CC BY
13
© Коллектив авторов, 2023
Масютина А.М., Муругина Н.Е., Пащенкова Ю.Г., Пащенков М.В.
Сравнительная характеристика транскриптомов макрофагов человека, активированных агонистами рецепторов NOD1 и TLR4
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Агонисты паттерн-распознающих рецепторов используются для создания иммуностимуляторов и иммунологических адъювантов, позволяющих активировать врожденный иммунитет для получения требуемых защитных эффектов. Выбор агони-стов, наиболее подходящих в конкретных клинических ситуациях, должен быть основан на понимании механизмов их действия, а для этого необходима детальная информация о биологических эффектах, оказываемых агонистами на клетки иммунной системы.
Цель исследования - сопоставить транскриптомы макрофагов человека, активированных агонистами рецепторов NOD1 и TLR4 in vitro.
Материал и методы. Макрофаги человека, полученные путем культивирования моноцитов крови здоровых доноров с гранулоцитарно-макрофагальным колониестиму-лирующим фактором, стимулировали агонистами NOD1 и TLR4 в течение 1, 4 и 9 ч. Транскриптомы анализировали с помощью высокопроизводительного секвенирования РНК (RNA-seq) и полимеразной цепной реакции в реальном времени. В качестве дополнительных методов использовали анализ обогащения генов по функциональной принадлежности и анализ сайтов связывания факторов транскрипции.
Результаты. Главным различием транскриптомов макрофагов, активированных аго-нистами NOD1 и TLR4, стала индукция более мощного интерферонового ответа при активации агонистом TLR4. Среди защитных механизмов, запускаемых в макрофагах при стимуляции агонистом NOD1, необходимо отметить повышение экспрессии генов, кодирующих белки с антимикробными свойствами (аконитатдекарбоксилазу-1, антимикробные хемокины), медиаторы воспаления и белки, необходимые для индукции диффе-ренцировки ТЫ7-клеток.
Заключение. Полученные данные позволяют рекомендовать агонисты NOD1 для профилактики и лечения инфекций, вызванных внеклеточными формами бактерий и грибов.
Ключевые слова: макрофаги; транскриптом; секвенирование РНК; NOD1; TLR4; иммуностимуляторы
Статья получена 05.12.2022. Принята в печать 10.01.2023.
Для цитирования: Масютина А.М., Муругина Н.Е., Пащенкова Ю.Г., Пащенков М.В. Сравнительная характеристика транскрипционных профилей макрофагов человека, активированных агонистами рецепторов NOD1 и TLR4. Иммунология. 2023; 44 (1): 16-27. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-1-16-27
Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 21-15-00211.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Для корреспонденции
Пащенков Михаил Владимирович -доктор медицинских наук, и.о. заведующего лабораторией клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6995-1790
Вклад авторов. Постановка экспериментов и анализ результатов - Масютина А.М., Муругина Н.Е., Пащенкова Ю.Г.; планирование и постановка экспериментов, анализ результатов, написание статьи - Пащенков М.В.
Masyutina A.M., Murugina N.E., Pashchenkova Yu.G., Pashenkov M.V.
Comparison of transcriptional profiles of human macrophages activated by agonists of NOD1 and TLR4 receptors
National Research Center Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. Pattern-recognition receptor agonists are used to design immunostimulants and adjuvants that activate innate immunity to enforce desired protective effects. The choice of agonists most suitable in particular clinical situations should depend on knowledge of mechanisms of action of particular substances. To this end, detailed information about biological effects of particular agonists on immune cells is required.
Aim - to compare transcriptomes of human macrophages activated by NOD1 and TLR4 receptor agonists in vitro.
Material and methods. Macrophages were obtained by culturing healthy donor blood monocytes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and stimulated by agonists of NOD1 or TLR4 for 1, 4 and 9 h. Transcriptomes were evaluated using next-generation RNA sequencing (RNA-seq) and real-time PCR (RT-PCR), followed by gene-set enrichment analysis and transcription factor binding sites analysis.
Results. Main difference between transcriptomes of macrophages activated through TLR4 and NOD1 was a stronger type I interferon response induced by the TLR4 agonist. NOD1 agonist activated several defense mechanisms in macrophages, including elevated expression of genes coding for antimicrobial proteins (aconitate decarboxylase 1, antimicrobial chemo-kines), inflammatory mediators and proteins required for Th17-differentiation.
Conclusion. Transcriptomic data allow recommendation of NOD1 agonists for prevention or treatment of infections caused by extracellular bacteria and fungi.
Keywords: macrophages; transcriptome; RNA sequencing; NOD1; TLR4; immunostimulators
Received 05.12.2022. Accepted 10.01.2023.
For citation: Masyutina A.M., Murugina N.E., Pashchenkova Yu.G., Pashenkov M.V. Comparison of transcriptional profiles of human macrophages activated by agonists of NOD1 and TLR4 receptors. Immunologiya. 2023; 44 (1): 16-27. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-1-16-27 (in Russian)
Funding. The work was supported by the Russian Science Foundation grant No. 21-15-00211.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Conducting experiments and analysing results - Masyutina A.M., Murugina N.E., Pashchenkova Yu.G.; design and conducting experiments, analysing results and writing the article - Pashenkov M.V.
For correspondence
Mikhail V. Pashenkov -MD, PhD, Acting Head of the Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6995-1790
Введение
Распознавание веществ микробного происхождения паттерн-распознающими рецепторами врожденного иммунитета приводит к изменениям экспрессии сотен генов, обеспечивающих адекватный иммунный ответ на тот или иной вид патогена. Эти же вещества, выделенные в чистом виде или синтезированные искусственно, используются для создания иммуностимуляторов и иммунологических адъювантов, позволяющих активировать иммунную систему для получения требуемых защитных эффектов [1-3]. Поскольку число известных паттерн-распознающих рецепторов и их агонистов довольно велико, встает вопрос выбора агонистов, наиболее подходящих в тех или иных клинических ситуациях. Этот выбор должен быть основан на понимании механизмов действия конкретных агонистов, а для этого необходима подробная информация о биологических эффектах, оказываемых ими на клетки иммунной системы.
Агонисты МОБ-подобных рецепторов (N001, N002) применяются для профилактики и лечения ин-фекционно-воспалительных заболеваний человека [4]. Тем не менее в литературе отсутствует подробное описание влияния этих веществ на экспрессию генов в клетках иммунной системы человека. В данной ра-
боте мы впервые изучили влияние одного из основных агонистов рецептора NOD1 - ^ацетил-Э-мурамил-Ь-аланил-Э-изоглутамил-мезо-диаминопимелиновой кислоты (М-триДАП) - на экспрессию генов в макрофагах человека in vitro. Макрофаги были выбраны в качестве модели как один из основных типов клеток врожденной иммунной системы. В качестве препарата сравнения использовали липополисахарид (ЛПС), агонист Toll-подобного рецептора 4 (TLR4), влияние которого на транскриптом клеток иммунной системы достаточно хорошо изучено [5-7]. В настоящей работе охарактеризованы относительно кратковременные эффекты агони-стов, развивающиеся в сроки до 9 ч после их добавления к клеткам. В качестве основного метода исследования использовали высокопроизводительное секвенирование РНК (RNA-seq), позволяющее глобально оценить клеточный транскриптом.
