ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ ОТВЕТ МАКРОФАГОВ НА СОЧЕТАННУЮ СТИМУЛЯЦИЮ NOD- И TOLL-ПОДОБНОГО РЕЦЕПТОРА МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

© Коллектив авторов, 2023 Масютина А.М., Пащенков М.В.

Транскрипционный ответ макрофагов на сочетанную стимуляцию NOD- и Toll-подобного рецептора

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация

Резюме

Введение. Активация клеток врожденного иммунитета агонистами двух и более паттерн-распознающих рецепторов может приводить к взаимному ослаблению или усилению активационных сигналов. На основании анализа экспрессии отдельных генов считается, что при сочетанной стимуляции NOD- и Toll-подобных рецепторов происходит синергическое увеличение клеточного ответа (эффект сочетания агонистов больше, чем сумма эффектов отдельно взятых агонистов). Однако данное положение до сих пор не было проверено путем полнотранскриптомного анализа.

Цель исследования - провести полнотранскриптомный анализ макрофагов человека, активированных сочетанием агонистов рецепторов NOD1 и TLR4 in vitro.

Материал и методы. Макрофаги получали путем культивирования моноцитов крови здоровых доноров с гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором, после чего стимулировали агонистами NOD1 и TLR4 раздельно и в сочетании в течение 1 и 4 ч. Транскриптомы анализировали с помощью высокопроизводительного секвенирования РНК (RNA-seq) и ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Для выявления синергически индуцируемых генов рассчитывали индексы потенцирования (отношение ответа на сочетание агонистов к сумме ответов на отдельные агонисты).

Результаты. Синергически индуцируемые гены составили не более 10 % от числа всех генов, индуцируемых агонистами NOD1 и/или TLR4 раздельно и в сочетании. Отличительными особенностями синергически индуцируемых генов являются низкая базальная экспрессия и высокий ответ на стимуляцию сочетанием агонистов. Несмотря на относительную малочисленность, данная группа генов имеет большое функциональное значение, так как включает в себя гены основных провоспалительных цитокинов. Результаты биоин-форматического анализа указывают на роль факторов транскрипции семейств NF-kB и AP-1 в регуляции экспрессии синергически индуцируемых генов.

Заключение. Знания о характеристиках и механизмах синергических эффектов позволят выбрать правильные мишени для подавления гиперпродукции цитокинов при «цитокиновом шторме», а также подобрать наиболее подходящие комбинации агонистов для их терапевтического использования в клинических ситуациях, требующих усиления врожденного иммунного ответа.

Ключевые слова: макрофаги; транскриптом; секвенирование РНК; NOD1; TLR4; синергизм

Статья получена 26.04.2023. Принята в печать 27.05.2023.

Для цитирования: Масютина А.М., Пащенков М.В. Транскрипционный ответ макрофагов на сочетанную стимуляцию NOD- и Toll-подобного рецептора. Иммунология. 2023; 44 (4): 408-418. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2023-44-4-408-418

Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 21-15-00211. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Для корреспонденции

Пащенков Михаил Владимирович -доктор медицинских наук, и.о. заведующего лабораторией клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6995-1790

Вклад авторов. Постановка экспериментов и анализ результатов ментов, анализ результатов и написание статьи - Пащенков М.В.

Масютина А.М.; планирование экспери-

Masyutina A.M., Pashenkov M.V.

Transcriptional response of macrophages to combined stimulation of a NOD- and a Toll-like receptor

National Research Center - Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation

Abstract

Introduction. Activation of innate immune cells by agonists of two or more pattern-recognition receptors can result in mutual blunting or enhancement of activation signals. Based on expression of selected genes, it is assumed that combined stimulation of NOD- and Toll-like receptors results in synergistic enhancement of cellular response (the effect of agonist combination is greater than sum of effects of individual agonists). However, this assumption has not been tested using whole-transcriptome analysis.

Aim - to conduct whole transcriptome analysis of human macrophages activated by a combination of NOD1 and TLR4 receptor agonists in vitro.

Material and methods. Macrophages were obtained by culturing of healthy donor blood monocytes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factors and stimulated by agonists of NOD1 and TLR4 separately or in combination for 1 and 4 h. Transcriptomes were evaluated using high-throughput RNA sequencing (RNA-seq) and real-time PCR (RT-PCR). To identify synergistically inducible genes, potentiation indices were calculated (response to agonist combination divided by sum of responses to separate agonists).

Results. Synergisticall inducible genes comprised no more than 10 % of all genes induced by NOD1 and/or TLR4 agonists separately or in combination. Typical features of synergisti-cally inducible genes were low basal expression and high response to combined stimulation. Despite their relatively low number, this group of genes is of great functional importance, because it includes genes of key pro-inflammatory cytokines. Results of bioinformatic analysis point at the role of NF-kB and AP-1 transcription factor families in the regulation of expression of synergistically inducible genes.

Conclusion. Knowledge of characteristics and mechanisms of synergistic effects will allow to select appropriate targets to suppress excessive cytokine production during cytokine storm, as well as to choose appropriate agonist combinations for therapeutic application in clinical situations demanding enhancement of innate immune response.

Keywords: macrophages; transcriptome; RNA sequencing; NOD1; TLR4; synergy

Received 26.04.2023. Accepted 27.05.2023.

For citation: Masyutina A.M., Pashenkov M.V. Transcriptional response of macrophages to combined stimulation of a NOD-like and a Toll-like receptor. Immunologiya. 2023; 44 (4): 408-18. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-4-408-418 (in Russian)

Funding. The work was supported by the Russian Science Foundation grant No. 21-15-00211. Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.

Authors' contribution. Conducting experiments and analysing results - Masyutina A.M.; designing experiments, analysing results and writing the article - Pashenkov M.V.

For correspondence

Mikhail V. Pashenkov -MD, PhD, Acting Head of the Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6995-1790

Введение

Типовые молекулярные структуры микробов выступают в роли активационных лигандов паттерн-распознающих рецепторов (ПРР) клеток врожденного иммунитета. Однако при инфекционных заболеваниях происходит активация не одного ПРР, а их сочетаний, зависящих от типа патогена. Параметры врожденного иммунного ответа на патогены определяются взаимодействиями сигналов от различных рецепторов. Однако механизмы кооперации ПРР изучены значительно хуже, чем механизмы функционирования отдельно взятых рецепторов.

Стимуляция ПРР из семейства То11-подобных рецепторов (ТЬЯ), а также N001 и N002 из семейства N0D-подобных рецепторов (^ЫЬЯ) активирует экспрессию многочисленных генов врожденного иммунного

ответа. Многими авторами, в том числе нами, отмечено, что при сочетанной активации пар рецепторов NOD1 + TLR и NOD2 + TLR происходит синергическое увеличение экспрессии и продукции провоспалительных цитокинов [1-8].

