CC BY
34
© Коллектив авторов, 2022
Муругина Н.Е., Муругин В.В., Пащенков М.В.
Противоопухолевая активность макрофагов человека, активированных агонистами рецепторов NOD1 и TLR4 in vitro
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Опухоль-ассоциированные макрофаги играют важную роль в развитии Для корреспонденции
опухоли, модулируя воспаление, иммуносупрессию и ангиогенез. В зависимости от мик- Пащентв Михаил Владимирович -
доктор медицинских наук,
роокружения макрофаги могут проявлять как проопухолевую, так и противоопухоле- ио заведующего лабораторией
вую активность. Агонисты паттерн-распознающих рецепторов, включая Толл-подобные клинической иммунологии
(TLR) и NOD-рецепторы, способствуют индукции противоопухолевой активности мак- ФГБУ «ГЩ Инсти^ иммунологии» рофагов. Известно, что при сочетанной стимуляции рецепторов NOD1 и TLR4 в макро- „ ФМБА Pоссии,
Москва, Российская Федерация
фагах и в других типах клеток происходит синергическое усиление экспрессии и продук- E-mail: [email protected]
ции провоспалительных цитокинов. Однако влияние сочетания агонистов NOD1 и TLR4 https://orcid.org/0000-0002-6995-1790 на противоопухолевые свойства макрофагов не изучено.
Цель исследования - изучение механизмов противоопухолевой активности макрофагов, стимулированных агонистами рецепторов NOD1, TLR4 и их сочетанием in vitro.
Материал и методы. В качестве мишеней для макрофагов использовали клетки эрит-ромиелоидной HLA-I-негативной линии К562, меченные CFSE. Клетки-мишени со-культивировали с макрофагами человека в присутствии агониста NOD1, агониста TLR4, их сочетания либо без агонистов. Контролем служили культуры К562 без макрофагов. Через 72 ч после начала эксперимента оценивали содержание жизнеспособных клеток-мишеней в культурах с помощью проточной цитометрии. Чтобы уточнить вклад растворимых медиаторов и поверхностных молекул в противоопухолевую активность макрофагов, изучали влияние супернатантов активированных макрофагов на клетки К562, а также разделяли макрофаги и клетки К562 с помощью полупроницаемых мембран. Для оценки вклада фактора некроза опухоли (ФНО) и ИФН-Р в противоопухолевое действие макрофагов использовали нейтрализующие антитела. НАДФН-оксидазу ингибировали с помощью апоцинина.
Результаты. Макрофаги, не активированные агонистами NOD1 или TLR4, усиливали рост опухолевых клеток К562 по сравнению с контролем. Отдельно взятые агонисты NOD1 и TLR4 отменяли проопухолевое действие макрофагов, тогда как стимуляция макрофагов сочетанием агонистов приводила к многократному снижению численности клеток К562 по сравнению с контролем. В отсутствие макрофагов агонисты NOD1 и TLR4 не влияли на численность клеток К562. Противоопухолевое действие макрофагов, активированных сочетанием агонистов NOD1 и TLR4, частично отменялось антителами к ФНО и при разделении макрофагов и клеток К562 полупроницаемой мембраной. Показано, что одним из компонентов противоопухолевой активности макрофагов, активированных сочетанием агонистов NOD1 и TLR4, является антипролиферативный эффект.
Обсуждение содержит анализ возможных механизмов противоопухолевого действия макрофагов, активированных сочетанием агонистов NOD1 и TLR4.
Заключение. Показана возможность переключения активности макрофагов человека с проопухолевой на противоопухолевую при действии сочетания агонистов NOD1 и TLR4 in vitro. Для реализации противоопухолевого ответа макрофагов против клеток К562 необходимы секреция ФНО и прямое межклеточное взаимодействие между К562 и макрофагами. Полученные результаты позволяют рассматривать сочетание агонистов NOD1 и TLR4 в качестве потенциального противоопухолевого препарата.
Ключевые слова: макрофаги; противоопухолевый иммунитет; клетки К562; паттерн-распознающие рецепторы; NOD1; TLR4; фактор некроза опухолей
Статья получена 14.07.2022. Принята в печать 30.08.2022.
Для цитирования: Муругина Н.Е., Муругин В.В., Пащенков М.В. Противоопухолевая активность макрофагов человека, активированных агонистами рецепторов NOD1 и TLR4 in vitro. Иммунология. 2022; 43 (5): 548-557. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-548-557
Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 21-15-00211. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Постановка экспериментов, написание статьи - Муругина Н.Е.; постановка экспериментов - Муругин В.В.; планирование и постановка экспериментов, написание и редактирование статьи -Пащенков М. В.
Murugina N.E., Murugin V.V., Pashenkov M.V.
Antitumor activity of human macrophages activated by NOD1 and TLR4 receptor agonists in vitro
National Research Center - Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. Tumor-associated macrophages play an important role in tumor development by modulating inflammation, immunosuppression and angiogenesis. Depending on the microenvironment, macrophages can exhibit both pro- and antitumor activity. Agonists of pattern recognition receptors, including Toll-like receptors (TLR) and NOD receptors, promote the induction of antitumor activity of macrophages. It is known that combined stimulation of NOD1 and TLR4 receptors in macrophages and other cell types results in a synergistic increase in the expression and production of pro-inflammatory cytokines. However, the effect of a combination of NOD1 and TLR4 agonists on the antitumor properties of macrophages has not been studied.
The aim of the work was to study the mechanisms of antitumor activity of macrophages stimulated by NOD1, TLR4 receptor agonists and their combination in vitro.
Material and methods. The cells of the erythromyeloid HLA-I-negative K562 line labeled with CFSE were used as targets for macrophages. Target cells were cocultured with human macrophages in the presence of a NOD1 agonist, TLR4 agonist, combination thereof or without agonists. K562 cultures without macrophages served as controls. 72 hours after the start of the experiment, the content of viable target cells in cultures was assessed using flow cytometry. To clarify the contribution of soluble mediators and surface molecules to the antitumor activity of macrophages, the effect of activated macrophage supernatants on K562 cells was studied, and macrophages and K562 cells were separated using semipermeable membranes. Neutralizing antibodies were used to assess the contribution of TNF and IFN-p to the antitumor effect of macrophages. NADPH oxidase was inhibited with apocynin.
Results. Macrophages not activated by NOD1 or TLR4 agonists enhanced the growth of K562 tumor cells compared to the control. Separate NOD1 and TLR4 agonists abolished the protumor effect of macrophages, while stimulation of macrophages with a combination of agonists led to a multiple decrease in the number of K562 cells compared to the control. In the absence of macrophages NOD1 and TLR4 agonists did not affect the number of K562 cells. The antitumor effect of macrophages activated by a combination of NOD1 and TLR4 agonists was partially abolished by anti-TNF antibodies and when macrophages and K562 cells were separated by a semipermeable membrane. It has been shown that one of the components of the antitumor activity of macrophages activated by a combination of NOD1 and TLR4 agonists is an antiproliferative effect.