Материал и методы
Реактивы. Синтетический М-триДАП и ультрачистый ЛПС, полученный из E. coli O111:B4, были закуплены у фирмы InvivoGen (США), рекомбинант-ный человеческий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) - у Mil-tenyi Biotec (ФРГ). Полная культуральная среда (ПКС)
представляла собой RPMI-1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина и 10 % фетальной телячьей сыворотки (все Thermo Fisher Scientific, США).
Доноры крови. Для проведения полнотранскрип-томного анализа (RNA-seq) была получена венозная ге-паринизированная кровь от трех здоровых доноров из числа сотрудников лаборатории. Для подтверждающих экспериментов [полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ), вестерн-блоттинг] была получена кровь еще от 5 здоровых доноров. Исследование было одобрено локальным Комитетом по этике ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России» (протокол 10/2017). Все доноры дали информированное согласие на участие в исследовании.
Культивирование и стимуляция макрофагов для RNA-seq. Мононуклеарные клетки выделяли на градиенте плотности фиколла, отмывали, подсчитывали и ресуспендировали в концентрации 10 млн/мл в среде RPMI-1640 с добавлением 1 % пуловой человеческой сыворотки IV группы. Вносили по 5 мл клеточной суспензии в чашки Петри диаметром 60 мм (SPL Life Sciences, Республика Корея) и инкубировали в течение 1 ч при 37 °С в атмосфере 5 % СО2. После этого не-адгезированные клетки удаляли путем двукратной промывки теплой RPMI-1640, а адгезированные клетки (моноциты) культивировали в ПКС с добавлением 40 нг/мл ГМ-КСФ в течение 6 сут. На 3-и сутки культу-ральную среду полностью меняли на свежую ПКС с добавлением ГМ-КСФ в той же концентрации. Через 6 сут дифференцированные макрофаги отделяли от пластика трипсинизацией, отмывали, подсчитывали и высевали в 24-луночный планшет по 2 • 105 клеток в 400 мкл ПКС на лунку. На следующие сутки к клеткам добавляли М-триДАП (10 мкг/мл) или ЛПС (10 нг/мл) либо оставляли без агонистов для оценки базальной экспрессии. Через 1, 4 и 9 ч после начала стимуляции клетки лизи-ровали для выделения РНК. По техническим причинам образцы после 9 ч стимуляции были получены только от 2 доноров.
Исследование транскриптомов макрофагов с помощью RNA-seq. Тотальную клеточную РНК выделяли с помощью набора фирмы Jena Bioscience (ФРГ, кат. № PP-210) и обрабатывали ДНКазой I (NEB, США, кат. № M0303). Полиаденилированную мРНК выделяли из фракции тотальной РНК с помощью суперпарамагнитных частиц, покрытых олигодезокситимидинфосфатом (олиго-dT, NEB, США, кат. № E7490). Образцы мРНК преобразовывали в баркодированные библиотеки кДНК с помощью набора NEBNext® Ultra™ II Directional RNA Library Prep with Sample Purification Beads (NEB, США, кат. № E7765) и наборов баркодирующих праймеров NEBNext® Multiplex Oligos for Illumina® (NEB, США, кат. № E7335 и E7500) в соответствии с инструкциями производителя. Качество библиотек анализировали на приборе 2100 Bioanalyzer system (Agilent Technologies, США). Пулы библиотек кДНК секвенировали на приборе Illumina NovaSeq 6000 (Евроген, Москва, Россия) в формате односторонних прочтений длиной 100 пар ос-
нований. Среднее количество прочтений (reads) на библиотеку составило 41,02 i 3,97 • 106, 41,71 i 5,06 • 106 и 23,73 i 7,08 • 106 у доноров 1-3 соответственно. Выравнивание прочтений на транскриптом человека (ftp:// ftp.ensembl.org/pub/release-98/fasta/homo_sapiens/cdna/ Homo_sapiens.GRCh38.cdna.abinitio.fa.gz), а также подсчет числа прочтений на ген (counts) выполняли с помощью программного пакета Salmon [8]. Доля успешно выравненных прочтений составила 92,9 i 0,2, 93,2 i 0,3 и 91,0 i 1,5 % у доноров 1-3 соответственно. Прочтения, относящиеся к различным вариантам мРНК одного и того же гена, суммировали.
Анализ данных RNA-seq. Мы отобрали 11 839 наиболее представленных белок-кодирующих генов (не менее 50 «сырых» прочтений на ген хотя бы в одном образце у каждого из трех доноров). Чтобы избежать деления на 0 при расчете индексов стимуляции (см. ниже), нулевые значения числа прочтений заменяли на 1. Нормализованную экспрессию генов выражали в виде количества прочтений на 1 000 000 всех прочтений в образце (reads-per-million, RPM).
Для каждого гена рассчитывали индекс стимуляции (отношение RPM у данного донора в данной точке при данном виде стимуляции к RPM в нестимулированных клетках того же донора в той же точке). Повышение экспрессии гена в данной точке при данном виде стимуляции считали биологически значимым, если индекс стимуляции составлял > 2 у всех исследованных доноров. Понижение экспрессии считали значимым при индексе стимуляции < 0,5 у всех доноров.
Анализ обогащения генов по функциональной принадлежности (Gene set enrichment analysis, GSEA). Использовали программный пакет GSEA 4.0.3 (UC San Diego and Broad Institute, США). GSEA сравнивает экспрессию генов в образцах двух фенотипов (например, в клетках, активированных агонистами двух различных рецепторов) и позволяет оценить связь между фенотипом и повышением либо понижением экспрессии наборов генов (gene sets), сформированных заранее по какому-либо функциональному признаку [9]. Входными данными для GSEA служили ^2-преобразованные значения индексов стимуляции.
Мерой дифференциальной экспрессии гена в клетках с фенотипами 1 и 2 считали отношение сигнала к шуму :
ОСШ = (M1 - m2 )/(с1 + g2),
где M1 и M2 - средние значения, а с1 и с2 - стандартные отклонения экспрессии данного гена в фенотипах 1 и 2 [9].
Использовали аннотированные функциональные наборы генов, опубликованные на сайте GSEA (https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/genesets.jsp), из коллекций Hallmark (50 наборов генов, участвующих в основных биологических процессах), C3.TFT (1134 набора генов, являющихся мишенями определенных факторов транскрипции - transcription factor
targets), C3.MIR (2598 наборов генов, являющихся мишенями определенных мкРНК - mcRNA), С5 (14 998 наборов генов, характеризующих различные биологические процессы). Связь экспрессии данного набора генов с одним из двух фенотипов считали достоверной, если значение частоты ложных открытий Q для данного набора не превышало 0,05.