Под синергизмом понимают такое взаимодействие сигналов, при котором эффект одновременной активации двух рецепторов больше, чем сумма эффектов активации каждого рецептора по отдельности. Так, при активации макрофагов сочетанием агонистов TLR4 и NOD1 происходит синергическое увеличение экспрессии мРНК провоспалительных цитокинов, кодируемых генами IL1B, IL6, IL12B, IL23A, TNF [1]. Подобные синергические эффекты могут играть пагубную роль при инфекционных заболеваниях, приводя к развитию «цитокинового шторма» [9, 10]. Однако мы обнаружили, что многие другие акти-

вационные процессы в макрофагах, в частности активация NF-кВ-зависимого сигнального пути, усиление гликолиза, увеличение экспрессии ряда индуцибельных генов, увеличение противоопухолевой активности, при сочетанной стимуляции NOD1 и TLR4 регулируются несинергическим образом [1]. Эти данные позволили предположить, что эффект синергизма при одновременной стимуляции TLR4 и NOD1 ограничен сравнительно небольшой подгруппой индуцибельных генов.

Для проверки этого предположения мы провели полнотранскриптомный анализ макрофагов при соче-танной активации рецепторов TLR4 и NOD1 in vitro. Выбор сочетания TLR4 + NOD1 обусловлен тем, что эти рецепторы играют ключевую роль во врожденном иммунном ответе против грам-отрицательных бактерий: TLR4 распознает липополисахарид (ЛПС), а NOD1 -фрагменты пептидогликана грам-отрицательных бактерий [11, 12]. В качестве агониста NOD1 использовали синтетический фрагмент пептидогликана -^ацетил-Э-мурамил-Ь-аланил-Э-изоглутамил-.мезо-диаминопимелиновую кислоту (М-триДАП), в качестве агониста TLR4 - ЛПС E. coli O111:B4. Поскольку синергическое нарастание экспрессии мРНК цитокинов происходит в период между 1 и 4 ч после начала стимуляции NOD1 + TLR4 [1], эти две точки были выбраны для исследования транскриптомов в настоящей работе.

Материал и методы

Реактивы. Синтетический М-триДАП и ультрачистый ЛПС E. coli O111:B4 были закуплены у фирмы InvivoGen (США), рекомбинантный человеческий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимули-рующий фактор (ГМ-КСФ) - у Miltenyi Biotec (ФРГ). Полная культуральная среда (ПКС) представляла собой RPMI-1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина и 10 % фетальной телячьей сыворотки (все Thermo Fisher Scientific, США).

Доноры крови. Для проведения полнотранскрип-томного анализа (RNA-seq) была получена венозная гепаринизированная кровь от 3 здоровых доноров из числа сотрудников лаборатории. Для подтверждающих экспериментов (ПЦР-РВ) была получена кровь еще от 40 здоровых доноров. Исследование было одобрено Локальным комитетом по этике ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России» (протокол 10/2017). Все доноры дали информированное согласие на участие в исследовании.

Культивирование и стимуляция макрофагов. Макрофаги получали, как описано ранее [13], и высевали в 24-луночный планшет по 2-105 клеток в 400 мкл ПКС на лунку. На следующие сутки к клеткам добавляли М-триДАП (10 мкг/мл) и ЛПС (10 нг/мл) раздельно и в сочетании либо оставляли без агонистов для оценки базальной экспрессии. Через 1 и 4 ч после начала стимуляции клетки лизировали для выделения мРНК.

Исследование транскриптомов макрофагов с помощью RNA-seq. Процедура получения библио-

тек кДНК для RNA-seq описана ранее [13]. Библиотеки секвенировали на приборе Illumina NovaSeq 6000 (Евроген, Москва, Россия) в формате односторонних прочтений длиной 100 пар оснований. Выравнивание прочтений на транскриптом человека (ftp://ftp.ensembl. org/pub/release-98/fasta/homo_sapiens/cdna/Homo_ sapiens.GRCh38.cdna.abinitio.fa.gz), а также подсчет числа прочтений на ген (counts) выполняли с помощью программного пакета Salmon [14]. Доля успешно выравненных прочтений во всех библиотеках составила > 90 %. Прочтения, относящиеся к различным вариантам мРНК одного и того же гена, суммировали.

Анализ данных RNA-seq. Для анализа были отобраны 11 839 наиболее представленных белок-коди-рующих генов (не менее 50 «сырых» прочтений на ген хотя бы в одном образце у каждого из трех доноров). Чтобы избежать деления на 0 при расчете индексов стимуляции, нулевые значения числа прочтений заменяли на 1. Нормализованную экспрессию генов выражали в виде числа прочтений, деленного на миллион всех прочтений в данной библиотеке и на длину гена в килобазах (reads per kilobase per million, RPKM). Длины генов определяли с помощью программного пакета GTFtools (https://www.genemine.org/gtftools. php) как средние значения длин сплайс-вариантов мРНК.

В каждом эксперименте для каждого гена, точки и агониста вычисляли индексы стимуляции (ИС) по формуле:

ИС = RPKM

/ RPKM„.

где RPKM

- экспрессия гена после стимуляции

агонистом или их сочетанием, RKPM0 - базальная экспрессия данного гена у того же донора в той же временной точке. Увеличение экспрессии гена, вызванное данным агонистом в данной точке, считали биологически значимым при ИС > 2 у всех трех доноров.

Было обнаружено 637 генов, удовлетворявших данному условию хотя бы в одной точке при стимуляции хотя бы одним агонистом либо их сочетанием. Эти гены сформировали подмножество индуцибельных генов.

Чтобы оценить взаимодействие сигналов от N001 и TLR4, рассчитывали индексы потенцирования (ИП), известные также как индексы синергизма, по формуле:

ИП = Ответ,, / (Ответ,, „дгт + ОтветПГ1 „),

—"Ттлтг^гттг^ \ М-триДАП ЛПС'*

М-триДАП+ЛПС

где Ответ = ^КМ - RPKM„) / RPKM„ =

агонист 4 агонист 0У 0

ИС - 1.

агонист

ИП для данного гена/точки рассчитывали только при наличии биологически значимой индукции хотя бы одним агонистом или их сочетанием. Чтобы избежать отрицательных значений ИП, отрицательные значения ответов приравнивали к нулю. Если ответы на оба отдельно взятых агониста были нулевыми, а ответ на сочетание агонистов - ненулевым, во избежание деления на 0 значением ИП считали значение

ответа на сочетание агонистов (ИП = ИС.. „.„,_„„ -

v М-триДАП+ЛПС

1). Достоверность отличия ИП от 1 для данного гена в данной точке оценивали с помощью парного /-теста по трем экспериментам. Использовали два определения синергически индуцируемых генов: 1) средний ИП > 1 (по трем экспериментам) при p < 0,05; 2) ИП > 1,2 в каждом из трех опытов независимо от значения p.