Discussion contains an analysis of the possible mechanisms of the antitumor effect of macrophages activated by a combination of NOD1 and TLR4 agonists.
Conclusion. The possibility of switching the activity of human macrophages from protumor to antitumor under the action of a combination of NOD1 and TLR4 agonists in vitro has been shown. To implement the antitumor response of macrophages against K562 cells, TNF secretion and direct intercellular interaction between K562 and macrophages are required. The results obtained allow to consider the combination of NOD1 and TLR4 agonists as a potential anticancer drug.
For correspondence
Mikhail V. Pashenkov -MD, PhD, Acting Head of the Laboratory of Clinical Immunology, NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6995-1790
Keywords: macrophages; antitumor immunity; K562 cells; pattern recognition receptors; NOD1; TLR4; tumor necrosis factor
Received 14.07.2022. Accepted 30.08.2022.
For citation: Murugina N.E., Murugin V.V., Pashenkov M.V. Antitumor activity of human macrophages activated by NOD1 and TLR4 receptor agonists in vitro. Immunologiya. 2022; 43 (5): 548-57. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-548-557
Funding. The work was supported by the Russian Science Foundation grant No. 21-15-00211. Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Performing experiments, writing the article - Murugina N.E.; performing experiments -Murugin V.V.; planning and performing experiments, writing and editing the article - Pashenkov M.V.
Введение
Опухоль-ассоциированные макрофаги играют одну из ключевых ролей в регуляции роста злокачественной опухоли. Макрофаги - довольно пластичная клеточная популяция: в зависимости от микроокружения они способны дифференцироваться либо в М2-макрофаги, которые участвуют в поддержании опухолевого роста и содействуют метастатической диссеминации, либо в противоопухолевые М1-макрофаги [1, 2]. М1-макрофаги секретируют провоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухоли (ФНО, ранее известен как ФНОа), интерлейкины ИЛ-ip, ИЛ-6, ИЛ-12 и ИЛ-23, метаболизируют аргинин до оксида азота (NO) путем активации индуцируемой NO-синтазы (iNOS) [3]. Ключевым фактором противоопухолевого действия М1-макрофагов является ФНО, который оказывает непосредственное повреждающее действие на клетки опухоли [4] и совместно с ИЛ-12 участвует в активации цитотоксических противоопухолевых Т-клеток [5]. ФНО также может служить аутокринным регулятором активации макрофагов [6]. Макрофаги могут непосредственно уничтожать опухолевые клетки при помощи NO, активных форм кислорода или путем фагоцитоза [7, 8].
Показано, что для реализации механизмов противоопухолевой активности необходима инфильтрация опухоли макрофагами с М1-подобным фенотипом, которые обладают способностью убивать опухолевые клетки. Изменение поляризации макрофагов в сторону М1 возможно при активации паттерн-распознающих рецепторов, которые координируют элиминацию патогенов и инфицированных клеток [9, 10]. Так, некоторые аго-нисты Толл-подобных рецепторов (резиквимод, ими-квимод) используются для местного лечения рака кожи [11, 12].
В агрессивной модели метастатического рака молочной железы мыши 4T1 применение кислого пепти-догликана растительного происхождения как агониста TLR4 приводит к успешному излечению от опухоли 30 % мышей [13]. В работе C.B. Rodell и соавт. в модели на мышах показано, что наночастицы, нагруженные R848, агонистом TLR7/8, накапливаются в опухоли, поляризуют макрофаги в М1-тип и подавляют
рост опухоли толстой кишки [14]. R848, конъюгиро-ванный с антителами, нацеленными на опухоль, вызывает сильную локальную активацию макрофагов и дендритных клеток, приводя к уничтожению опухоли и формированию иммунологической памяти в моделях опухоли молочной железы [15]. БЦЖ активирует макрофаги через Толл-подобные рецепторы 2/4 (TLR2/4) и стимулирует перитонеальные макрофаги мышей к М1-поляризации, что приводит к киллингу клеток опухоли MCA207 [16, 17].
Цитозольные паттерн-распознающие рецепторы NOD1 и NOD2 также представляют собой интересные мишени с точки зрения усиления иммунного ответа против раковых клеток, таккак активация NOD1 и NOD2 способствует поляризации макрофагов в сторону фенотипа M1. Так, у мышей с нокаутом гена Nodi при заражении Helicobacter pylori нарушена поляризация макрофагов в фенотип М1, что способствует повышенному риску развития рака желудка [18]. Синтетический агонист NOD2 мифамуртид, также известный как липосомальный мурамилтрипептид-фосфатиди-лэтаноламин, применяемый при лечении неметаста-зирующей остеосаркомы, индуцирует поляризацию макрофагов до промежуточного фенотипа M1/M2 [19, 20]. Таким образом, усиление противоопухолевой активности макрофагов с помощью агонистов паттерн-распознающих рецепторов является перспективным направлением в противоопухолевой иммунотерапии.
При одновременной стимуляции двух и более типов паттерн-распознающих рецепторов происходит си-нергическое усиление некоторых видов ответа клеток врожденной иммунной системы [21]. Совместная активация макрофагов агонистами TLR3 и TLR4 приводит к кратному усилению экспрессии генов, кодирующих противоопухолевые эффекторные белки, в частности iNOS и ИФН-ß, а также к значительному усилению противоопухолевого цитотоксического действия макрофагов [22].
Ранее нами и другими авторами было установлено, что при сочетанной стимуляции рецепторов NOD1 и TLR4 в макрофагах, моноцитах и дендритных клетках наблюдается синергическое усиление экспрессии и продукции провоспалительных цитокинов [21, 23, 24]. В настоящей работе впервые проведено исследование
противоопухолевой активности макрофагов человека, активированных агонистами паттерн-распознающих рецепторов NOD1 и TLR4 раздельно и в сочетании. В качестве агониста NOD1 использовали N-ацетилмурамил-L-aлaнил-y-D-глyтaмил-мезo-диaминoпимелинoвyю кислоту (M-триДАП), в качестве агониста TLR4 - липо-полисахарид (ЛПС).
Материал и методы
Реактивы. Синтетический M-триДАП и ультрачистый ЛПС, полученный из E. coli O111:B4, были закуплены у фирмы InvivoGen (США), рекомбинантный человеческий гранулоцитарно-макрофагальный коло-ниестимулирующий фактор (ГM-KСФ) и ФИО - у Mil-tenyi Biotec (ФРГ), апоцинин - у Abcam (Великобритания), козьи поликлональные нейтрализующие антитела против человеческого ФИО и нормальный козий IgG -у R&D Systems (США), овечьи поликлональные нейтрализующие антитела против ИФИ-ß - у Life Technologies (Великобритания), 5,6-карбоксифлюоресцеиндиацетат-сукцинимидиловый эфир (CFSE) - у Molecular Probes (США), пропидий-йодид (PI) и полимиксин B - у фирмы Sigma (США). Полная культуральная среда (ПКС) представляла собой RPMI-1640 (Life Technologies) с добавлением 2 мM L-глутамина (Life Technologies) и 10 % фетальной телячьей сыворотки (Thermo Fisher, США).