Для качественной оценки транскриптомов анализировали представленность генов из тех же функциональных наборов GSEA в множествах генов, сформированных в данном исследовании. Из наборов GSEA исключали гены, не входящие в список 11 839 генов, экспрессируемых в макрофагах. Обогащение или обеднение представителей данного функционального набора в данном множестве генов по сравнению с другим множеством оценивали с помощью теста х2. Множественность сравнений учитывали по процедуре Бенья-мини-Хохберга [10] с пороговым уровнем достоверности q = 0,05.
Тепловые карты строили с помощью онлайн-про-граммы Morpheus (https://software.broadinstitute.org/ morpheus).
Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ). Данные по экспрессии мРНК отдельных генов были валидированы с помощью ПЦР-РВ в независимых экспериментах, поставленных по вышеописанной схеме. Условия ПЦР-РВ были описаны ранее в [11]. Определение экспрессии мРНК EGR1, MX1, IL1B, IL12B, IL23A выполнено у 5 доноров, EGR1, IFNB1, IL6 - у 4 доноров.
Вестерн-блоттинг. Выделение цитоплазматической и ядерной фракций и их анализ с помощью вестерн-блоттинга проводили, как описано в [11]. EGR1 детектировали с помощью поликлональных кроличьих антител производства Cloud-Clone (КНР).
Анализ сайтов связывания факторов транскрипции. Для собственного анализа сайтов связывания факторов транскрипции в промоторах генов применяли программу CiiiDER, которая использует алгоритм MATCH, позиционно-частотные матрицы JASPAR и сборку генома человека GRCh38 [12]. Промоторами считали области ДНК от -1500 до +500 пар оснований от сайтов старта транскрипции. Минимальный индекс соответствия между последовательностями предполагаемого и идеального сайта составлял 0,85 (индекс 1 обозначает полное соответствие, индекс 0 - полное несоответствие последовательностей).
Индекс обогащения (ИО) генов, содержащих данный сайт, рассчитывали по формуле:
ИО = log2[(n + 0,5)/(N+0,5)] - log2[(«2+0,5)/(N2+0,5)],
где n2 и n2 - число генов, содержащих данный сайт, в множествах генов 1 и 2, N1 and N2 - общее число генов в множествах 1 и 2 [12].
Представленность данного сайта в множествах генов 1 и 2 сравнивали с помощью теста х2. Программа CiiiDER автоматически выбирала индекс соответствия
для каждого сайта (в пределах от 0,85 до 1), при котором различие между двумя множествами генов было наиболее достоверным. Учитывали сайты связывания только тех факторов транскрипции, которые экс-прессировались в макрофагах (354 разновидности). Множественность сравнений учитывали по процедуре Беньямини - Хохберга с q = 0,05.
Анализ корреляций. Для анализа корреляций вычисляли коэффициент корреляции Пирсона (г), который считали значимым при р < 0,05.
Результаты
Общая характеристика транскриптомов макрофагов, активированных агонистами КСБ1 и ХЬЯ4
Увеличение экспрессии генов, вызванное данным агонистом в данной точке, считали биологически значимым, если экспрессия возрастала в > 2 раза по сравнению с нестимулированными клетками у всех исследованных доноров. С помощью RNA-seq были выявлены 589 генов, удовлетворявших данному критерию хотя бы в одной из точек (1, 4 или 9 ч) при стимуляции хотя бы одним агонистом. Только эти гены считали индуци-бельными. Число генов с биологически значимым повышением экспрессии было наименьшим через 1 ч, наибольшим - через 4 ч после начала стимуляции (рис. 1 А). Во всех трех точках отмечалось частичное пересечение множеств М-триДАП- и ЛПС-индуцибельных генов, наибольшее - в точке 1 ч (см. рис. 1 А).
Еще 544 гена характеризовались значимым понижением экспрессии хотя бы в одной точке. Интересно, что после 1 ч стимуляции такие гены практически отсутствовали, тогда как в точках 4 и 9 ч их число при стимуляции М-триДАП составило несколько сотен, при стимуляции ЛПС - несколько десятков (см. рис. 1А). Большинство генов, отвечавших понижением экспрессии при стимуляции ЛПС, вели себя схожим образом и при стимуляции М-триДАП (см. рис. 1 А).
Множества индуцибельных и репрессибельных генов не пересекались, за двумя исключениями: экспрессия гена ЛБЯБ2, кодирующего Р2-адренорецептор, была повышена при стимуляции М-триДАП или ЛПС в течение 1 ч, но снижена после 4 и 9 ч стимуляции; экспрессия гена БЕСТМ1, кодирующего костимуляторную молекулу, была понижена и повышена после стимуляции соответственно М-триДАП и ЛПС в течение 9 ч. Таким образом, множество регулируемых генов в данном исследовании составило 589 + 544 - 2 = 1131 ген, или ~ 9,6 % от всех анализируемых генов.
Сравнение индуцибельных генов при активации агонистами КСБ1 и
Через 1 ч после начала стимуляции наблюдалась сильная корреляция экспрессии 589 индуцибельных генов в М-триДАП- и ЛПС-стимулированных макрофагах (рис. 1 Б), что согласуется со значительным пересечением множеств М-триДАП- и ЛПС-индуцибельных генов в этой точке (см. рис. 1 А). Через 4 и 9 ч после начала
Э
Повышение экспрессии
Понижение экспрессии
129
1 ч
85 90 409
5 • 0
348
4 ч
291 255
36 47
9 ч
I 266
263
63
83
ф М-триДАП
О ЛПС
Э
14 1 12 -10 -8 -6 -4 -2 -0 --2 --4 -
14 12 ^ 10 ПС 8 Б 6 И 4 & 2 0
J -2
Абсолютная экспрессия
-6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 Log2 RPM (М-триДАП)
-6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 Log2 RPM (М-триДАП)
-6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 Log2 RPM (М-триДАП)
Относительная экспрессия
Log2 индекса стимуляции (М-триДАП)
-4 J
Log2 индекса стимуляции (М-триДАП)
If2 -
-4 -
Log2 индекса стимуляции (М-триДАП)
Рис. 1. Сопоставление экспрессии регулируемых генов в макрофагах человека, активированных in vitro агонистами NOD1 (М-триДАП) и TLR4 (ЛПС) в течение 1, 4 и 9 ч
А - множества генов с биологически значимым изменением экспрессии. Результаты представлены в виде модифицированных диаграмм Венна с указанием численности генов в отдельных множествах и численности общих элементов во множествах; площади кругов и их пересечений пропорциональны числу генов; Б - корреляционный анализ абсолютной и относительной экспрессии 589 индуцибельных генов в М-триДАП- и ЛПС-активированных макрофагах. Каждая точка построена по средним значениям логарифмически преобразованных величин абсолютной экспрессии (RPM) или относительной экспрессии (индексы стимуляции). Указаны коэффициенты корреляции Пирсона, красные линии обозначают зону равной экспрессии.