Анализ функциональной принадлежности генов. Использовали аннотированные функциональные наборы генов, опубликованные на сайте Gene set enrichment analysis (https://www.gsea-msigdb.org/gsea/ msigdb/genesets.jsp), из коллекций Hallmark (50 наборов генов, участвующих в основных биологических процессах) и C3.TFT (1134 набора генов, являющихся мишенями определенных факторов транскрипции). Из наборов исключали гены, не входящие в список 11 839 генов, экспрессируемых в макрофагах. Обогащение или обеднение представителей данного функционального набора в данном множестве генов по сравнению другим множеством оценивали с помощью теста х2. Множественность сравнений учитывали по процедуре Беньямини-Хохберга [15] с пороговым уровнем достоверности q = 0,05.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ). Данные по экспрессии мРНК отдельных генов были валидированы с помощью ПЦР-РВ в независимых экспериментах, поставленных по вышеописанной схеме. Условия ПЦР-РВ описаны ранее [1]. Определение экспрессии мРНК IL6 и TNF было выполнено у 40 доноров, IL12B и IL23A -у 21 донора.

Анализ сайтов связывания факторов транскрипции. Использовали программу CiiiDER [16], как описано ранее [13]. Численность генов, содержащих в промоторе хотя бы один данный сайт связывания, в множествах генов 1 и 2 сравнивали тестом х2. Учитывали сайты связывания только тех факторов транскрипции, которые экспрессировались в макрофагах (354 разновидности). Множественность сравнений учитывали по процедуре Беньямини-Хохберга с q = 0,05.

Прочие методы статистического анализа и визуализации данных. Значения случайных величин в независимых выборках сравнивали с помощью /-теста Стьюдента. Распределения случайных величин сравнивали с помощью теста Колмогорова-Смирнова. Различия считали значимыми при p < 0,05. Диаграммы Венна строили с помощью онлайн-программы http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/.

Результаты

Численность индуцибельных генов в макрофагах, активированных агонистами рецепторов NOD1 и TLR4

Анализ кооперации NOD1 и TLR4 проводили на подмножестве 637 индуцибельных генов, сформированном по критериям, описанным в разделе «Мате-

риал и методы». Сочетание М-триДАП + ЛПС вызывало биологически значимое повышение экспрессии большего числа генов, чем любой из двух агонистов по отдельности (рис. 1А, Б). Существенная доля генов, отвечающих на М-триДАП + ЛПС, не отвечала на отдельно взятые агонисты (54 из 182 в точке 1 ч, 112 из 536 в точке 4 ч). Однако большинство генов, характеризующихся значимым ответом на М-триДАП + ЛПС, отвечало на стимуляцию одним из агонистов или обоими агонистами по отдельности. Самой малочисленной группой оказались гены, индуцируемые отдельно взятыми агонистами, но не отвечающие на сочетание агонистов (рис. 1А, Б).

Идентификация синергически индуцируемых генов (СИГ)

Взаимодействия сигналов от NOD1 и TLR4 на уровне отдельно взятых генов оценивали по значениям ИП. Распределение средних значений ИП было асимметричным (рис. 1В, Г). В обеих точках гены со средним ИП < 1 (log2 ИП < 0) преобладали над генами с ИП > 1. В точке 1 ч был выявлен лишь 1 ген с ИП > 1 и p < 0,05 (C11ORF96), что соответствует нашим более ранним наблюдениям, свидетельствующим об отсутствии синергических эффектов через 1 ч стимуляции [1]. В точке 4 ч было обнаружено 29 генов с ИП > 1 и p < 0,05, что составило ~ 4,6 % от числа индуцибельных генов или ~ 0,24 % всех экспрессирующихся генов.

Интересно, что при данном способе идентификации СИГ в их число не вошли TNF, IL6, IL1B (p > 0,05 в парном /-тесте), хотя значения ИП для них в точке 4 ч были существенно выше 1 во всех трех экспериментах. Вероятная причина - большие разбросы значений ИП при малом числе экспериментов. Мы оценили экспрессию мРНК TNF, IL6, а также IL12B и IL23A с помощью ПЦР-РВ в большем числе опытов и подтвердили наличие достоверных синергических эффектов для всех 4 генов после 4 ч сочетанной стимуляции (ИП^ = 4,23 ± 1,66, p = 5,01 • 1015 для отличия ИП от 1, n = 40; ИЛ, = 7,35 ± 6,85, p = 8,02 • 10-7, n = 40; ИПГ„,В = 4,19 ±

IL6 ' ' 'г ' ' ' IL12B '

1,84, p = 1,29 • 10-7, n = 21; ИПД23А = 4,59 ± 1,89, p = 3,14 • 10-8, n = 21), что соответствует результатам нашей предыдущей работы [1].

Поскольку статистические методы недостаточно надежны при малом числе наблюдений, мы применили другой подход для идентификации СИГ: таковыми считали гены, имеющие ИП > 1,2 во всех трех экспериментах независимо от значения p. Пороговое значение ИП было сдвинуто на 0,2 единицы вверх, чтобы исключить гены, у которых синергическое усиление экспрессии слабо выражено. В точке 1 ч данному определению СИГ удовлетворяли 6 генов (ACOD1, ARC, C11ORF96, GFPT2, IL36G, MCOLN2), или ~ 0,94 % всех индуцибельных генов (рис. 1В). В точке 4 ч таких генов выявлено 64 (рис. 1Г), что составило ~ 10 % всех индуцибельных генов или ~ 0,54 % всех экспрессирующихся генов. 32 из этих 64 генов (50 %) значимо инду-

Э

1 ч

о

4 ч

М-триДАП (129) ЛПС (90)

М-триДАП (409) ЛПС (291)

э

4,0 3,5 -3,0 -2,5 2,0 Н 1,5 1,0 -0,5 -0,0

М-триДАП + ЛПС (182)

112 генов ■ 76 генов

♦

♦ ♦

♦ ♦ ♦ ♦

-к

ИП>1

/><0,05

1 ген

♦

♦

♦♦♦ж

♦

Jr ♦

01 -log2 среднего ИП

М-триДАП + ЛПС (536)

&

о

ад o

4,0 -| 366 генов 229 генов

3,5 -

3,0 - i ИП>1 . /<0,05

2,5 - 29 генов

2,0 -1,5 - * ♦ ♦ ♦JMl 1 ♦ IL12B ♦♦♦ IL23A UUk_* «

- TNF

-IL6

♦ ♦

IL1B

-4-3-2-10 1 2 3

-log2 среднего ИП

Рис. 1. Общая характеристика транскрипционного ответа макрофагов на сочетание агонистов NOD1 и TLR4 А и Б - диаграммы Венна, иллюстрирующие размеры и пересечения множеств генов, индуцируемых отдельными агонистами и их сочетанием в точке 1 ч (А) и 4 ч (Б); В и Г - «вулканные графики», показывающие значения ИП (средние по трем экспериментам) и достоверности их отличий от 1 (парный t-тест) в точке 1 ч (В) и 4 ч (Г). Рамками выделены области, соответствующие среднему ИП > 1 и p < 0,05. Красными символами выделены гены с ИП > 1,2 в трех экспериментах.

2

цировались каждым из двух агонистов по отдельности; остальные 50 % составили гены, значимо индуцируемые только одним агонистом, но потенцируемые при действии сочетания агонистов, а также гены, значимо индуцируемые только сочетанием агонистов (табл. 1). Для генов АС0Б1, С110ЯГ96 и 11360 синергическое усиление экспрессии наблюдалось в обеих точках.