Ведение и мечение клеток К562. В качестве мишени для макрофагов использовали клетки эритромие-лоидной HLA-I-негативной линии К562. Клетки К562 вели на ПКС, пассировали каждые 2-3 сут. Для опыта использовали клетки на 2-е сутки после пересева. Для мечения клетки-мишени К562 отмывали в PBS, ресуспендировали в том же буфере в концентрации 10 млн/мл и инкубировали 30 мин при 37 °С с 1,2 мкM CFSE. Mечение останавливали добавлением избытка PBS с 10 % фетальной телячьей сыворотки. Mеченые клетки отмывали, ресуспендировали в ПКС и подсчитывали.
Культивирование макрофагов. Каждый эксперимент повторяли на культурах макрофагов, полученных не менее чем от 3 различных доноров. Венозную кровь получали от здоровых доноров обоего пола в возрасте 20-60 лет. Moнoнyклеaрные клетки (ЫИК) выделяли на градиенте плотности фиколла, отмывали и подсчитывали. Далее MHK ресуспендировали в среде RPMI с добавлением 1 % пуловой человеческой сыворотки IV группы в концентрации 10 млн/мл. Вносили 5 мл суспензии M^K в чашки Петри диаметром 60 мм (SPL Life Sciences, Республика Корея) и инкубировали в течение 1 ч в CO2-инкyбaтoре с поддержанием температуры 37 °С и концентрации СО2 5 % (Jouan, Франция). После этого неприлипшие клетки удаляли путем двукратной промывки теплой RPMI-1640, а прилипшие клетки (моноциты) культивировали в ПКС с добавлением 40 нг/мл TM-КСФ в течение 6 сут. Иа 3-и сутки культуральную среду полностью меняли на свежую ПКС с добавлением
ГМ-КСФ в той же концентрации. Через 6 сут дифференцированные макрофаги отделяли от пластика трипсини-зированием, отмывали и подсчитывали.
Оценка противоопухолевых свойств макрофагов. Макрофаги помещали в 24-луночные планшеты (SPL Life Sciences, Республика Корея) в количестве 2 • 105 клеток (если не указано иное) в 400 мкл ПКС на лунку. Планшеты оставляли на 24 ч в CO2-инкубаторе для прикрепления макрофагов к пластику. Через 24 ч меняли ПКС на свежую. Далее к макрофагам добавляли М-триДАП (конечная концентрация - 10 мкг/мл), либо ЛПС (конечная концентрация - 10 нг/мл), либо сочетание М-триДАП и ЛПС в тех же концентрациях, либо рекомбинантный ФНО (конечная концентрация -100 нг/мл), либо равный объем ПКС. Сразу после этого в лунки вносили клетки К562, меченные CFSE, в количестве 4 • 103 на лунку (соотношение эффектор/ мишень - 50 : 1, если не указано иное). Суммарный объем среды в лунках составлял 400 мкл. Контролем служили культуры К562 без макрофагов. Нейтрализующие антитела к ФНО и контрольный козий IgG (конечные концентрации - 7,5 мкг/мл), нейтрализующие антитела к ИФН-Р (конечная концентрация -1,36 • 103 НЕ/мл) и апоцинин (конечная концентрация -100 мкМ) вносили за 15 мин до внесения агонистов и клеток К562.
Планшеты инкубировали в течение 24 или 72 ч в CO2-инкубаторе, после чего оценивали количество живых клеток К562 методом проточной цитометрии. Неприлипшие и слабо прилипшие клетки К562 взбалтывали в имеющемся объеме супернатанта, который полностью переносили в цитометрические пробирки с добавлением PI до конечной концентрации 1 мкг/мл. Оставшиеся прилипшие клетки трипсинизировали, собирали, доводили объем до 400 мкл с помощью ПКС, переносили в цитометрические пробирки и добавляли PI (1 мкг/мл). Все пробы записывали на проточном ци-тометре FACSCalibur (BD Biosciences, США) в течение 120 с, что соответствует 30 % объема пробы. Постоянство скорости потока контролировали с помощью частиц Flow-Check™ (Beckman Coulter, США). Живые клетки К562 определяли как CFSE+PI-события. Пробы с неприлипшими и прилипшими клетками из каждой лунки записывали раздельно, число живых К562 в обеих пробах суммировали. Результаты выражали в процентах по отношению к численности живых клеток К562 в культурах без макрофагов в том же эксперименте.
Эффект сочетания агонистов NOD1 и TLR4 оценивали по индексу синергизма (ИС), который рассчитывали по формуле: ИС = (A - D)/[(B - D) + (C - D)], где A - количество живых клеток К562 в культурах с М-триДАП+ЛПС, B - с М-триДАП, C - с ЛПС, D - без агонистов.
Опыты с переносом супернатантов. Для получения супернатантов макрофаги (2 • 105 клеток в 400 мкл ПКС) культивировали в 24-луночных планшетах в течение 72 ч без агонистов или с М-триДАП+ЛПС. Су-пернатанты полностью собирали и центрифугировали
10 мин при 16 000 об/мин для осаждения клеточных фрагментов, надосадок аккуратно отбирали в стерильные пробирки. Для нейтрализации остаточного ЛПС супернатанты инкубировали с 50 мкг/мл антагониста ЛПС - полимиксина B, для нейтрализации ФНО -с 7,5 мкг/мл нейтрализующих антител к ФНО (все в течение 30 мин при 37 °C). Далее из отдельно подготовленных лунок с неактивированными аутологичными макрофагами (2 • 105) полностью отбирали культуральную среду и заменяли ее на равный объем супернатантов, после чего вносили CFSE-меченные клетки К562 (4 • 103).
Содержание живых клеток К562 оценивали через 72 ч, как описано выше. Прямое действие супернатан-тов на клетки К562 оценивали аналогичным образом, но супернатанты переносили в свежие лунки без макрофагов.
Опыты с разобщением макрофагов и клеток К562. Использовали 24-луночные трансвелл-планшеты с полупроницаемыми мембранами (диаметр пор -8 мкм, Corning, США). Макрофаги (2 • 105) и агонисты NOD1 и TLR4 помещали в нижние камеры планшетов, клетки К562 (4 • 103) - в верхние. Через 72 ч собирали клетки из верхних камер, анализировали содержание живых К562 с помощью проточного цитометра, как описано выше.
Иммуноферментный анализ. Макрофаги культивировали с М-триДАП, ЛПС, М-триДАП+ЛПС или без агонистов в течение 24, 48 и 72 ч. Уровни ФНО в куль-туральных супернатантах определяли методом сэнд-вич-ИФА с использованием набора реагентов TNF alpha Human ELISA Kit (Thermo Scientific, США)
Статистическая обработка данных. Все значения p получены с помощью парного t-теста. Различия считали достоверными при p < 0,05. Для статистической обработки использовали программу GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, США).