Таблица 1. Представленность генов, входящих в отдельные функциональные наборы Hallmark, во множествах генов с биологически значимым повышением экспрессии при стимуляции М-триДАП и ЛПС
Функциональные наборы генов Число генов в наборах М-триДАП ЛПС
1 ч 4 ч 9 ч 1 ч 4 ч 9 ч
Hallmark tnfa signaling via nfkb 195 68* 89* 55* 55* 71* 54*
Hallmark inflammatory response 177 36* 66* 45* 30* 59* 45*
Hallmark interferon gamma response 188 16* 34* 27* 13* 65* 69*
Hallmark interferon alpha response 97 1 9+ 8+ 2 37* 40*
Число генов в множествах 129 409 255 90 291 266
Примечание. * и + - гены данного функционального набора представлены в данном множестве генов достоверно чаще, чем среди остальных генов, экспрессируемых в макрофагах (* -р < 10-22, + -р < 10-3 в тесте х2).
стимуляции корреляция экспрессии генов в М-триДАП и ЛПС-стимулированных макрофагах уменьшалась (см. рис. 1Б), что говорит о нарастании различий транс-криптомов.
Качественный анализ функциональной принадлежности М-триДАП- и ЛПС-индуцибельных генов ожидаемо показал, что и среди первых, и среди вторых достоверно повышена представленность генов, кодирующих медиаторы воспаления (функциональные наборы Hallmark_tnfa_signaling_via_nfkb, Hallmark_inflamma-tory_response, Hallmark_interferon_gamma_response; табл. 1). Среди ЛПС-индуцибельных генов через 4 и 9 ч после начала стимуляции была избирательно повышена представленность генов из набора Hallmark_in-terferon_alpha_response, включающего гены, участвующие в индукции интерферонов (ИФН) I типа и в ответе на ИФН I типа (см. табл. 1).
Далее мы провели прямое сопоставление экспрессии регулируемых генов в М-триДАП- и ЛПС-стимулированных макрофагах с помощью GSEA. При активации ЛПС в течение 4-9 ч наблюдалось более выраженное повышение экспрессии генных наборов, характеризующих ответ на вирусы, нуклеиновые кислоты и ИФН I типа (табл. 2). При активации М-триДАП не выявлено генных наборов из коллекций Hallmark и C5, экспрессия которых возрастала бы сильнее, чем при стимуляции ЛПС (см. табл. 2).
Нас интересовало, в какой степени различия транс-криптомов М-триДАП- и ЛПС-стимулированных макрофагов могут быть обусловлены различиями сигнальных путей и факторов транскрипции, активируемых при стимуляции рецепторов NOD1 и TLR4. Для этого с помощью GSEA сопоставили экспрессию наборов генов, являющихся мишенями факторов транскрипции (коллекция C3.TFT). Как видно из табл. 3, в ЛПС-стимулированных макрофагах через 4-9 ч после начала стимуляции повышена экспрессия генов, содержащих сайт ISRE (interferon-stimulated response element; набор ISRE_01), а также генов-мишеней факторов транскрипции семейства IRF (interferon response factor), участвующих в индукции экспрессии ИФН I типа. Эти результаты согласуются с представленными в табл. 1 и 2 данными о повышенной экспрессии генных наборов, относящихся к интерфероновому ответу, в тех же точках при стимуляции ЛПС.
Таблица 2. Избирательное повышение экспрессии генных наборов из коллекций Hallmark и C5 при стимуляции макрофагов М-триДАП или ЛПС (GSEA)
Время М-триДАП ЛПС
1 ч Hallmark: Hallmark:
0 наборов 0 наборов
C5.GO: C5.GO:
0 наборов 0 наборов
4 ч Hallmark: Hallmark:
0 наборов 2 набора • Interferon gamma response*** • Interferon alpha response***
C5.GO: C5.GO:
0 наборов 25 наборов • gobp defense response to virus*** • gobp response to virus*** • gobp response to type I interferon*** и еще 22 набора, относящихся к ответу на вирусы, чужеродные нуклеиновые кислоты, ИФН I типа
9 ч Hallmark: Hallmark: 2 набора
0 наборов • Interferon gamma response*** • Interferon alpha response*** C5.GO: 29 наборов
C5.GO: • gobp defense response to virus***
0 наборов • gobp response to virus*** • gobp response to type I interferon*** и еще 26 наборов, относящихся к ответу на вирусы, чужеродные нуклеиновые кислоты, ИФН I типа
Примечание. Значения достоверности:
q < 0,001.
Собственный анализ сайтов связывания факторов транскрипции в промоторах М-триДАП- и ЛПС-индуцибельных генов
Хотя многие гены отвечали достоверным повышением экспрессии избирательно на стимуляцию М-триДАП, но не ЛПС, с помощью в8БЛ не удалось выявить ни их общие функциональные характеристики, ни общие механизмы их регуляции. Поэтому мы провели собствен-
ОТ-кВ, АР-1, 8ТАТ1:8ТАТ2, что говорит об общности механизмов активации клетки обоими агонистами (рис. 2 А).
Чтобы выявить факторы транскрипции, избирательно участвующие в активации макрофагов под действием отдельных агонистов, из множеств М-триДАП-и ЛПС-индуцибельных генов выделили так называемые селективные гены - такие, экспрессия которых при стимуляции одним агонистом у всех доноров возрастала в > 2 раза по сравнению с базальной экспрессией в данной точке, а при стимуляции другим агонистом - не менялась ни у одного донора в этой же точке.
Через 1 ч после начала стимуляции селективные гены практически отсутствовали (0 при стимуляции ЛПС, 4 при стимуляции М-триДАП), тогда как в точках 4 и 9 ч было выявлено несколько десятков М-триДАП-и ЛПС-селективных генов (табл. 4). Данные по их относительной экспрессии приведены на рис. 2Б и 2В (4 ч) и рис. 2Д и 2Е (9 ч). Число провоспалительных генов среди них было невелико. ЛПС-селективные гены преимущественно относились к интерфероновому ответу (см. табл. 4). Среди М-триДАП-селективных генов была несколько повышена представленность генов-мишеней гистоновой деметилазы К0М7А и репрессора транскрипции М0ЯС2, однако эти различия не были достоверными (табл. 4).
Анализ промоторов показал, что промоторы ЛПС-селективных генов обогащены сайтами связывания факторов транскрипции семейства ЖБ и 8ТАТ1:2, что
Таблица 4. Представленность генов, входящих в указанные функциональные наборы, в множествах М-триДАП- и ЛПС-селективных генов
Функциональные наборы генов М-триДАП-селективные ЛПС-селективные
4 ч 9 ч 4 ч 9 ч
Hallmark tnfa signaling via nfkb 4 5 0 5
Hallmark inflammatory response 1 5 4 5
Hallmark interferon alpha response 0 1 19* 18*
Hallmark interferon gamma response 0 0 21* 21*
Gobp defense response to virus 0 0 23* 28*
ISRE 01 0 0 12 16
IRF Q6 0 1 10 12
STTTCRNTTT IRF Q6 0 0 9 11
KDM7A target genes 12 6 2 2
MORC2 target genes 7 3 0 1
Число генов во множествах 33 41 37 65
Примечание. * - гены данного функционального набора представлены во множестве ЛПС-селективных генов достоверно чаще, чем во множестве М-триДАП-селективных генов в той же точке (р < 10-3 в тесте х2)-
->
Рис. 2. Анализ сайтов связывания факторов транскрипции в промоторах генов, индуцируемых агонистами N001 и ТЬЯ4 А - сайты, для которых выявлено достоверное обогащение (ИО > 0) и обеднение (ИО < 0) в промоторах индуцибельных генов по сравнению с промоторами конститутивных генов; Б и Д - тепловые карты индексов стимуляции М-триДАП- и ЛПС-селективных генов; В и Е - средние значения индексов стимуляции М-триДАП- и ЛПС-селективных генов; пунктирными линиями обозначен порог биологически значимой индукции (log22 = 1); Г и Ж - топ-10 сайтов с наиболее различающейся представленностью в промоторах М-триДАП- и ЛПС-селективных генов; Б, В и Г - анализ через 4 ч после начала стимуляции; Д, Е и Ж - через 9 ч. На графиках А, Г и Ж показаны только сайты, представленные не менее чем в 20 % промоторов хотя бы в одной из групп.