В целом, независимо от метода идентификации, СИГ составляют лишь небольшую часть индуцибельных генов. Среди СИГ преобладают гены с провоспали-тельной активностью, однако присутствуют также гены, кодирующие противовоспалительные белки (АС0Б1, 1110) (см. табл. 1).

Сопоставление синергически и несинергически индуцируемых генов

В первую очередь нас интересовали 32 СИГ, индуцируемые каждым из двух агонистов по отдельности, так как это подмножество включало в себя гены основных провоспалительных цитокинов и других ключевых медиаторов воспаления (см. табл. 1).

Чтобы оценить особенности этого подмножества СИГ (далее - 32-СИГ), мы сформировали подмножество сравнения: 87 генов, также отвечающих на каждый агонист по отдельности, но имеющих ИП < 1 в точке 4 ч во всех 3 экспериментах (несинергически индуцируемые гены - НИГ). 32-СИГ характеризовались досто-

Таблица 1. Классификация и функциональная принадлежность синергически индуцируемых генов (СИГ)*, выявленных после стимуляции макрофагов агонистами N001 и ТЪК4 в течение 4 ч**

Группа генов Индукторы

М-триДАП, ЛПС, сочетание М-триДАП, сочетание ЛПС, сочетание только сочетание

Провоспалительные цитокины и хемокины CCL20, CCL3L1, CXCL2, IL1A, IL1B, IL6, IL12B, IL23A, IL27, IL36G, TNF TSLP, CLCF1

Факторы роста CSF2, CSF3 PDGFB FSTL1

Прочие медиаторы воспаления MMP10, PTGS2

Рецепторы цитокинов и хемокинов CCR7, IL2RA

Гс-рецепторы и паттерн-распоз-нающие рецепторы FCAMR, PTX3

Костимуляторы Т-клеток TNFSF9

Позитивные регуляторы сигна-линга и транскрипции ETS1, NFKBIZ CSRNP1, MAP3K8, PELI1 HES4, NFIX. POLR3C

Малые ГТФазы RASL11A ARL5B, RHOH

Негативные регуляторы сигна-линга и транскрипции TNIP3 SOCS3 NKD1, SLA, SNAI1

Регуляторы свертывания PLAT, SERPINB2

Регуляторы апоптоза IER3 PMAIP1 BCL2L11

Противовоспалительные факторы ACOD1*** IL10

Прочие C11orf96, CKB, FSD1L, TMCC2 GADD45A, LIMS2, PDZD2 ADM, ISG20 ANGPTL4, DLL4, FJX1, GCNT2, IGFBP4, SIAH2, SYTL4, XIRP1

Итого 32 6 8 18

Примечание. * ACOD1 - aconitate decarboxylase 1; ADM - adrenomedullin; ANGPTL4 - angiopoietin like 4; ARL5B - ADP ribosylation factor like GTPase 5B; BCL2L11 - BCL2 like 11; C11orf96 - chromosome 11 open reading frame 96; CCL20 - C-C motif chemokine ligand 20; CCL3L1 - CC-motif chemokine ligand 3 like 1; CCR7 - C-C motif chemokine receptor 7; CKB - creatine kinase B; CLCF1 - cardiotrophin like cytokine factor 1; CSF2 - colony stimulating factor 2 (granulocyte macrophage colony-stimulating factor); CSF3 - colony stimulating factor 3 (granulocyte colony stimulating factor); CSRNP1 - cysteine and serine rich nuclear protein 1; CXCL2 - C-X-C motif chemokine ligand 2; DLL4 - delta like canonical Notch ligand 4; ETS1 - ETS proto-oncogene 1 transcription factor; FCAMR - Fc alpha and mu receptor; FJX1 - four-jointed box kinase 1; FSD1L-fibronectin type III and SPRY domain containing 1 like; FSTL1 - follistatin like 1; GADD45A - growth arrest and DNA damage inducible alpha; GCNT2 - glucosaminyl (N-acetyl) transferase 2 (I blood group); HES4 - hes family bHLH transcription factor 4; IER3 - immediate early response 3; IGFBP4 - insulin like growth factor binding protein 4; IL10 - interleukin 10; IL12B - interleukin 12B; IL1A - interleukin 1 alpha; IL1B - interleukin 1 beta; IL23A - interleukin 23 subunit alpha; IL27 - interleukin 27; IL2RA - interleukin 2 receptor subunit alpha; IL36G - interleukin 36 gamma; IL6 - interleukin 6; ISG20 - interferon stimulated exonuclease gene 20; LIMS2 - LIM zinc finger domain containing 2; MAP3K8 - mitogen-activated protein kinase kinase kinase 8; MMP10 - matrix metallopeptidase 10; NFIX - nuclear factor I X; NFKBIZ - NFKB inhibitor zeta; NKD1 - NKD inhibitor of WNT signaling pathway 1; PDGFB - platelet derived growth factor subunit B; PDZD2 - PDZ domain containing 2; PELI1 - pellino E3 ubiquitin protein ligase 1; PLAT - plasminogen activator tissue type; PMAIP1 - phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1; POLR3C - RNA polymerase III subunit C; PTGS2 - prostaglandine-endoperoxide synthase 2 (cyclooxygenase 2); PTX3 - pentraxin 3; RASL11A - RAS like family 11 member A; RHOH - ras homolog family member H; SERPINB2 - serpin family B member 2 (plasminogen activator inhibitor 2); SIAH2 - siah E3 ubiquitin protein ligase 2; SLA - Src like adaptor; SNAI1 - snailfamily transcriptional repressor 1; SOCS3 - suppressor of cytokine signaling 3; SYTL4 - synaptotagmin like 4; TMCC2 - transmembrane and coiled-coil domain family 2; TNF - tumor necrosis factor; TNFSF9 - TNF superfamily member 9 (4-1BB-L); TNIP3 - TNFAIP3 interacting protein 3; TSLP - thymic stromal lymphopoietin; XIRP1 - xin actin binding repeat containing 1. ** Все СИГ имеют ИП > 1,2 в 3 опытах. Полужирным выделены гены с ИП > 1 при p < 0,05. *** Продукт гена ACOD1 обладает также антимикробной активностью.

верно более низкой абсолютной базальной экспрессией, чем НИГ (рис. 2А). Напротив, при стимуляции М-триДАП + ЛПС в течение 4 ч абсолютная экспрессия 32-СИГ была достоверно выше, чем экспрессия НИГ (см. рис. 2А). Соответственно, в присутствии М-триДАП + ЛПС индексы стимуляции у 32-СИГ были существенно выше, чем у НИГ (рис. 2Б). В списке 11839 экспрессиру-емых генов, ранжированных по базальной экспрессии, 32-СИГ находились преимущественно среди генов с низкой экспрессией, тогда как НИГ были распре-

делены более равномерно (рис. 2В). При сочетанной стимуляции 32-СИГ и в меньшей степени НИГ смещались в область высокоэкспрессируемых генов (рис. 2В): например ген 1Ь1Б (один из 32-СИГ) по уровню мРНК оказался на 4-м месте среди всех мРНК ядерного происхождения.

