter S., Carlberg
C., Väisänen S. Mechanism of 1a,25-dihydroxyvitamin D(3)-dependent repression of interleukin-12B. Biochim Biophys Acta. 2011; 1813 (5): 810-8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2011.01.037
23. Rafique A., Rejnmark L., Heickendorff L., Möller H.J. 25(OH)D3 and 1.25(OH)2D3 inhibits TNF-a expression in human monocyte derived macrophages. PLoS One. 2019; 14 (4): e0215383. DOI: https://doi. org/10.1371/journal.pone.0215383
24. Litvak V., Ramsey S.A., Rust A.G., Zak D.E., Kennedy K.A., Lampano A.E., Nykter M., Shmulevich I., Aderem A. Function of C/EBPS in a regulatory circuit that discriminates between transient and persistent TLR4-induced signals. Nat Immunol. 2009; 10 (4): 437-43. DOI: https:// doi.org/10.1038/ni.1721
25. Pello O.M. Macrophages and c-Myc cross paths. Oncoim-munology. 2016; 5 (6): e1151991. DOI: https://doi.org/10.1080/2162 402x.2016.1151991
26. Kobayashi T., Matsuoka K., Sheikh S.Z., Elloumi H.Z., Kamada N., Hisamatsu T., Hansen J.J., Doty K.R., Pope S.D., Smale S.T., Hibi T., Rothman P.B., Kashiwada M., Plevy S.E. NFIL3 is a regulator of IL-12 p40 in macrophages and mucosal immunity. J Immunol. 2011; 186 (8): 4649-55. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.1003888
27. Ray N., Kuwahara M., Takada Y., Maruyama K., Kawaguchi T., Tsubone H., Ishikawa H., Matsuo K. c-Fos suppresses systemic inflammatory response to endotoxin. Int Immunol. 2006; 18 (5): 671-7. DOI: https:// doi.org/10.1093/intimm/dxl004
28. Zhu X., Huang B., Zhao F., Lian J., He L., Zhang Y. Ji L., Zhang J., Yan X., Zeng T., Ma C., Liang Y., Zhang C., Lin J. p38-mediated FOXN3 phosphorylation modulates lung inflammation and injury through the NF-kB signaling pathway. Nucleic Acids Res. 2023; 51 (5): 2195-214. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gkad057
29. Sharif-Askari E., Vassen L., Kosan C., Khandanpour C., Gaud-reau M.-C., Heyd F., Okayama T., Jin J., Rojas M.E.B., Grimes H.L., Zeng H., Möröy T. Zinc finger protein Gfi1 controls the endotoxin-medi-ated Toll-like receptor inflammatory response by antagonizing NF-kappaB p65. Mol Cell Biol. 2010; 30 (16): 3929-42. DOI: https://doi.org/10.1128/ mcb.00087-10
30. Cao S., Liu J., Chesi M., Bergsagel P.L., Ho I.-C., Donnelly R.P., Ma X. Differential regulation of IL-12 and IL-10 gene expression in macrophages by the basic leucine zipper transcription factor c-Maf fibrosarcoma. J Immunol. 2002; 169 (10): 5715-25. DOI: https://doi.org/10.4049/ jimmunol.169.10.5715
31. Ricote M., Li A.C., Willson T.M., Kelly C.J., Glass C.K. The peroxisome proliferator-activated receptor-gamma is a negative regulator of macrophage activation. Nature. 1998; 391 (6662): 79-82. DOI: https:// doi.org/10.1038/34178
32. Wong M.M.K., Joyson S.M., Hermeking H., Chiu S.K. Transcription factor AP4 mediates cell fate decisions: to divide, age, or die. cancers (Basel). 2021; 13 (4): 1-15. DOI: https://doi.org/10.3390/cancers13040676
33. Chen H.Z., Tsai S.Y., Leone G. Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control. Nat Rev Cancer. 2009; 9 (11): 785. DOI: https://doi.org/10.1038/nrc2696
34. Liu L., Luc Y., Martinez J., Bi Y., Lian G., Wang T., Milasta S., Wang J., Yang M., Liu G., Green D.R., Wang R. Proinflammatory signal suppresses proliferation and shifts macrophage metabolism from Myc-dependent to HIF1a-dependent. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 2016; 113 (6): 1564-9. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.1518000113
35. Eferl R., Wagner E.F. AP-1: a double-edged sword in tumorige-nesis. Nat. Rev. Cancer. 2003; 3 (11): 859-68. DOI: https://doi.org/10.1038/ NRC1209
36. Rönsch K., Jägle S., Rose K., Seidl M., Baumgartner F., Freihen V., Yousaf A., Metzger E., Lassmann S., Schüle R., Zeiser R., Michoel T., Hecht A. SNAIL1 combines competitive displacement of ASCL2 and epigenetic mechanisms to rapidly silence the EPHB3 tumor suppressor in colorectal cancer. Mol. Oncol. 2015; 9 (2): 335-54. DOI: https://doi. org/10.1016/J.molonc.2014.08.016
37. Sobocinska J., Molenda S., Machnik M., Oleksiewicz U. KRAB-ZFP transcriptional regulators acting as oncogenes and tumor suppressors: an overview. Int J Mol Sci. 2021; 22 (4): 1-27. DOI: https://doi. org/10.3390/ijms22042212