Таблица 3. Избирательное повышение экспрессии генных наборов из коллекции СЗ.ТБТ при стимуляции макрофагов М-триДАП или ЛПС (ОБЕА)
Время М-триДАП ЛПС
1 ч 0 наборов 0 наборов
4 ч 0 наборов STTTCRNTTT IRF Q6*** ISRE 01*** IRF1 01* ICSBP Q6* IRF_Q6*
9 ч 0 наборов STTTCRNTTT IRF Q6** ISRE 01** IRF7 01**
Примечание. Значения достоверности: *** - q < 0,001; ** - q < 0,01; * - q < 0,05.
ный анализ сайтов связывания факторов транскрипции в промоторных областях М-триДАП-индуцибельных генов в сравнении с ЛПС-индуцибельными.
Вначале для подтверждения валидности метода сопоставили представленность сайтов связывания в промоторах индуцибельных генов и конститутивных генов (таких, у которых экспрессия ни в одной точке и ни у одного донора не менялась более чем в 1,5 раза по сравнению с базальной, п = 3432). Как и ожидалось, промоторы генов, индуцируемых как М-триДАП, так и ЛПС, были достоверно обогащены сайтами связывания активационных факторов транскрипции
М-три ДАП
ЛПС
1 ч 4 ч 9 ч 1 ч 4 ч 9 ч
L"
1 IUI II
1 IUI II
II
I
I
II
АР-1
NFKB2 — REL RELA
EGR E2F KLF SP CREB
ETS
—STAT1:2 -IRF7
I
I I I
-3 0 3
Индекс обогащения (ИО)
э
и -тА
ANKLE2 I ASB6 BCAR1 CD82 CEP85L CNKSR3 CRIM1 DMWD I FILIP1L FOSL1 IFSTL3 I GADD45A
GTPBP4 I HIP1 HIVEP1 HSPA12A LRP12 I MEAK7 I N4BP3 NFE2L2 OLFM2 I PDLIM1 I PKP2 IPTGES PTPRF PXDC1 RDH10 SERPINB8 SESTD1 STAP2 I UAP1 ULK2 I USP13 I AIM2 CH25H DDX60 DHX58 DTX3L EIF2AK2 HERC5 HSH2D IFI44 I IFIT1 I IFIT3 I IFITM3 IRF7 IRF9 ISG15 I MX1 I MX2 I NT5C3A OAS1 OAS3 PARP14 PARP9 PELI1 PLSCR1 PMAIP1 REC8 RTP4 SAMD9 SIGLEC1 SP110 STAT2 TCF4 I TNFSF10 TNFSF13B TNFSF8 I USP18 ZC3HAV1
©
С
П
(Л
и и 3 я
» ♦ § tät s ^^ 6 g Л ^
- - ♦ М-триДАП-селективные
-4
-2 0 2 4 Log2 индекса стимуляции 2 (М-триДАП)
40
Число генов с данным сайтом 20 0 20 40
EGR1 EGR2 NRF1 PLAGL2 TCFL5 EGR3 KLF3 ZBTB14 SP1 SP4 IRF9 STAT5A::5B IRF3 IRF4 IRF2 IRF8 IRF5 IRF7 IRF6
<0 1,0 7,0 Индекс стимуляции (Log2)
STAT1::2
1.98E-09
М-триДАП ЛПС (33 гена) (37 генов)
p (х2)
э
и -тА
s §
AKT3 AP1S3 ARNTL2 BAIAP2L 1 C17ort58 CD55 CERS4 CREB5 CSF1 CSF2RA DPYSL2 EIF5A2
?STL3 GSF8 INHBE MCTP1 MICAL2 MINDY3 MTSS1 NFKB2 NINJ1 OLFM2 PCBP3 PTPRJ PVR RFTN1 RILPL2 RRAS2 RUNX2 SERF1A SLC16A6 SLC41A2 STAP2 SYNM TCHH TMCC2 TPBG TSPAN33 TUT1 ZG16B
ABHD14A-ACY 1 AIM2 APOL6 BATF2 C15oif48 CORO7-PAM 16 CSRNP1 DDX58 DDX60 DHX58 DTX3L EIF2AK2 POP
rAM220A
TAR2
rPR2
GADD45B
~XZ2
I ■
RC6
!H2D
35
44
RF9 SG15 TGA1 „AP3 MAP3K8 MX1 MX2 NEURL3 NFKBIZ NT5C3A OAS1 OAS3 PARP10 PARP14 PARP9 PLSCR1 PML PNPT1 REC8 RNF213 RTP4 SAMD9 SECTM1 SEMA4A SIGLEC1
SOCS3
SP110
STAT1
STAT2
SYT12
TNFSF10
TRIB2
TRIM22
USP18
ZC3H12C
С
П
(Л
и
и ц
я лу
м и
6 -
4 -
2 -
0 -
-2 -
-4
-2 0 2 4 Log2 индекса стимуляции (М-триДАп)
Число генов с данным сайтом 50 30 10 10 30 50 70
EGR1 CENPB EGR3 ZNF75D ZNF317 EGR2 NRF1 HES6 PLAG1 REL
IRF9 IRF3 IRF4 IRF7 IRF2 IRF1
IRF5
IRF6
IRF8
<0 1,0 5,0 Индекс стимуляции (Log2)
STAT1::2
2.58E-06 2.63E-03 2.71E-03 2.80E-03 2.89E-03 5.22E-03 8.88E-03 1.29E-02 1.50E-02 1.98E-02
П
С
Д
и р
7.44E-04 2.74E-04 1.97E-04 1.25E-04 9.76E-05 5.52E-05
3.84E-05
3.07E-05
8.80E-06
М-триДАП ЛПС (41 ген) (65 генов)
8.20E-08
p (x2)
6
6
согласуется с участием этих генов в интерфероновом ответе (рис. 2Г, 2Ж). Промоторы М-триДАП-селективных генов оказались обогащены сайтами связывания факторов транскрипции семейств EGR (early growth response), SP (specificity protein), KLF (Krueppel-like factor) и ряда других (рис. 2Г, Ж). Общее свойство этих сайтов - высокое содержание гуанина и цитозина.