Анализ функциональной принадлежности показал, что 32-СИГ и НИГ примерно в равной степени обогащены генами из наборов На11тагк_1пТа_51^аИ^_у1а_ п1кЬ и На11тагк_шйатта1огу_ге5роше, включающих

15

| 10 5

0

-5-10

Без стимуляции

Р=1,48х10-

♦ ♦♦♦♦

32-СИГ

♦♦♦♦ ♦♦♦♦

15 -| 1050-5-10-

М-триДАП

р=0,0677

V ♦♦♦♦♦

НИГ

32-СИГ

ж*:

15 —| 1050-5-10-

ЛПС

Р=0,188

♦у»?.*/*

'♦V ♦ ♦♦ *

НИГ

32-СИГ

-10

М-триДАП+ЛПС

15-1 Р

♦

10-

ж»».»

5-

♦♦♦♦

0-

-5-

Р=0,0024

Я« —

НИГ

32-СИГ

НИГ

Э

Э

^ Е-

^ о

13 °

2 я

^ Е-

3 5 5 о 5 &

.3 м Н

1

0,8 0,6 0,4 0,2 0-1

Рсиг=1,83х10-10 Рниг=4,78х10-6

С

та к а

ч

^

& С

121 1086420-

1-| 0,80,60,40,20

р=3,52х10-

32-СИГ

НИГ

12—| 1086420-

1-| 0,80,60,40,20

р=3,18х10-

32-СИГ

НИГ

12—| 108642010,80,60,40,20

р=9,65х10-'

♦ >

г . . »

32-СИГ

НИГ

Ранг генов по средним значениям ЯРКМ (от высоких к низким) для каждого условия

Рис. 2. Сопоставление экспрессии 32-СИГ и НИГ после 4 ч стимуляции

А - абсолютные значения экспрессии (КРКМ) для 32-СИГ и НИГ в базальныхусловиях и при стимуляции отдельными агонистами и их сочетанием; Б - значения ИС для тех же условий. Каждая точка на графиках А и Б - среднее значение показателя для каждого гена по трем экспериментам. Указаны значения р для различий между 32-СИГ и НИГ (1-тест); В - эмпирические функции распределения 32-СИГ (красные графики) и НИГ (синие графики) в множестве 11 839 экспрессируемых генов, ранжированных по среднему КРКМ при каждом условии стимуляции. Указаны значения р в тесте Колмогорова-Смирнова для отличий фактических распределений от нуль-гипотезы (равномерное распределение генов по спискам, серые диагональные линии).

гены основных провоспалительных медиаторов (табл. 2). 32-СИГ были обогащены также генами из набора На11шагк_1Ь6_.ГЛК_8ТЛТ3_81япаИп& а НИГ - На11тагк_ interferon_gamma_response. Гены из набора На11тагк_ ш!ег1егоп_а1рЬа_ге5роше, включающего интерферон-индуцибельные гены, среди 32-СИГ и НИГ практически отсутствовали.

Низкая базальная экспрессия 32-СИГ может быть связана с активной репрессией этих генов в покоящихся клетках, в то время как их высокая индуцибельность при стимуляции М-триДАП + ЛПС может быть обусловлена наличием определенных сайтов связывания акти-вационных факторов транскрипции. Для проверки этой гипотезы применили два подхода. Во-первых, проанализировали представленность генов из наборов С3.ТБТ

(гены-мишени факторов транскрипции) среди 32-СИГ и НИГ (табл. 3). 32-СИГ по сравнению с НИГ были обогащены генами-мишенями №-кВ, Ри.1 и АР-1 (наборы АЬЬ_№КВ_ТАЯОЕТ§, КОАООААКУ_ РШ_06, ТОЛОТСА_АР1_С; см. табл. 3). Во-вторых, провели собственный анализ сайтов связывания факторов транскрипции в промоторах 32-СИГ и НИГ. Среди 32-СИГ достоверно чаще встречались гены, содержащие в своих промоторах сайты связывания факторов транскрипции семейства АР-1 (ШЫ, ШЫВ, ШЫБ, БОБ, БОБЫ, Р0БЬ2), а также ВНЬНЕ41, СиХ1, Н1Р1а и 2ЕВ1 (рис. 3А). Полученные данные указывают на возможную роль №-кВ и АР-1 в синергичес-ком усилении экспрессии 32-СИГ. Однако необходимо

Таблица 2. Представленность генов, входящих в отдельные функциональные наборы Hallmark, в подмножествах 32-СИГ и НИГ

Функциональные наборы генов Число генов в наборах 32-СИГ* (n = 32) НИГ* (n = 87) p (X2)**

Hallmark tnfa signaling via nfkb 195 14 (3,34 • 10-79) 25 (2,47 • 10-89) 0,122

Hallmark inflammatory response 177 8 (2,58 • 10-28) 22 (4,26 • 10-76) 0,975

Hallmark IL6 JAK STAT3 signaling 75 5 (5,1 • 10-27) 0 (0,457) 1,65 • 10-4

Hallmark interferon gamma response 189 2 (0,034) 7 (1,21 • 10-6) 0,743

Hallmark interferon alpha response 97 0 (0,609) 1 (0,724) 0,543

Примечание. Здесь и в табл. 3: СИГ - синергически индуцируемые гены (32-СИГ - исследуемое подмножество СИГ); НИГ -несинергически индуцируемые гены; * - в скобках указаны значения р в тесте х2 при сравнении с экспрессирующимися генами, не входящими в подмножества 32-СИГ или НИГ; ** - значения р в тесте х2 при сравнении 32-СИГ и НИГ между собой.

отметить, что значенияp для сравнений 32-СИГ и НИГ во всех случаях были выше пороговых при проверке на множественность сравнений.

Экспрессия ИФН-индуцибельных генов при сочетанной стимуляции

Секреция ИФН-Р и вызванное этим повышение экспрессии ИФН-индуцибельных генов является неотъемлемой частью ответа макрофагов на стимуляцию TLR4. Напротив, при стимуляции NOD1 возрастает экспрессия лишь нескольких представителей этой группы генов [13]. В промоторах 32-СИГ и НИГ не выявлено обогащения сайтов связывания факторов транскрипции, участвующих в интерфероновом ответе (STAT1, STAT2, семейство IRF). В то же время среди 637 индуцибельных генов, анализируемых в настоящей работе, присутствовали 45 представителей набора Hallmark_interferon_alpha_ response, включающего ИФН-индуцибельные гены. Как видно из рис. 3Б и 3В, экспрессия генов этого набора при стимуляции ЛПС и М-триДАП + ЛПС различалась незначительно. Лишь 1 из 45 генов (ISG20) соответствовал одному из определений СИГ (ИП > 1,2 в 3 экспериментах). Таким образом, интерфероновый ответ макрофагов при стимуляции сочетанием М-триДАП + ЛПС определяется преимущественно действием ЛПС, синер-гические эффекты отсутствуют.