Результаты
Противоопухолевая активность макрофагов, стимулированных агонистами NOD1, TLR4 и их сочетанием
Опухолевые клетки К562 культивировали без макрофагов (контроль), а также с макрофагами в отсутствие агонистов и с М-триДАП и ЛПС по отдельности и в сочетании. Через 24 ч после начала эксперимента достоверных различий численности клеток К562 в различных условиях культивирования не было выявлено (рис. 1А). Через 72 ч после начала опыта отмечалось достоверное увеличение численности опухолевых клеток в культурах с макрофагами без агонистов по сравнению с контролем, что говорит об усиливающем действии наивных макрофагов на рост опухолевых клеток (рис. 1Б). При культивировании К562 с макрофагами в присутствии отдельно взятых агонистов NOD1 или TLR4 численность опухолевых клеток снижалась примерно до уровня контроля. Если же агонисты NOD1 и TLR4 добавляли в культуры одновременно, то чис-
ленность опухолевых клеток снижалась в среднем в 3 раза по сравнению с контролем (рис. 1Б). Судя по индексу синергизма, эффект сочетания агонистов был близок к аддитивному (рис. 1В). Противоопухолевый эффект макрофагов, активированных сочетанием М-триДАП+ЛПС, наблюдался как при соотношении макрофаги/К562 50 : 1 (рис. 1 А, Б), так и при более низких соотношениях (рис. 1Г). В отсутствие макрофагов М-триДАП и ЛПС раздельно и в сочетании не влияли на численность клеток К562 (рис. 1Д). Таким образом, сочетание агонистов N001 и ТЬЯ4 переключает активность макрофагов человека с проопухолевой на противоопухолевую.
Роль ФНО в противоопухолевой активности макрофагов
Чтобы уточнить механизмы противоопухолевого действия макрофагов, активированных сочетанием М-триДАП + ЛПС, в культуры добавляли нейтрализующие антитела к ФНО, к ИФН-Р или нормальный козий в качестве отрицательного контроля. Антитела к ФНО частично ингибировали противоопухолевое действие макрофагов, тогда как антитела к ИФН-Р достоверного эффекта не оказали (рис. 2А). Иммуноферментный анализ (ИФА) показал, что в супернатантах макрофагов, активированных сочетанием М-триДАП + ЛПС, присутствуют высокие концентрации ФНО (рис. 2Б). Рекомбинантный ФНО при добавлении в совместные культуры макрофагов и клеток К562 вызывал достоверное снижение численности клеток К562, хотя и менее выраженное, чем при использовании сочетания М-триДАП + ЛПС (рис. 2В). В отсутствие макрофагов рекомбинантный ФНО лишь незначительно снижал численность клеток К562 по сравнению с контролем (в 6 экспериментах из 7, рис. 2В). Таким образом, ФНО, секретируемый макрофагами при активации М-триДАП + ЛПС, действует как непосредственно на клетки К562, так и - преимущественно - через ауто-кринное/паракринное усиление противоопухолевой активности самих макрофагов.
Роль других растворимых и мембраноассоциированных факторов в противоопухолевой активности макрофагов
Поскольку нейтрализующие антитела к ФНО далеко не полностью ингибировали противоопухолевую активность макрофагов, активированных сочетанием М-триДАП + ЛПС (см. рис. 2А), было очевидно, что эти макрофаги вырабатывают и другие противоопухолевые факторы, которые могут быть как растворимыми, так и ассоциированными с клеточными мембранами. Отметим, что ингибирование НАДФН-оксидазы - фермента, участвующего в образовании активных форм кислорода, с помощью апоцинина не оказало влияния на противоопухолевый эффект макрофагов, активированных сочетанием М-триДАП + ЛПС (данные не представлены).
Чтобы уточнить роль растворимых факторов, макрофаги культивировали в течение 72 ч с М-триДАП + ЛПС, собирали супернатанты и переносили их в куль-
э
й ю
¡2
tí Й
а ¡а
Ü ^
ё 8
Ч Ч?
ЕГ
250 200 150 100 50
0
К562 МФ М-триДАП ЛПС
! 250 п ¡ в ! § 200 -
150100500
.8 . \ lo-r
«Л -Л
Отношение МФ : K562
я
2 6) 5) ^ S ы ^ g м 250 -| 200- # • • ** *
и о 150100- • • • • • • é"
й н оо 50- V • •
О
ЕГ 0^
***
###
К562 МФ М-триДАП ЛПС
+ МФ
+ МФ + агонисты Без МФ
•••
э
+ + + + +
+ +
120 100 80
¡sK 60.
ЙНЙ и ° л
s хо П 40
И ¿4 и
§ 20 с и
ЕГ 0
К562 МФ М-триДАП ЛПС
э
4 н
5
2,0 -|
•
1,5- •
•
1,0- •
ч
0,5-
0,0-
ИС (72 ч)
Рис. 1. Противоопухолевая активность макрофагов (МФ), стимулированных М-триДАП, ЛПС и их сочетанием А и Б - число живых клеток К562 в культурах при оценке через 24 ч (А) и 72 ч (Б) после начала эксперимента. Соотношение МФ/ К562 - 50:1
Символы *, ** и *** соответствуют значениям p < 0,05, p < 0,01 и p < 0,001 при сравнении с культурами К562 без МФ; # и ### -p < 0,05 и p < 0,001 при сравнении с культурами К562 + МФ без агонистов; В - индекс синергизма противоопухолевых эффектов М-триДАП и ЛПС для точки 72 ч; Г - число живых клеток К562 после культивирования с МФ в течение 72 ч без агонистов и с сочетанием М-триДАП + ЛПС при различных отношениях эффектор/мишень (количество мишеней на лунку постоянно). M±a, n = 4. ***, p < 0,001 при сравнении стимулированных и нестимулированных культур при данном соотношении эффектор/ мишень; Д - количество живых клеток К562 после 72 ч культивирования с М-триДАП и/или ЛПС в отсутствие МФ. На графиках А, Б, В и Д горизонтальными линиями обозначены средние значения, каждая точка - отдельный эксперимент.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
э
й ю и
tí й а ¡з
! ^ ё S3
Ч Ч?
sb
Э
200-1 15010050-
О
к
Ф
20 000 п
15 000-
10 000-
5000-
2* • •• ■ шт
- + + - + + - + +
- - + + -- + + -- + +
э
О tn
те и о
о о
Ч Ч?
О ¿4
и(
24
48
72
250 200 150 100 50 0
К562 МФ ФНО
0J—I-1-^—-?-П--0-
К562 + + + + + + М-триДАП - + - + - + - + - + - + К562 + + + +
МФ - + + + + + ЛПС -- + + -- + + -- + + МФ - - + +
М-триДАП -- + + + + Время (ч) ~ ~ ~ ФНО - + - +
ЛПС -Козий IgG -
Анти-ФНО ---- + -
Анти-ИФН-Р ----- +
Рис. 2. Роль ФНО в противоопухолевой активности макрофагов
А - влияние нейтрализующих антител к ФНО и ИФН-в на противоопухолевую активность макрофагов, стимулированных сочетанием М-триДАП + ЛПС; Б - уровни ФНО в супернатантах макрофагов, культивированных без агонистов, с М-триДАП, ЛПС и их сочетанием в течение 24, 48 и 72 ч; В - число живых К562 в культурах после 72 ч культивирования с рекомбинантным человеческим ФНО в отсутствие и в присутствии макрофагов * - р < 0,05; ** - р < 0,01.