По данным RNA-seq, большинство факторов транскрипции, ассоциированных с М-триДАП-селективными генами, экспрессируется макрофагами конститутивно (данные не представлены), тогда как ген EGR1 является индуцибельным: экспрессия его мРНК повышается через 1 ч стимуляции обоими агонистами, однако гораздо существеннее при стимуляции М-триДАП, чем при стимуляции ЛПС (рис. 3А). Присутствие белка EGR1 в цито-плазматической и ядерной фракциях макрофагов подтверждено с помощью вестерн-блоттинга (рис. 3Б). Полученные данные указывают на возможное участие факторов транскрипции семейств EGR, SP и KLF в индукции экспрессии генов при активации рецептора NOD1.
Оценка функционального потенциала макрофагов, активированных агонистом NOD1, по транскриптомным данным
Макрофаги могут реализовывать свое защитное действие как за счет собственных механизмов, так и через активацию адаптивного иммунитета. Одним из главных собственных защитных механизмов является фагоцитоз. Макрофаги конститутивно экспресси-ровали гены, необходимые для реализации фагоцитоза (набор GOBP_phagocytosis), а также гены, кодирующие бактерицидные белки лизоцим (LYZ), белок, повышающий проницаемость (BPI), микробицидные хемокины (CCL18, CCL22, CXCL16) и ряд других; экспрессия этих генов при стимуляции не менялась. М-триДАП и ЛПС индуцировали экспрессию ряда микробицидных хемо-кинов, активных в отношении ряда бактерий и грибов [13], а также аконитатдекарбоксилазы-1 (ACOD1), продукт которой - итаконат - активен в отношении M. tuberculosis и S. enterica (рис. 3В) [14].
Вторым важнейшим защитным механизмом, в активации которого участвуют макрофаги, является воспаление. Как можно видеть на рис. 3Г, оба агониста индуцировали экспрессию десятков провоспалительных генов, при этом кинетика их экспрессии при активации М-триДАП и ЛПС была схожей за отдельными исключениями.
ИФН I типа необходимы для защиты от вирусов и некоторых видов бактерий, паразитирующих в цито-золе. Хорошо известно, что при активации рецептора ТЬЯ4 через ТЯГР-зависимый сигнальный путь запускается продукция ИФН-Р (ген №N31) [15]. В свою очередь, ИФН-Р вторично индуцирует экспрессию ИФН-зависимых генов [16]. Вопрос об индукции экспрессии №N31 и ИФН-индуцибельных генов агонистами N00-подобных рецепторов (N001 и родственного рецептора N002) является спорным: есть работы, как подтверждающие [17-19], так и не подтверждающие [20-22] такую возможность. В нашей работе биологически значимое (> 2 раз) повышение экспрессии гена №N31 было зафиксировано у 5 из 7 доноров при стимуляции ЛПС и ни у одного при стимуляции М-триДАП (рис. 3А). Экспрессия изоформ ИФН-а в макрофагах отсутствовала независимо от вида и срока стимуляции. Экспрессия МХ1 - классического ИФН-индуцибельного гена - значимо возрастала у всех доноров после 4-9 ч стимуляции ЛПС, ни у одного - после 4 ч стимуляции М-триДАП и незначительно повышалась у 2 из 8 доноров после 9 ч стимуляции М-триДАП (рис. 3 А). На тепловой карте (рис. 3 Д) видно, что М-триДАП, в отличие от ЛПС, вызывает повышение экспрессии лишь единичных ИФН-индуцибельных генов, что может быть обусловлено ИФН-независимыми механизмами [21]. Таким образом, полученные данные свидетельствуют об отсутствии значимой экспрессии ИФН I типа при активации макрофагов агонистом N001.
Еще одним защитным механизмом, в котором участвуют макрофаги, является индукция активации и дифференцировки Т-хелперов. Макрофаги конститутивно экспрессируют гены, кодирующие ИЬЛ класса II и костимуляторную молекулу С086 (данные не представлены). Поскольку при активации М-триДАП отсутствует значимая экспрессия ИФН I типа (рис. 3) и не экс-прессируется ген 1Ь12Л, кодирующий р35-субъединицу ИЛ-12 (данные не представлены), можно предполагать низкую способность М-триДАП-активированных макрофагов поддерживать дифференцировку Т-хелперов 1-го типа.
Вместе с тем при активации через N001 макрофаги экспрессируют гены инструктивных цитокинов, необходимых для дифференцировки ТЫ7-клеток: гены инструктивных цитокинов [ТОЕБ1 - конститутивно (данные не представлены), 1Ьб, 1Ь1Б, 1112Б и 1123Л - ин-дуцибельно (см. рис. 3 А)], а также гены компонентов ин-фламмасомы, необходимых для процессинга и секреции
->
Рис. 3. Экспрессия отдельных генов и их наборов при активации макрофагов М-триДАП и ЛПС
А - индексы стимуляции указанных генов (объединенные данные RNЛ-seq и ПЦР-РВ). Горизонтальные линии в группах - средние значения; Б - детекция белка EGR1 с помощью вестерн-блоттинга в ядрах и цитоплазме макрофагов, культивированных без агонистов, с М-триДАП и ЛПС; В - тепловая карта экспрессии ЛС0Б1 и индуцибельных хемокинов с антимикробными свойствами по данным RNЛ-seq; Г - тепловая карта экспрессии генов, кодирующих медиаторы воспаления (набор Иа11тагк_тА1ат-matory_response) по данным RNЛ-seq; Д - тепловая карта экспрессии генов, кодирующих гены интерферонового ответа (набор Иallmark_interferon_alpha_response) по данным RNЛ-seq. Гены, представленные на графиках А, В, Г и Д, выбраны из множества 589 индуцибельных генов.
Э
420-2 ■
EGR1
33-
♦т
.........