Обсуждение

В настоящей работе впервые охарактеризован транскрипционный ответ макрофагов человека на соче-танную стимуляцию NOD- и Toll-подобного рецепторов. Хотя взаимодействие представителей этих семейств ПРР принято считать синергическим [2, 3, 7, 8], мы наблюдали синергическое усиление экспрессии менее чем для 10 % всех индуцибельных генов. В частности, эффект синергизма отсутствовал для

ИФН-индуцибельных генов (рис. 3Б, В). Кроме того, мы подтвердили, что синергические эффекты отсутствуют на раннем этапе активации макрофагов (1 ч) и формируются после 4 ч сочетанной стимуляции (рис. 1В, Г).

Наши данные принципиально схожи с результатами G. Napolitani и соавт., изучавшими активацию дендритных клеток человека сочетанием агонистов TLR4 + TLR8 [17]. В этой работе синергические эффекты агонистов также отсутствовали на раннем этапе соче-танной стимуляции (2 ч), но были ярко выражены через 8 ч. Многие гены, синергически индуцируемые сочетанием агонистов NOD1 + TLR4 в макрофагах в нашей работе, также индуцировались синергически сочетанием TLR4 + TLR8 в дендритных клетках, в частности гены CSF2 (GMCSF), CSF3 (GCSF), IL6, IL 10, IL12B, IL23A, IL36G, MMP10, PTGS2 (COX2), TNF, TSLP [17]. Эти результаты показывают, что возможность синер-гической индукции экспрессии тех или иных генов зависит не столько от конкретного сочетания агони-стов и типа клеток, сколько от особенностей самих генов. К особенностям СИГ, выявленным в настоящей работе, можно отнести низкую базальную экспрессию и высокий ответ на стимуляцию (см. рис. 2). Кроме того, среди СИГ чаще встречаются гены-мишени NF-kB и AP-1 (см. табл. 3), а промоторы СИГ достоверно чаще содержат сайты связывания факторов транскрипции семейства AP-1 (см. рис. 3А). Эти результаты хорошо согласуются с работой А.И. Тухватулина и соавт., где показано, что для синергического усиления экспрессии репортерного гена в клетках THP-1, активированных сочетаниями агонистов NOD- и Toll-подобных рецепторов, достаточно присутствия в промоторе сайтов связывания NF-kB и AP-1 [4].

Несмотря на свою относительную малочисленность, СИГ имеют большое функциональное значение, поскольку включают гены основных провоспали-

Таблица 3. Представленность генов, входящих в отдельные функциональные наборы C3.TFT, в подмножествах 32-СИГ и НИГ

Функциональные наборы генов Число генов в наборах 32-СИГ* (n = 32) НИГ* (n = 87) p (X2)**

ALL NFKB TARGETS*** 450 13 (5,03 • 10-28) 10 (1,42 • 10-4) 3,59 • 10-4

RGAGGAARY PU1 Q6 372 7 (9,12 • 10-10) 4 (0,422) 3,91 • 10-3

TGANTCA AP1 C 737 7 (2,14 • 10-4) 7 (0,463) 0,038

RGAANNTTC HSF1 01 296 0 (0,367) 9 (2,1 • 10-6) 0,058

Примечание. *** - набор попучен объединением наборов CREL 01, NFKAPPAB65 01, NFKAPPAB 01, NFKB_Q6, NFKBQ6 01, NFKB C, GGGNNTTTCC NFKB Q6 01.

Э

Число генов с данным TFBS

1,0 0,0 1,0

FOSL1::JUN JUN::JUNB BHLHE41 CUX1 FOS::JUN FOSL1::JUND HIF1A FOSL2::JUN ZEB1 MLXIPL NRF1 ZBTB7A HINFP ZNF740 STAT4

НИГ 32-СИГ (87 генов) (32 гена)

3.94E-04 9.04E-04 1.16E-03 1.47E-03 1.56E-03 2.09E-03 2.98E-03 3.69E-03 4.01E-03 4.71E-03 1.00E-02 8.76E-03 7.63E-03 5.81E-03 4.07E-03

p (x2)

u S

о

u s

X

э

10

8

о

M ,

_о 6 -

О

S 4 _

«

s s

Ч О Й 2 а О

э

о о s с

♦

4 V ♦♦♦♦

0 H -2

М-триДАП ЛПС

♦ ♦

♦

♦♦ ♦ «

♦♦♦

V V

♦

»»* & ?

♦♦ V»

1 ч

4 ч

12 10

8 -

6 -

4 -

2 -

4 32-СИГ

^ Гены Hallmark_ interferon_ alpha_response

2 4 6 8 10 12 1о§2 среднего ИС (ЛПС)

Рис. 3. Особенности регуляции экспрессии СИГ

А - топ-15 сайтов с наиболее различающейся представленностью в промоторах 32-СИГ и НИГ (показаны только сайты, представленные не менее чем в 20 % промоторов хотя бы в одной из групп); Б - значения ИС для 45 генов из набора Иа11тагк_ Ше^егоп_а1рИа_гезроте в различных условиях стимуляции; В - сопоставление ИС для 45 генов из набора Иа11тагк_Шег/вгоп_ арИа гезроте при стимуляции ЛПС и М-триДАП+ЛПС (черные символы). Серой диагональю обозначена область равных ИС. Для сравнения показаны 32-СИГ (бордовые символы, находящиеся существенно выше диагонали). Каждый символ на графиках Б и В - среднее значение показателя для каждого гена по трем экспериментам.

+

0

тельных цитокинов (см. табл. 1). Мы полагаем, что синергические эффекты могут играть как положительную, так и отрицательную роль. Неконтролируемая синергическая индукция выработки цитокинов сочетаниями агонистов NOD- и Toll-подобных рецепторов может иметь отрицательные последствия при инфекционных заболеваниях, приводя к развитию «цито-кинового шторма» с неблагоприятным исходом [9, 10]. С другой стороны, контролируемые синергические эффекты могут быть использованы в терапевтических целях для профилактики инфекционных заболеваний и для лечения злокачественных опухолей [18-20]. В частности, только сочетание агонистов NOD1 + TLR4, но не отдельно взятые агонисты, позволяет эффективно перепрограммировать свойства макрофагов с проопухо-левых на противоопухолевые, причем одним из медиаторов противоопухолевой активности макрофагов, активированных сочетанием агонистов, является ФНО, кодируемый одним из 32-СИГ [20]. Знания о характеристиках и механизмах синергических эффектов позволят выбрать правильные мишени для подавления гиперпродукции цитокинов при «цитокиновом шторме», а также

подобрать наиболее подходящие комбинации агонистов для терапевтического использования в клинических ситуациях, требующих усиления врожденного иммунного ответа.

Выводы

1. Впервые охарактеризован транскрипционный ответ макрофагов человека на сочетание агонистов рецепторов NOD1 и TLR4, играющих ключевую роль в распознавании грам-отрицательных бактерий.

2. Гены, синергически индуцируемые при соче-танной стимуляции двух рецепторов, составляют не более 10 % всех индуцибельных генов.

3. Группа синергически индуцируемых генов имеет большое функциональное значение, так как включает гены основных провоспалительных цитокинов.