э 1— ** -р- * —| • э
2 6) 150п 2 6) 5) 150-|
^ 2 1 « • ^ 2 к М
Н Щ еб 100- мм а* О со те еб 100-
« ч 50- • § а з £ м ^ * н 50-
о О л о О л
Я Ь 0- _ > Я Ь 0-
К562 +
МФ -
ПКС +
Суп. (стим.) -
Анти-ФНО -
¡к ¡к —|— ¡к
К562 + + + +
МФ - - - -
ПКС + - - -
Суп. (нестим.) - + - -
Суп. (стим.) - - + +
Анти-ФНО - - - +
э
300-,
200-
и
* о Ь
Ч V?
100-
|—*** —I
«.
I— ** -1
+
0
К562 МФ -М-триДАП -ЛПС -
Обычные лунки
Трансвеллы
Рис. 3. Роль других растворимых и мембраноассоциированных факторов в противоопухолевой активности макрофагов А - число живых клеток К562 после 72 ч сокультивирования с неактивированными макрофагами в ПКС или в супернатанте (суп.) от макрофагов, стимулированных М-триДАП + ЛПС. Нейтрализующие антитела к ФНО вводили в супернатанты за 30 мин до добавления к макрофагам; Б - влияние супернатантов нестимулированных и М-триДАП + ЛПС-стимулированных макрофагов на жизнеспособность клеток К562 при культивировании в течение 72 ч в отсутствие макрофагов; В - число живых клеток К562 при сокультивировании с макрофагами и М-триДАП + ЛПС в обычных планшетах и в трансвелл-планшетах * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001.
+
+
туры аутологичных нестимулированных макрофагов, куда также добавляли клетки К562. Поскольку супер-натанты активированных макрофагов могли содержать остаточные количества ЛПС, перед добавлением к нестимулированным макрофагам их инкубировали с антагонистом ЛПС - полимиксином В. Перенос супер-натантов макрофагов, активированных М-триДАП + ЛПС, к нестимулированным макрофагам приводил к выраженному усилению противоопухолевой активности последних, причем этот эффект частично отменялся антителами к ФНО (рис. 3 А).
Супернатанты макрофагов, активированных М-триДАП + ЛПС, обладали противоопухолевым действием и в отсутствие макрофагов (рис. 3Б). Однако эффект супернатантов в этом случае был гораздо слабее, чем в присутствии макрофагов, и полностью нейтрализовался антителами к ФНО (рис. 3Б). Эти результаты позволяют заключить, что растворимые противоопухолевые медиаторы, высвобождаемые макрофагами под действием сочетания М-триДАП + ЛПС, реализуют свою активность как путем прямого воздействия на опухолевые клетки, так и через ауто-/паракринное усиление противоопухолевой активности самих макрофагов.
Чтобы установить роль мембраноассоциированных молекул в механизмах противоопухолевого действия макрофагов, клетки К562 и макрофаги разделяли полупроницаемой мембраной, помещая их, соответственно, в верхние и нижние камеры трансвелл-планшетов. В этом случае противоопухолевый эффект активированных макрофагов сохранялся, но был существенно слабее, чем при прямом сокультивировании (рис. 3В). Таким образом, прямые межклеточные контакты между К562 и активированными макрофагами необходимы для полного проявления противоопухолевого действия последних.
Макрофаги, активированные сочетанием агонистов NOD1 + TLR4, замедляют пролиферацию клеток К562
Доля погибших (Р1+) клеток К562 в течение всего периода сокультивирования с макрофагами была невелика (< 5 % от всех клеток К562), что могло объясняться как быстрым поглощением погибших опухолевых клеток макрофагами, так и замедлением пролиферации опухолевых клеток без увеличения их гибели.
Мы обратили внимание, что интенсивность свечения СР8Б-метки на клетках К562, сокультивированных с макрофагами в присутствии М-триДАП + ЛПС, существенно выше, чем в контрольных культурах (рис. 4). Метка СР8Б невозобновляема и ее количество в клетке с каждым клеточным делением уменьшается в 2 раза. Повышение свечения метки указывает на замедление пролиферации клеток К562 в присутствии макрофагов, активированных агонистами N001 + ТЬЯ4.
Обсуждение
Опухоль-ассоциированные макрофаги - один из главных клеточных компонентов злокачественной опухоли, формирующих так называемое опухолевое микроокружение. Взаимодействие макрофагов и опухолевых клеток является двунаправленным и, как правило, способствует опухолевой прогрессии.
Тем не менее и в экспериментальных работах, и в клинических испытаниях показано, что инфекционные агенты и агонисты паттерн-распознающих рецепторов могут переключать активность макрофагов с проопухолевой на противоопухолевую, тем самым способствуя регрессу злокачественной опухоли [14-17]. Например, мифамуртид - синтетический
агонист рецептора N002 - одобрен к клиническому применению при неметастазирующей остеосаркоме, агонисты ТЬЯ7 - при некоторых формах рака кожи, агонист ТЬЯ9 обладает достоверной клинической эффективностью при меланоме и немелкоклеточном раке легкого [14, 25].
Ранее нами и другими исследователями было показано, что агонисты рецепторов N001 и ТЬЯ4 обладают синергическим действием на ряд параметров активации макрофагов, моноцитов и дендритных клеток. Так, продукция провоспалительных цитокинов, в частности ФНО, при стимуляции клеток сочетанием агонистов N001 + ТЬЯ4 в несколько раз выше, чем сумма эффектов отдельно взятых агонистов [24, 26]. Основная физиологическая роль этих рецепторов состоит в активации защиты против грам-отрицательных бактерий [27, 28]. В данной работе впервые продемонстрирована противоопухолевая активность макрофагов, активированных сочетанием агонистов N001 и ТЬЯ4. Если отдельно взятые агонисты лишь отменяют про-опухолевое действие макрофагов, то сочетанная стимуляция рецепторов приводит к появлению выраженной противоопухолевой активности (рис. 1Б). Интересно, что эта активность макрофагов частично реализуется через продукцию ФНО, который действует на клетки-продуценты ауто- или паракринно. Помимо ФНО, в реализации противоопухолевых эффектов макрофагов, активированных сочетанием агонистов N001 + ТЬЯ4, участвуют и другие растворимые и мембра-ноассоциированные молекулы. Их природа в данной работе не была установлена, но является предметом будущих исследований. Также наши результаты показали, что одним из компонентов противоопухолевой активности макрофагов является антипролиферативный эффект.