12 -| | 105 8-з
« 6 -
£ 6
S 4-
н о
а 2-
и S
1L6
10 -| 8 64 20
1L23A
8 64 20-2 10
864 20 12 -|
10
8 6
420
1FNB1
▼ т
-Т-г
1L1B
10-, МХ1
т 8- т
т т
♦ 6- ♦
т
♦ т 4- т ♦
♦ - ♦ 2- т
т о ♦ V тт
т т 0- f-y- т ■ф
10-, IL12B
т тт ♦ т
8- т т ▼
-J- ▼ ♦♦ т т т
♦♦ ▼ 6- т ♦ V т
у т ♦т ♦ ♦
т 4- ♦♦ т ▼ т ♦ ♦
2-
0
NLRP3
1 ч 4 ч 9 ч 1 ч 4 ч 9 ч
М-триДАП ЛПС
♦ RNA-seq ▼ RT-PCR
1 ч 4 ч 9 ч 1 ч 4 ч 9 ч
1 ч 4 ч 9 ч 1 ч 4 ч 9 ч
Э
Э
Время (ч) 1
М-триДАП ЛПС Без аг. М-триДАП ЛПС
М-триДАП ЛПС
Без аг. М-триДАП
ЛПС
Время (ч)
EGR1 <57кДа)
1 2 3 1 2 3 1 2 3
— _
М-триДАП
Ядра ЛПС
э
М-триДАП ЛПС
4 9 1
4 9
Время (ч) 1
ACOD1
CCL20
CXCL8
CCL4
CXCL1
CXCL3
CCL1
CCL23
CXCL2
CXCL6
CCL8
CXCL10
Цитозоль ^^ М-триДАП
Время (ч) 1 4 9
ЛПС
[ < ■: 1 ''-'У
ITGBS EBI3 s: \м '
Для графиков В-Д:
<0
1,0
9,0
Индекс стимуляции
(log2)
CXCCL10 OASL IFIT2 RSAD2 ISG20 СМРК2 IFI44L GBP4 BATF2 IFIT3 EPSTI1 МХ1 ISG15 USP18 HELZ2 IL7
LAMP3 IFI44 IFIH1 RTP4 IRF7 IL15
SAMD9L IRF1 IFITM3 PARP14 GBR2 DDX60 OAS1 RIPK2 DHX58 PLSCR1 PARP9 EIF2AK2 SAMD9 NUB1 SP110 HERC6 STAT2 PNPT1 EFI35 IKF9 LAP3 ■ CSF1
6
ИЛ-1Р [ASC/PYCARD и CASP1 - конститутивно (данные не представлены), NLRP3 - индуцибельно (рис. 3 А)]. Эти результаты позволяют предположить, что макрофаги, активированные агонистом NOD1, могут индуцировать дифференцировку Т-хелперов по ТЪ17-пути.
Обсуждение
В данной работе предпринята попытка выявить отличительные особенности транскриптома макрофагов, активированных агонистом рецептора NOD1. В качестве препарата сравнения использовали ЛПС E. coli O111:B4 - хорошо изученный агонист TLR4.
Оба агониста индуцировали экспрессию нескольких сотен генов, регулируемых факторами транскрипции семейств NF-kB и AP-1. Главное системное различие эффектов ЛПС и М-триДАП состояло в индукции более мощного интерферонового ответа под действием ЛПС. М-триДАП проявил себя как весьма слабый индуктор ИФН I типа, что согласуется с данными литературы [20-22]. Интересно, что в ряде работ показана защитная роль NOD1- и NOD2-зависимой продукции ИФН-Р при вирусных инфекциях [19, 22-24]. Наши данные не противоречат этим работам, поскольку защитные эффекты NOD1 и NOD2 могут проявляться в условиях уже развившейся вирусной инфекции: 1) агонисты NOD1 и NOD2 могут потенцировать вирус-индуцированную продукцию ИФН I типа [19, 22]; 2) агонисты NOD2 могут усиливать миграцию интерферон-продуцирующих клеток в очаг инфекции [23]; 3) описано агонист-не-зависимое участие NOD1 и NOD2 в ответе клеток на стресс [24], который может быть вызван в том числе вирусной инфекцией.
Хотя мы обнаружили гены, селективно отвечающие на стимуляцию NOD1, но не TLR4, общие функциональные характеристики этих генов установить не удалось. Анализ сайтов связывания факторов транскрипции показал, что значимую роль в регуляции экспрессии этих генов могут играть представители семейств EGR, KLF и SP (что, однако, не исключает роль этих факторов и в активации клетки под действием ЛПС).
■ Литература / References
1. Tukhvatulin A., Dzharullaeva A.S., Tukhvatulina N.M., Shche-blyakov D.V., Shmarov M.M., Dolzhikova I.V., et al. Powerful complex immunoadjuvant based on synergistic effect of combined TLR4 and NOD2 activation significantly enhances magnitude of humoral and cellular adaptive immune responses. PLoS One. 2016; 11 (5): e0155650. DOI: https:// doi.org/10.1371/journal.pone.0155650
2. Tukhvatulin A.I., Gitlin I.I., Shcheblyakov D.V., Artemi-cheva N.M., Burdely L.G., Shmarov M.M., et al. Combined stimulation of Toll-like receptor 5 and Nod1 strongly potentiates activity of NF-kB, resulting in enhanced innate immune reactions and resistance to Salmonella enterica serovar typhimurium infection. Infect. Immun. 2013; 81 (10): 3855-64. DOI: https://doi.org/10.1128/IAI.00525-13
3. Pashenkov M., Goess G., Wagner C., Hormann M., Jandl Т., Moser A., et al. Phase II trial of a toll-like receptor 9-activating oligonucle-otide in patients with metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 2006; 24 (36): 5716-24. DOI: https://doi.org/10.1200/JCO.2006.07.9129
4. Pashenkov M.V., Dagil Y.A., Pinegin B.V. NOD1 and NOD2: Molecular targets in prevention and treatment of infectious diseases. Int.
Наряду с индуцибельными генами мы обнаружили сопоставимое число генов со снижением экспрессии мРНК (см. рис. 1А). Отсутствие таких генов через 1 ч и их появление через 4 ч после начала стимуляции указывает на возможную роль мкРНК в данном процессе, поскольку на синтез мкРНК de novo требуется время. По данным анализа генных наборов коллекции C3.MIR, каждая из 2598 мкРНК, входящих в коллекцию, таргетирует не более 5 % от общего числа генов с понижением экспрессии. Тем не менее 40 мкРНК с наибольшим количеством мишеней таргетировали ~ 56 % из 348 мРНК, для которых наблюдалось понижение экспрессии при стимуляции макрофагов М-триДАП в течение 4 ч. Поскольку экспрессию самих мкРНК не измеряли, делать какие-либо выводы об участии конкретных мкРНК в формировании транскриптома М-триДАП-стимулированных макрофагов на основании данной работы не представляется возможным. Альтернативным механизмом понижения уровней мРНК может быть подавление транскрипции.
Среди защитных механизмов, запускаемых в макрофагах при стимуляции агонистом NOD1 и выявляемых путем анализа транскриптома, необходимо отметить: 1) повышение экспрессии генов, кодирующих белки с антимикробными свойствами (ACOD1, гены хемо-кинов); 2) повышение экспрессии генов, кодирующих медиаторы воспаления; 3) повышение экспрессии генов, необходимых для индукции дифференцировки ТЪ17-клеток.
Этот комплекс механизмов позволяет рекомендовать агонисты NOD1 для профилактики и лечения инфекций, вызванных внеклеточными формами бактерий и грибов. Поскольку ИФН I типа не участвуют в борьбе с данными классами патогенов, отсутствие их индукции можно рассматривать как преимущество, поскольку избыточная выработка этих цитокинов может приводить к развитию и/или обострению ряда аутоиммунных заболеваний, таких как системная красная волчанка и псориаз [25-27]. Вместе с тем агонисты NOD1 не являются оптимальными для профилактики инфекций, вызванных внутриклеточными паразитами.