4. Синергически индуцируемые гены отличаются от несинергически индуцируемых низкой базальной экспрессией и высоким ответом на сочетание агонистов. Получены косвенные данные о возможном участии факторов транскрипции семейств NF-kB и AP-1 в синергическом усилении экспрессии генов.

■ Литература

1. Budikhina A.S., Murugina N.E., Maximchik P.V., Dagil Y.A., Nikolaeva A.M., Balyasova L.S. et al. Interplay between NOD1 and TLR4 receptors in macrophages: nonsynergistic activation of signaling pathways results in synergistic induction of proinflammatory gene expression. J. Immunol. 2021; 206 (9): 2206-20. DOI: https://www.doi.org/10.4049/ JIMMUNOL.2000692

2. Fritz J.H., Girardin S.E., Fitting C., Werts C., Mengin-Lecreulx D., Caroff M. et al. Synergistic stimulation of human monocytes and dendritic cells by Toll-like receptor 4 and NOD1- and NOD2- activating agonists. Eur. J. Immunol. 2005; 35 (8): 2459-70. DOI: https://www.doi. org/10.1002/eji.200526286

3. Tada H., Aiba S., Shibata K.I., Ohteki T., Takada H. Synergistic effect of Nod1 and Nod2 agonists with toll-like receptor agonists on human dendritic cells to generate interleukin-12 and T helper type 1 cells. Infect. Immun. 2005; 73 (12): 7967-76. DOI: https://www.doi.org/10.1128/ IAI.73.12.7967-7976.2005

4. Tukhvatulin A., Dzharullaeva A.S., Tukhvatulina N.M., Shche-blyakov D.V., Shmarov M.M., Dolzhikova I.V. et al. Powerful complex immu-noadjuvant based on synergistic effect of combined TLR4 and NOD2 activation significantly enhances magnitude of humoral and cellular adaptive immune responses. PLoS One. 2016; 11 (5): e0155650. DOI: https://www. doi.org/10.1371/journal.pone.0155650

5. van Beelen A.J., Zelinkova Z., Taanman-Kueter E.W., Muller F.J., Hommes D.W., Zaat S.A.J. et al. Stimulation of the intracellular bacterial sensor NOD2 programs dendritic cells to promote interleukin-17 production in human memory T cells. Immunity. 2007; 27 (4): 660-9. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.immuni.2007.08.013

6. Van Heel D.A., Ghosh S., Hunt K.A., Mathew C.G., Forbes A., Jewell D.P. et al. Synergy between TLR9 and NOD2 innate immune responses is lost in genetic Crohn's disease. Gut. 2005; 54 (11): 1553-7. DOI: https://www.doi.org/10.1136/gut.2005.065888

7. van Heel D.A., Ghosh S., Butler M., Hunt K., Foxwell B.M.J., Mengin-Lecreulx D. et al. Synergistic enhancement of Toll-like receptor responses by NOD1 activation. Eur J Immunol. 2005; 35 (8): 2471-26. DOI: https://www.doi.org/10.1002/eji.200526296

8. Пичугин А.В., Багаев А.В., Лебедева Е.С., Чулкина М., Атаул-лаханов Р.И. Синергическая продукция цитокинов дендритными клетками в ответ на одновременную активацию парами агонистов различных рецепторов врожденного иммунитета. Иммунология. 2017; 38 (2): 118-23. DOI: https://www.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-2-118-123

9. Takada H., Galanos C. Enhancement of endotoxin lethality and generation of anaphylactoid reactions by lipopolysaccharides in muramyl-dipeptide-treated mice. Infect Immun. 1987; 55 (2): 409-13. DOI: https:// www.doi.org/10.1128/iai.55.2.409-413.1987

10. Murch O., Abdelrahman M., Kapoor A., Thiemermann C. Mu-ramyl dipeptide enhances the response to endotoxin to cause multiple organ

injury in the anesthetized rat. Shock. 2008; 29 (3): 388-94. DOI: https:// www.doi.org/ 10.1097/SHK.0b013e3181453e59

11. Poltorak A., He X., Smirnova I., Liu M.Y., Van Huffel C., Du X. et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: Mutations in Tlr4 gene. Science. 1998; 282 (5396): 2085-8. DOI: https:// www.doi.org/10.1126/science.282.5396.2085

12. Girardin S.E., Travassos L.H., Hervé M., Blanot D., Boneca I.G., Philpott D.J. et al. Peptidoglycan molecular requirements allowing detection by Nod1 and Nod2. J. Biol. Chem. 2003; 278 (43): 41702-8. DOI: https://www.doi.org/10.1074/jbc.M307198200

13. Масютина А.М., Муругина Н.Е., Пащенкова Ю.Г., Пащенков М.В. Сравнительная характеристика транскриптомов макрофагов человека, активированных агонистами рецепторов NOD1 и TLR4. Иммунология. 2023; 44 (1): 16-27. DOI: https://www.doi.org/10. 33029/0206-4952-2023-44-1-16-27

14. Patro R., Duggal G., Love M.I., Irizarry R.A., Kingsford C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 2017; 14 (4): 417-9. DOI: https://www.doi.org/10.1038/ nmeth.4197

15. Benjamini Y., Hochberg Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. J. R. Stat. Soc. Ser. B. 1995; 57 (1): 289-300. DOI: https://www.doi.org/10.1111/ j.2517-6161.1995.tb02031.x

16. Gearing L.J., Cumming H.E., Chapman R., Finkel A.M., Wood-house I.B., Luu K. et al. CiIIder: A tool for predicting and analysing transcription factor binding sites. PLoS One. 2019; 14 (9): e0215495. DOI: https://www.doi.org/10.1371/journal.pone.0215495

17. Napolitani G., Rinaldi A., Bertoni F., Sallusto F., Lanzavecchia A. Selected Toll-like receptor agonist combinations synergistically trigger a T helper type 1 -polarizing program in dendritic cells. Nat. Immunol. 2005; 6 (8): 769-76. DOI: https://www.doi.org/10.1038/ni1223

18. Tukhvatulin A.I., Gitlin I.I., Shcheblyakov D.V., Artemiche-va N.M., Burdely L.G., Shmarov M.M. et al. Combined stimulation of Tolllike receptor 5 and Nod1 strongly potentiates activity of NF-kB, resulting in enhanced innate immune reactions and resistance to Salmonella enterica serovar typhimurium infection. Infect. Immun. 2013; 81 (10): 3855-64. DOI: https://www.doi.org/10.1128/IAI.00525-13

19. Багаев А.В., Рыбинец А.С., Федорова А.А., Ушакова Е.И., Лебедева Е.С., Пичугин А.В. и др. Синергизм агонистов TLR3 и TLR4 при перепрограммировании макрофагов в противоопухолевое состояние. Иммунология. 2021; 42 (6): 615-30. DOI: https://www.doi. org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-615-630

20. Муругина Н.Е., Муругин В.В., Пащенков М.В. Противоопухолевая активность макрофагов человека, активированных агонистами рецепторов NOD1 и TLR4 in vitro. Иммунология. 2022; 43 (5): 548-57. DOI: https://www.doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-548-557