В целом, наша работа продемонстрировала, что сочетание агонистов N001 и ТЬЯ4 является эффективным активатором противоопухолевой активности чело-
W о
§ о.
X ¡^
§ R
й ^
* Й
О о
о
¡S ^ F
250 -,
200 -
150 -
100 -
50 -
0
К562 МФ М-триДАП ЛПС
+ + + + - + -+
Неприлипшие Прилипшие K562 K562
Рис. 4. Макрофаги, активированные сочетанием агонистов NOD1 + TLR4, замедляют пролиферацию клеток К562 Показаны средние значения флюоресценции (mean fluorescence intensity, MFI) клеток К562 по каналу CFSE после культивирования в течение 72 ч без макрофагов и с макрофагами в присутствии и в отсутствие М-триДАП + ЛПС. Свечение неприлипших и прилипших клеток К562 показано раздельно. ** - p < 0,01; *** - p < 0,001.
веческих макрофагов in vitro. Эти результаты позволяют рассматривать данное сочетание в качестве потенциального противоопухолевого препарата.
Выводы
1. Показана возможность переключения активности макрофагов человека с проопухолевой на противоопухолевую при действии сочетания агонистов NOD1 и TLR4 in vitro.
2. Для реализации противоопухолевого ответа макрофагов против клеток К562 необходимы секреция ФНО и прямое межклеточное взаимодействие между К562 и макрофагами.
+
■ Литература
1. Sica A., Mantovani A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J. Clin. Invest. 2012; 122 (3): 787-95. DOI: https://www. doi.org/10.1172/JCI59643
2. Gordon S., Martinez F.O. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity. 2010; 32 (5): 593-604. DOI: https:// www.doi.org/10.1016/j.immuni.2010.05.007
3. Wynn T.A., Chawla A., Pollard J.W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 2013; 496 (7446): 445-55. DOI: https://www.doi.org/10.1038/nature12034
4. Zhang L., Zhu H., Lun Y., Yan D., Yu L., Du B., Zhu X. Proteomic analysis of macrophages: a potential way to identify novel proteins associated with activation of macrophages for tumor cell killing. Cell. Mol. Immunol. 2007; 4 (5): 359-67. PMID: 17976316
5. Pozzi L.-A.M., Maciaszek J.W., Rock K.L. Both dendritic cells and macrophages can stimulate naive CD8 T cells in vivo to proliferate, develop effector function, and differentiate into memory cells. J. Immunol. 2005; 175 (4): 2071-81. DOI: https://www.doi.org/10.4049/jimmunol.175.4.2071
6. Wynn T.A., Freund Y.R., Paulnock D.M. TNF-alpha differentially regulates Ia antigen expression and macrophage tumoricidal activity in two murine macrophage cell lines. Cell. Immunol. 1992; 140 (1): 184-96. DOI: https://www.doi.org/10.1016/0008-8749(92)90186-s
7. Sun L., Kees T., Almeida A.S., Liu B., He X.Y., Ng D., Han X., Spector D.L., McNeish I.A., Gimotty P., Adams S., Egeblad M. Activating a collaborative innate-adaptive immune response to control metastasis. Cancer Cell. 2021; 39 (10): 1361-74.e9. DOI: https://www.doi. org/10.1016/j.ccell.2021.08.005
8. Singh M., Khong H., Dai Z., Huang X.-F., Wargo J.A., Cooper Z.A., Vasilakos J.P., Hwu P., Overwijk W.W. Effective innate and adaptive anti-melanoma immunity through localized TLR7/8 activation. J. Immunol. 2014; 193 (9): 4722-31. DOI: https://www.doi.org/10.4049/jimmunol.1401160
9. Hedl M., Yan J., Witt H., Abraham C. IRF5 is required for bacterial clearance in human m1-polarized macrophages, and IRF5 immune-mediated disease risk variants modulate this outcome. J. Immunol. 2019; 202 (3): 920-30. DOI: https://www.doi.org/10.4049/jimmunol.1800226
10. Nikonova A.A., Pichugin A.V., Chulkina M.M., Lebedeva E.S., Gaisina A.R., Shilovskiy I.P., Ataullakhanov R.I., Khaitov M.R., Khai-tov R.M. The TLR4 agonist immunomax affects the phenotype of mouse lung macrophages during respiratory syncytial virus infection. Acta Naturae. 2018; 10 (4): 95. PMID: 30713767
11. Chi H., Li C., Zhao F.S., Zhang L., Ng T.B., Jin G., Sha O. Antitumor activity of toll-Like receptor 7 agonists. Front. Pharmacol. 2017. DOI: https://www.doi.org/10.3389/FPHAR.2017.00304
12. Adams S. Toll-like receptor agonists in cancer therapy. Immunotherapy. 2009; 1 (6): 949-64. DOI: https://www.doi.org/10.2217/imt. 09.70
13. Ghochikyan A., Pichugin A., Bagaev A., Davtyan A., Hovakimy-an A., Tukhvatulin A., Davtyan H., Shcheblyakov D., Logunov D., Chul-kina M., Savilova A., Trofimov D., Nelson E.L., Agadjanyan M., Ataul-lakhanov R.I. Targeting TLR-4 with a novel pharmaceutical grade plant derived agonist, Immunomax®, as a therapeutic strategy for metastatic breast cancer. J. Transl. Med. 2014. DOI: https://www.doi.org/10.1186/ S12967-014-0322-Y
14. Rodell C.B., Arlauckas S.P., Cuccarese M.F., Garris C.S., Li R., Ahmed M.S., Kohler R.H., Pittet M.J., Weissleder R. TLR7/8-agonist-loaded nanoparticles promote the polarization of tumour-associated macrophages to enhance cancer immunotherapy. Nat. Biomed. Eng. 2018; 2 (8): 578-88. DOI: https://www.doi.org/10.1038/s41551-018-0236-8
15. Ackerman S.E., Pearson C.I., Gregorio J.D., Gonzalez J.C., Ken-kel J.A., Hartmann F.J. et al. Immune-stimulating antibody conjugates elicit robust myeloid activation and durable antitumor immunity. Nat. Cancer. 2021; 2 (1): 18-33. DOI: https://www.doi.org/10.1038/s43018-020-00136-x
16. Zhu P., Hou Y., Tang M., Jin Z., Yu Y., Li D., Yan D., Dong Z. The role of HIF-1a in BCG-stimulated macrophages polarization and their tumoricidal effects in vitro. Med. Microbiol. Immunol. 2021; 210 (2-3): 149-56. DOI: https://www.doi.org/10.1007/s00430-021-00708-3
17. Kumar P., Tyagi R., Das G., Bhaskar S. Mycobacterium indicus pranii and Mycobacterium bovis BCG lead to differential macrophage activation in Toll-like receptor-dependent manner. Immunology. 2014; 143 (2): 258-68. DOI: https://www.doi.org/10.1111/imm.12306