Immunopharmacol. 2018; 54: 385-400. DOI: https://doi.org/10.1016/j.in-timp.2017.11.036
5. Napolitani G., Rinaldi A., Bertoni F., Sallusto F., Lanzavecchia A. Selected Toll-like receptor agonist combinations synergistically trigger a T helper type 1 -polarizing program in dendritic cells. Nat. Immunol. 2005; 6 (8): 769-76. DOI: https://doi.org/10.1038/ni1223
6. Ramirez-Carrozzi V.R., Braas D., Bhatt D.M., Cheng C.S., Hong C., Doty K.R., et al. A unifying model for the selective regulation of inducible transcription by CpG islands and nucleosome remodeling. Cell. 2009; 138 (1): 114-28. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.04.020
7. Bhatt D.M., Pandya-Jones A., Tong A.J., Barozzi I., Lissner M.M., Natoli G., et al. Transcript dynamics of proinflammatory genes revealed by sequence analysis of subcellular RNA fractions. Cell. 2012; 150 (2): 279-90. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2012.05.043
8. Patro R., Duggal G., Love M.I., Irizarry R.A., Kingsford C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat. Methods. 2017; 14 (4): 417-9. DOI: https://doi.org/10.1038/ nmeth.4197
9. Subramanian A., Tamayo P., Mootha V.K., Mukherjee S., Ebert B.L., Gillette M.A., et al. Gene set enrichment analysis: A knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2005; 102 (43): 15 545-50. DOI: https://doi. org/10.1073/pnas.0506580102
10. Benjamini Y., Hochberg Y. Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing. J. R. Stat. Soc. Ser. B. 1995; 57 (1): 289-300. DOI: https://doi.org/10.1111/j.2517-6161.1995. tb02031.x
11. Budikhina A.S., Murugina N.E., Maximchik P.V., Dagil Y.A., Niko-laeva A.M., Balyasova L.S., et al. Interplay between NOD1 and TLR4 receptors in macrophages: nonsynergistic activation of signaling pathways results in synergistic induction of proinflammatory gene expression. J. Immunol. 2021; 206 (9): 2206-20. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.2000692
12. Gearing L.J., Cumming H.E., Chapman R., Finkel A.M., Wood-house I.B., Luu K., et al. CiIIder: A tool for predicting and analysing transcription factor binding sites. PLoS One. 2019; 14 (9): e0215495. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0215495
13. Yung S.C., Murphy P.M. Antimicrobial chemokines. Front. Immunol. 2012; 3: 276. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2012.00276
14. Michelucci A., Cordes T., Ghelfi J., Pailot A., Reiling N., Goldmann O., et al. Immune-responsive gene 1 protein links metabolism to immunity by catalyzing itaconic acid production. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2013; 110 (19): 7820-5. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.1218599110
15. Yamamoto M., Sato S., Hemmi H., Hoshino K., Kaisho T., Sanjo H., et al. Role of adaptor TRIF in the MyD88-independent tolllike receptor signaling pathway. Science. 2003; 301 (5633): 640-3. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1087262
16. Sheikh F., Dickensheets H., Gamero A.M., Vogel S.N., Donnelly R.P. An essential role for IFN-ß in the induction of IFN-stimulated gene expression by LPS in macrophages. J. Leukoc. Biol. 2014; 96 (4): 591-600. DOI: https://doi.org/10.1189/jlb.2A0414-191R
17. Watanabe T., Asano N., Fichtner-Feigl S., Gorelick P.L., Tsuji Y., Matsumoto Y., et al. NOD1 contributes to mouse host defense against He-licobacter pylori via induction of type I IFN and activation of the ISGF3 signaling pathway. J. Clin. Invest. 2010; 120 (5): 1645-62. DOI: https:// doi.org/10.1172/jci39481
18. Pandey A.K., Yang Y., Jiang Z., Fortune S.M., Coulombe F., Behr M.A., et al. NOD2, RIP2 and IRF5 play a critical role in the type I
Сведения об авторах
Масютина Анна Михайловна - мл. науч. сотр. лаб. клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1904-6714
Муругина Нина Евгеньевна - мл. науч. сотр. лаб. клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-7000-5729
Пащенкова Юлия Геннадьевна - канд. мед. наук, мл. науч. сотр. лаб. клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected]
Пащенков Михаил Владимирович - д-р мед. наук, и.о. зав. лаб. клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6995-1790
interferon response to Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathog. 2009; 5 (7): e1000500. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000500
19. Fan Y.H., Roy S., Mukhopadhyay R., Kapoor A., Duggal P., Wojcik G.L., et al. Role of nucleotide-binding oligomerization domain 1 (NOD1) and its variants in human cytomegalovirus control in vitro and in vivo. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2016; 113 (48): E7818-27. DOI: https:// doi.org/10.1073/pnas.1611711113
20. Stockinger S., Reutterer B., Schaljo B., Schellack C., Brunner S., Materna T., et al. IFN regulatory factor 3-dependent induction of type I IFNs by intracellular bacteria is mediated by a TLR- and Nod2-indepen-dent mechanism. J. Immunol. 2004; 173 (12): 7416-25. DOI: https://doi. org/10.4049/jimmunol.173.12.7416
21. Werts C., le Bourhis L., Liu J., Magalhaes J.G., Carneiro L.A., Fritz J.H., et al. Nod1 and Nod2 induce CCL5/RANTES through the NF-kappaB pathway. Eur. J. Immunol. 2007; 37 (9): 2499-508. DOI: https:// doi.org/10.1002/eji.200737069
22. Kapoor A., Fan Y.H., Arav-Boger R. Bacterial Muramyl Di-peptide (MDP) restricts human cytomegalovirus replication via an IFN-ß-dependent pathway. Sci. Rep. 2016; 6: 20295. DOI: https://doi. org/10.1038/srep20295
23. Coulombe F., Fiola S., Akira S., Cormier Y., Gosselin J. Muramyl dipeptide induces NOD2-dependent Ly6C(high) monocyte recruitment to the lungs and protects against influenza virus infection. PLoS One. 2012; 7 (5): e36734. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0036734
24. Pei G., Zyla J., He L., Moura-Alves P., Steinle H., Saikali P., et al. Cellular stress promotes NOD1/2-dependent inflammation via the endogenous metabolite sphingosine-1-phosphate. EMBO J. 2021; 40 (13): e106272. DOI: https://doi.org/10.15252/embj.2020106272
25. Crow M.K. Type I interferon in the pathogenesis of lupus. J. Immunol. 2014; 192 (12): 5459. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmu-nol.1002795
26. Afshar M., Martinez A.D., Gallo R.L., Hata T.R. Induction and exacerbation of psoriasis with Interferon-alpha therapy for hepatitis C: A review and analysis of 36 cases. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 2013; 27 (6): 771. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1468-3083.2012.04582.x
27. Nestle F.O., Conrad C., Tun-Kyi A., Homey B., Gombert M., Boyman O., et al. Plasmacytoid predendritic cells initiate psoriasis through interferon-a production. J. Exp. Med. 2005; 202 (1): 135-143. DOI: https:// doi.org/10.1084/jem.20050500
Authors' information
Anna M. Masyutina - Junior Researcher of Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1904-6714
Nina E. Murugina - Junior Researcher of Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-7000-5729
Yulia G. Pashchenkova - PhD, Junior Researcher of Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected]
Mikhail V. Pashenkov - MD, PhD, Acting Head of Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6995-1790