■ References

1. Budikhina A.S., Murugina N.E., Maximchik P.V., Dagil Y.A., Nikolaeva A.M., Balyasova L.S., et al. Interplay between NOD1 and TLR4 receptors in macrophages: nonsynergistic activation of signaling pathways results in synergistic induction of proinflammatory gene expression. J Immunol. 2021; 206 (9): 2206-220. DOI: https://www.doi.org/10.4049/ JIMMUNOL.2000692

2. Fritz J.H., Girardin S.E., Fitting C., Werts C., Mengin-Lecreulx D., Caroff M., et al. Synergistic stimulation of human monocytes and dendritic cells by Toll-like receptor 4 and NOD1- and NOD2- activating agonists. Eur J Immunol. 2005; 35 (8): 2459-70. DOI: https://www.doi.org/10.1002/ eji.200526286

3. Tada H., Aiba S., Shibata K.I., Ohteki T., Takada H. Synergistic effect of Nod1 and Nod2 agonists with toll-like receptor agonists on human dendritic cells to generate interleukin-12 and T helper type 1 cells. Infect Immun. 2005; 73 (12): 7967-76. DOI: https://www.doi.org/10.1128/ IAI.73.12.7967-7976.2005

4. Tukhvatulin A., Dzharullaeva A.S., Tukhvatulina N.M., Shcheb-lyakov D.V., Shmarov M.M., Dolzhikova I.V., et al. Powerful complex immunoadjuvant based on synergistic effect of combined TLR4 and NOD2 activation significantly enhances magnitude of humoral and cellular adaptive

immune responses. PLoS One. 2016; 11 (5): e0155650. DOI: https://www.doi. org/10.1371/journal.pone.0155650

5. van Beelen A.J., Zelinkova Z., Taanman-Kueter E.W., Muller F.J., Hommes D.W., Zaat S.A.J., et al. Stimulation of the intracellular bacterial sensor NOD2 programs dendritic cells to promote interleukin-17 production in human memory T cells. Immunity. 2007; 27 (4): 660-9. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.immuni.2007.08.013

6. Van Heel D.A., Ghosh S., Hunt K.A., Mathew C.G., Forbes A., Jewell D.P., et al. Synergy between TLR9 and NOD2 innate immune responses is lost in genetic Crohn's disease. Gut. 2005; 54 (11): 1553-7. DOI: https://www.doi.org/10.1136/gut.2005.065888

7. van Heel D.A., Ghosh S., Butler M., Hunt K., Foxwell B.M.J., Mengin-Lecreulx D., et al. Synergistic enhancement of Toll-like receptor responses by NOD1 activation. Eur J Immunol. 2005; 35 (8): 2471-6. DOI: https://www.doi.org/10.1002/eji.200526296

8. Pichugin A.V., Bagaev A.V., Lebedeva E.S., Chulkina M., Ataul-lakhanov R.I. Synergistic cytokine production by murine dendritic cells in response to their simultaneous activation with pairs of agonists of different innate immune receptors. Immunologiya. 2017; 38 (2): 118-23. DOI: https://www.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-2-118-123

9. Takada H., Galanos C. Enhancement of endotoxin lethality and generation of anaphylactoid reactions by lipopolysaccharides in muramyl-dipeptide-treated mice. Infect Immun. 1987; 55 (2): 409-13. DOI: https:// www.doi.org/10.1128/iai.55.2.409-413.1987

10. Murch O., Abdelrahman M., Kapoor A., Thiemermann C. Muramyl dipeptide enhances the response to endotoxin to cause multiple organ injury in the anesthetized rat. Shock. 2008; 29 (3): 388-94. DOI: https://www.doi.org/10.1097/SHK.0b013e3181453e59.

11. Poltorak A., He X., Smirnova I., Liu M.Y., Van Huffel C., Du X. et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: Mutations in Tlr4 gene. Science. 1998; 282 (5396): 2085-8. DOI: https:// www.doi.org/10.1126/science.282.5396.2085

12. Girardin S.E., Travassos L.H., Hervé M., Blanot D., Boneca I.G., Philpott D.J. et al. Peptidoglycan molecular requirements allowing detection by Nod1 and Nod2. J Biol Chem. 2003; 278 (43): 41702-8. DOI: https://www.doi.org/10.1074/jbc.M307198200

13. Masyutina A.M., Murugina N.E., Pashchenkova Y.G., Pashen-kov M. V. Comparison of transcriptional profiles of human macrophages activated by agonists of NOD1 and TLR4 receptors. Immunologiya. 2023; 44 (1): 16-27. DOI: https://www.doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-1-16-27

14. Patro R., Duggal G., Love M.I., Irizarry R.A., Kingsford C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 2017; 14 (4): 417-9. DOI: https://www.doi.org/10.1038/ nmeth.4197

Сведения об авторах

Масютина Анна Михайловна - мл. науч. сотр. лаб. клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация

E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1904-6714

Пащенков Михаил Владимирович - д-р мед. наук, и.о. зав. лаб. клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6995-1790

15. Benjamini Y., Hochberg Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. J R Stat Soc Ser B. 1995; 57 (1): 289-300. DOI: https://www.doi.org/10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x

16. Gearing L.J., Cumming H.E., Chapman R., Finkel A.M., Wood-house I.B., Luu K., et al. Cillder: A tool for predicting and analysing transcription factor binding sites. PLoS One. 2019; 14 (9): e0215495. DOI: https://www.doi.org/10.1371/journal.pone.0215495

17. Napolitani G., Rinaldi A., Bertoni F., Sallusto F., Lanzavecchia A. Selected Toll-like receptor agonist combinations synergistically trigger a T helper type 1 -polarizing program in dendritic cells. Nat. Immunol. 2005; 6 (8): 769-76. DOI: https://www.doi.org/10.1038/ni1223

18. Tukhvatulin A.I., Gitlin I.I., Shcheblyakov D. V., Artemiche-va N.M., Burdely L.G., Shmarov M.M., et al. Combined stimulation of Toll-like receptor 5 and Nod1 strongly potentiates activity of NF-kB, resulting in enhanced innate immune reactions and resistance to Salmonella enterica serovar typhimurium infection. Infect Immun. 2013; 81 (10): 3855-64. DOI: https://www.doi.org/10.1128/IAI.00525-13

19. Bagaev A.V., Rybinets A.S., Fedorova A.A., Ushakova E.I., Lebe-deva E.S., Pichugin A.V., et al. Synergism of TLR3 and TLR4 agonists during macrophage reprogramming into an antitumor state. Immunologiya. 2021; 42 (6): 615-30. DOI: https://www.doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-615-630

20. Murugina N.E., Murugin V.V., Pashenkov M.V. Antitumor activity of human macrophages activated by NOD1 and TLR4 receptor agonists in vitro. Immunologiya. 2022; 43 (5): 548-57. DOI: https://www. doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-548-557

Authors' information

Anna M. Masyutina - Junior Researcher of Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1904-6714

Mikhail V. Pashenkov - MD, PhD, Acting Head of Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6995-1790