18. Suarez G., Romero-Gallo J., Piazuelo M.B., Sierra J.C., Delgado A.G., Kay Washington M., Shah S.C., Wilson K.T., Peek Jr R.M. Nod1 imprints inflammatory and carcinogenic responses toward the gastric pathogen Helicobacter pylori. Cancer Res. 2019; 79 (7): 1600-11. DOI: https://www.doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-18-2651
19. Punzo F., Bellini G., Tortora C., Di Pinto D., Argenziano M., Pota E., Di Paola A., Di Martino M., Rossi F. Mifamurtide and TAM-like macrophages: effect on proliferation, migration and differentiation of os-teosarcoma cells. Oncotarget. 2020; 11 (7): 687-98. DOI: https://www.doi. org/10.18632/oncotarget.27479
20. Ando K., Mori K., Corradini N., Redini F., Heymann D. Mifamur-tide for the treatment of nonmetastatic osteosarcoma. Expert Opin. Phar-
macother. 2011; 12 (2): 285-92. DOI: https://www.doi.org/10.1517/14656 566.2011.543129
21. Budikhina A.S., Murugina N.E., Maximchik P. V., Dagil Y.A., Nikolaeva A.M., Balyasova L.S., Murugin V.V., Selezneva E.M., Pash-chenkova Y.G., Chkadua G.Z., Pinegin B.V., Pashenkov M.V. Interplay between NOD1 and TLR4 receptors in macrophages: nonsynergistic activation of signaling pathways results in synergistic induction of proinflammatory gene expression. J. Immunol. 2021; 206 (9): 2206-20. DOI: https:// www.doi.org/10.4049/jimmunol.2000692
22. Багаев А.В., Рыбинец А.С., Федорова А.А., Ушакова Е.И., Лебедева Е.С., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Синергизм агонистов TLR3 и TLR4 при перепрограммировании макрофагов в противоопухолевое состояние. Иммунология. 2021; 42 (6): 615-30. DOI: https://www.doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-615-630
23. Van Heel D.A., Ghosh S., Hunt K.A., Mathew C.G., Forbes A., Jewell D.P., Playford R.J. Synergy between TLR9 and NOD2 innate immune responses is lost in genetic Crohn's disease. Gut. 2005. DOI: https:// www.doi.org/10.1136/gut.2005.065888
24. Fritz J.H., Girardin S.E., Fitting C., Werts C., Mengin-Lecreulx D., Caroff M. et al. Synergistic stimulation of human monocytes and dendritic cells by Toll-like receptor 4 and NOD1- and NOD2-activating agonists. Eur. J. Immunol. 2005; 35 (8): 2459-70. DOI: https://www.doi. org/10.1002/eji.200526286
25. Murad Y.M., Clay T.M., Lyerly H.K., Morse M.A. CPG-7909 (PF-3512676, ProMune): toll-like receptor-9 agonist in cancer therapy. Expert Opin. Biol. Ther. 2007; 7 (8): 1257-66. DOI: https://www.doi. org/10.1517/14712598.7.8.1257
26. van Heel D.A., Ghosh S., Butler M., Hunt K., Foxwell B.M.J., Mengin-Lecreulx D., Playford R.J. Synergistic enhancement of Toll-like receptor responses by NOD1 activation. Eur. J. Immunol. 2005; 35 (8): 2471-6. DOI: https://www.doi.org/10.1002/eji.200526296
27. Girardin S.E., Boneca I.G., Carneiro L.A.M., Antignac A., Jehanno M., Viala J., Tedin K., Taha M.-K., Labigne A., Zähringer U., Coyle A.J., DiStefano P.S., Bertin J., Sansonetti P.J., Philpott D.J. Nod1 detects a unique muropeptide from gram-negative bacterial peptidoglycan. Science. 2003; 300 (5625): 1584-7. DOI: https://www.doi.org/10.1126/ science.1084677
28. Barton G.M., Medzhitov R. Toll-like receptors and their li-gands. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2002. DOI: https://www.doi. org/10.1007/978-3-642-59430-4_5
■ References
1. Sica A., Mantovani A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo Veritas. J Clin Invest. 2012; 122 (3): 787-95. DOI: https://www.doi. org/10.1172/JCI59643
2. Gordon S., Martinez F.O. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity. 2010; 32 (5): 593-604. DOI: https:// www.doi.org/10.1016/j.immuni.2010.05.007
3. Wynn T.A., Chawla A., Pollard J.W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 2013; 496 (7446): 445-55. DOI: https://www.doi.org/10.1038/nature12034
4. Zhang L., Zhu H., Lun Y., Yan D., Yu L., Du B., Zhu X. Proteomic analysis of macrophages: a potential way to identify novel proteins associated with activation of macrophages for tumor cell killing. Cell Mol Immunol. 2007; 4 (5): 359-67. PMID: 17976316
5. Pozzi L.-A.M., Maciaszek J.W., Rock K.L. Both dendritic cells and macrophages can stimulate naive CD8 T cells in vivo to proliferate, develop effector function, and differentiate into memory cells. J Immunol. 2005; 175 (4): 2071-81. DOI: https://www.doi.org/10.4049/jimmu-nol.175.4.2071
6. Wynn T.A., Freund Y.R., Paulnock D.M. TNF-alpha differentially regulates Ia antigen expression and macrophage tumoricidal activity in two murine macrophage cell lines. Cell Immunol. 1992; 140 (1): 184-96. DOI: https://www.doi.org/10.1016/0008-8749(92)90186-s
7. Sun L., Kees T., Almeida A.S., Liu B., He X.Y., Ng D., Han X., Spector D.L., McNeish I.A., Gimotty P., Adams S., Egeblad M. Activating a collaborative innate-adaptive immune response to control metastasis. Cancer Cell. 2021; 39 (10): 1361-74.e9. DOI: https://www.doi. org/10.1016/j.ccell.2021.08.005
8. Singh M., Khong H., Dai Z., Huang X.-F., Wargo J.A., Cooper Z.A., Vasilakos J.P., Hwu P., Overwijk W.W. Effective innate and
adaptive antimelanoma immunity through localized TLR7/8 activation. J Immunol. 2014; 193 (9): 4722-31. DOI: https://www.doi.org/10.4049/ jimmunol.1401160
9. Hedl M., Yan J., Witt H., Abraham C. IRF5 is required for bacterial clearance in human m1-polarized macrophages, and IRF5 immune-mediated disease risk variants modulate this outcome. J Immunol. 2019; 202 (3): 920-30. DOI: https://www.doi.org/10.4049/jimmunol.1800226
10. Nikonova A.A., Pichugin A.V., Chulkina M.M., Lebedeva E.S., Gaisina A.R., Shilovskiy I.P., Ataullakhanov R.I., Khaitov M.R., Khai-tov R.M. The TLR4 agonist immunomax affects the phenotype of mouse lung macrophages during respiratory syncytial virus infection. Acta Naturae. 2018; 10 (4): 95. PMID: 30713767
11. Chi H., Li C., Zhao F.S., Zhang L., Ng T.B., Jin G., Sha O. Antitumor activity of toll-Like receptor 7 agonists. Front Pharmacol. 2017. DOI: https://www.doi.org/10.3389/FPHAR.2017.00304