38. Rabani M., Levin J.Z., Fan L., Adiconis X., Raychowdhury R., Garber M., Gnirke A., Nusbaum C., Hacohen N., Friedman N., Amit I., Regev A. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 2011; 29 (5): 436-42. DOI: https://doi.org/10.1038/nbt.1861
39. Zubiaga A.M., Belasco J.G., Greenberg M.E. The nonamer UUAUUUAUU is the key AU-rich sequence motif that mediates mRNA degradation. Mol Cell Biol. 1995; 15 (4): 2219-30. DOI: https://doi. org/10.1128/mcb.15.4.2219
40. Bai X.Z., Zhang J.L., Liu Y., Zhang W., Li X.Q., Wang K.J., Cao M.Y., Zhang J.N., Han F., Shi J.H., Hu D.H. MicroRNA-138 Aggravates inflammatory responses of macrophages by targeting SIRT1 and
regulating the NF-kB and AKT pathways. Cell Physiol Biochem. 2018; 49 (2): 489-500. DOI: https://doi.org/10.1159/000492988
41. Huang T., Pu Q., Zhou C., Lin P., Gao P., Zhang X., Chu Y., Yue B., Wu M. MicroRNA-302/367 cluster impacts host antimicrobial defense via regulation of mitophagic response against Pseudomonas aeruginosa infection. Front Immunol. 2020; 11: 569173. DOI: https://doi. org/10.3389/fimmu.2020.569173
42. Du J., Jiang H., Wang B. Long Non-coding RNA GAS5/miR-520-3p/S0CS3 axis regulates inflammatory response in lipopolysaccha-ride-induced macrophages. Biochem Genet. 2022; 60 (5): 1793-808. DOI: https://doi.org/10.1007/S10528-021-10179-Z
43. Ma W., Liu B., Li J., Jiang J., Zhou R., Huang L., Li X., He X., Zhou Q. MicroRNA-302c represses epithelial-mesenchymal transition and metastasis by targeting transcription factor AP-4 in colorectal cancer. Biomed Pharmacother. 2018; 105: 670-6. DOI: https://doi.org/10.1016/J. Biopha.2018.06.025
44. Gao X., Wang X.L. Dexmedetomidine promotes ferroptotic cell death in gastric cancer via hsa_circ_0008035/miR-302a/E2F7 axis. Kaoh-siung J Med Sci. 2023; 39 (4): 390-403. DOI: https://doi.org/10.1002/ kjm2.12650
45. Dong Y., Zou J., Su S., Huang H., Deng Y., Wang B., Li W. MicroRNA-218 and microRNA-520a inhibit cell proliferation by down-
Сведения об авторах
Масютина Анна Михайловна - мл. науч. сотр. лаб. клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1904-6714
Пащенков Михаил Владимирович - д-р мед. наук, и.о. зав. лаб. клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; проф. каф. иммунологии МБФ ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пиро-гова Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6995-1790
regulating E2F2 in hepatocellular carcinoma. Mol Med Rep. 2015; 12 (1): 1016-22. DOI: https://doi.org/10.3892/mmr.2015.3516
46. Schwanhausser B., Busse D., Li N., Dittmar G., Schuchhardt J., Wolf J., Chen W., Selbach M. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 2011; 473 (7347): 337-42. DOI: https://doi. org/10.1038/nature10098
47. Sung M.H., Li N., Lao Q., Gottschalk R.A., Hager G.L., Fraser I.D.C. Switching of the relative dominance between feedback mechanisms in lipopolysaccharide-induced NF-kB signaling. Sci Signal. 2014; 7 (308): ra6. DOI: https://doi.org/10.1126/scisignal.2004764
48. Pramanik R., Asplin J.R., Lindeman C., Favus M.J., Bai S., Coe F.L. Lipopolysaccharide negatively modulates vitamin D action by down-regulating expression of vitamin D-induced VDR in human monocytic THP-1 cells. Cell. Immunol. 2004; 232 (1-2): 137-43. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.cellimm.2005.03.004
49. Draijer C., Penke L.R.K., Peters-Golden M. Distinctive effects of GM-CSF and M-CSF on proliferation and polarization of two major pulmonary macrophage populations. J Immunol. 2019; 202 (9): 2700-9. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.1801387
50. Gordon S., Taylor P.R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev Immunol. 2005; 5 (12): 953-64. DOI: https://doi.org/10.1038/ nri1733
Authors' information
Anna M. Masyutina - Junior Researcher of Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1904-6714
Mikhail V. Pashenkov - MD, PhD, Acting Head of Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Prof. of the Immunology Chair, MBF, N.I. Pirogov RNRMU of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6995-1790