12. Adams S. Toll-like receptor agonists in cancer therapy. Immuno-therapy. 2009; 1 (6): 949-64. DOI: https://www.doi.org/10.2217/imt.09.70
13. Ghochikyan A., Pichugin A., Bagaev A., Davtyan A., Hovaki-myan A., Tukhvatulin A., Davtyan H., Shcheblyakov D., Logunov D., Chulkina M., Savilova A., Trofimov D., Nelson E.L., Agadjanyan M., Ataullakhanov R.I. Targeting TLR-4 with a novel pharmaceutical grade plant derived agonist, Immunomax®, as a therapeutic strategy for metasta-tic breast cancer. J Transl Med. 2014. DOI: https://www.doi.org/10.1186/ S12967-014-0322-Y
14. Rodell C.B., Arlauckas S.P., Cuccarese M.F., Garris C.S., Li R., Ahmed M.S., Kohler R.H., Pittet M.J., Weissleder R. TLR7/8-agonist-loaded nanoparticles promote the polarization of tumour-associated macrophages to enhance cancer immunotherapy. Nat Biomed Eng. 2018; 2 (8): 578-88. DOI: https://www.doi.org/10.1038/s41551-018-0236-8
15. Ackerman S.E., Pearson C.I., Gregorio J.D., Gonzalez J.C., Ken-kel J.A., Hartmann F.J. et al. Immune-stimulating antibody conjugates elicit robust myeloid activation and durable antitumor immunity. Nat. Can-cer.2021; 2 (1): 18-33. DOI: https://www.doi.org/10.1038/s43018-020-00136-x
16. Zhu P., Hou Y., Tang M., Jin Z., Yu Y., Li D., Yan D., Dong Z. The role of HIF-1a in BCG-stimulated macrophages polarization and their tumoricidal effects in vitro. Med Microbiol Immunol. 2021; 210 (2-3): 149-56. DOI: https://www.doi.org/10.1007/s00430-021-00708-3
17. Kumar P., Tyagi R., Das G., Bhaskar S. Mycobacterium indicus pranii and Mycobacterium bovis BCG lead to differential macrophage activation in Toll-like receptor-dependent manner. Immunology. 2014; 143 (2): 258-68. DOI: https://www.doi.org/10.1111/imm.12306
18. Suarez G., Romero-Gallo J., Piazuelo M.B., Sierra J.C., Delgado A.G., Kay Washington M., Shah S.C., Wilson K.T., Peek Jr R.M. Nod1 imprints inflammatory and carcinogenic responses toward the gastric pathogen Helicobacter pylori. Cancer Res. 2019; 79 (7): 1600-11. DOI: https://www.doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-18-2651
19. Punzo F., Bellini G., Tortora C., Di Pinto D., Argenziano M., Pota E., Di Paola A., Di Martino M., Rossi F. Mifamurtide and TAM-like macrophages: effect on proliferation, migration and differentiation of os-teosarcoma cells. Oncotarget. 2020; 11 (7): 687-98. DOI: https://www.doi. org/10.18632/oncotarget.27479
20. Ando K., Mori K., Corradini N., Redini F., Heymann D. Mifamur-tide for the treatment of nonmetastatic osteosarcoma. Expert Opin Phar-macother. 2011; 12 (2): 285-92. DOI: https://www.doi.org/10.1517/1465 6566.2011.543129
21. Budikhina A.S., Murugina N.E., Maximchik P. V., Dagil Y.A., Nikolaeva A.M., Balyasova L.S., Murugin V.V., Selezneva E.M., Pash-chenkova Y.G., Chkadua G.Z., Pinegin B.V., Pashenkov M.V. Interplay between NOD1 and TLR4 receptors in macrophages: nonsynergistic activation of signaling pathways results in synergistic induction of proinflam-
Сведения об авторах
Муругина Нина Евгеньевна - мл. науч. сотр. лаб. клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-7000-5729
Муругин Владимир Владимирович - канд. мед. наук, науч. сотр. лаб. клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-1011-2554
Пащенков Михаил Владимирович - д-р мед. наук, и.о. зав. лаб. клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6995-1790
matory gene expression. J Immunol. 2021; 206 (9): 2206-20. DOI: https:// www.doi.org/10.4049/jimmunol.2000692
22. Bagaev A.V., Rybinets A.S., Fedorova A.A., Ushakova E.I., Lebedeva E.S., Pichugin A.V., Ataullakhanov R.I. Synergism of TLR3 and TLR4 agonists during reprogramming of macrophages into an antitumor state. Immunologiya. 2021; 42 (6): 615-30. DOI: https://www.doi. org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-615-630 (in Russian)
23. Van Heel D.A., Ghosh S., Hunt K.A., Mathew C.G., Forbes A., Jewell D.P., Playford R.J. Synergy between TLR9 and NOD2 innate immune responses is lost in genetic Crohn's disease. Gut. 2005. DOI: https:// www.doi.org/10.1136/gut.2005.065888
24. Fritz J.H., Girardin S.E., Fitting C., Werts C., Mengin-Lecreulx D., Caroff M. et al. Synergistic stimulation of human monocytes and dendritic cells by Toll-like receptor 4 and NOD1- and NOD2- activating agonists. Eur J Immunol. 2005; 35 (8): 2459-70. DOI: https://www.doi.org/10.1002/ eji.200526286
25. Murad Y.M., Clay T.M., Lyerly H.K., Morse M.A. CPG-7909 (PF-3512676, ProMune): toll-like receptor-9 agonist in cancer therapy. Expert Opin Biol Ther. 2007; 7 (8): 1257-66. DOI: https://www.doi. org/10.1517/14712598.7.8.1257
26. van Heel D.A., Ghosh S., Butler M., Hunt K., Foxwell B.M.J., Mengin-Lecreulx D., Playford R.J. Synergistic enhancement of Toll-like receptor responses by NOD1 activation. Eur J Immunol. 2005; 35 (8): 2471-6. DOI: https://www.doi.org/10.1002/eji.200526296
27. Girardin S.E., Boneca I.G., Carneiro L.A.M., Antignac A., Jehan-no M., Viala J., Tedin K., Taha M.-K., Labigne A., Zähringer U., Coyle A.J., DiStefano P.S., Bertin J., Sansonetti P. J., Philpott D.J. Nod1 detects a unique muropeptide from gram-negative bacterial peptidoglycan. Science. 2003; 300 (5625): 1584-7. DOI: https://www.doi.org/10.1126/science.1084677
28. Barton G.M., Medzhitov R. Toll-like receptors and their li-gands. Curr Top Microbiol Immunol. 2002. DOI: https://www.doi. org/10.1007/978-3-642-59430-4_5
Authors' information
Nina E. Murugina - Junior Researcher of the Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-7000-5729
Vladimir V. Murugin - PhD, Researcher of the Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-1011-2554
Mikhail V. Pashenkov - MD, PhD, Acting Head of the Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6995-1790
