CC BY
35
Перспективи подальших дослщжень. В подальшому планусться до^дження гормонального фону кшок iмуноферментним методом до i пiсля задавання контрацептивних препаратов. Дослiдження в цьому напрямку плануються i для iнших свшських тварин.
Л1тература
1. Болдырева Е. М. Пиометра у собак и кошек / Е. М. Болдырева, С. А. Минаева / Метер. 10-го Московского Международного ветеринарного конгресса. М., 2002. 29-34 с.
2. Мануилова И. А. Современные контрацептивные средства / М.: Научно-практическое издание. Изд. 2е переработанное и дополненное, - 1993. - 200 с.
3. Симпсон Дж. и др. Руководство по репродукции и неонатологии собак и кошек. М.: Софион. - 2005. - С. 229.
4. Clinical Use of Progestins in Bitches and Queens: A Review / S. Romagnoli and P. W. Concannon / www.ivis.org., 2013 - 1-21 p.
5. Chatdarong K, Rungsipipat A, Axner E et al. / Hysterographic appearance and uterinehistology at different stages of the reproductive cycle and alter progestagen treatment in the domestic cat. - Theriogenology, 2014 - 12-29 p.
References
Boldyreva, E. M., Minaeva, S. A. (2002). Piometra u sobak i koshek / Meter. 10-go Moskovskogo
Mezhdunarodnogo veterinarnogo kongressa. M., 29-34. (in Russian). Manuilova, I. A. (1993) Sovremennye kontraceptivnye sredstva - M.: Nauchno-prakticheskoe
izdanie. Izd. 2e pererabotannoe i dopolnennoe, 200. (in Russian). Simpson Dzh. i dr. (2005). Rukovodstvo po reprodukcii i neonatologii sobak i koshek. M.: Sofion. 229. (in Russian).
Romagnoli, S., Concannon, P. W. (2013). Clinical Use of Progestins in Bitches and Queens: A
Review / www.ivis.org., 1-21. Chatdarong, K, Rungsipipat, A, Axner E et al. (2014). Hysterographic appearance and uterinehistology at different stages of the reproductive cycle and alter progestagen treatment in the domestic cat. - Theriogenology, 12-29.
Стаття надтшла до редакци 25.03.2016
УДК 636.7:612.419:57.086.13
Водоп'янова Л. А., к. б. н., доцент ([email protected]) Бобрицька О. М., к. вет. н., доцент, Югай К. Д., к. вет. н., доцент, Жукова I. О., д. вет. н., професор ©
Харювська державна зооветеринарна академия, Харюв, Украгна
РОЗРОБКА МЕТОДУ ТА ОЦ1НКА ЕФЕКТИВНОСТ1 ДОВГОСТРОКОВОГО ЗБЕР1ГАННЯ КЛ1ТИН К1СТКОВОГО МОЗКУ СОБАК
Вгдомо, що в замороженому стан бюоб'екти зберкаються тривалий час. Процес консервування юсткового мозку без застосування кргозахисту е дуже несприятливим для клтин, це зумовлюе застосування кр1опротектор1в при заморожувант. Д1я кр1опротектор1в знижуе негативы наслгдки заморожування-вгдггргву та зберггае клтини до проведення трансплантацИ До того ж неправильно тдгбраний крюпротектор може негативно впливати на збережетсть i р1вень енергетичних процесгв у клтинах. До^джували вплив крiопротекторiв та заморожування-вiдiгрiву на структурно-морфологiчний стан юсткового мозку собак. Використовували кiнцевi концентрацИ'розчитв крiопротекторiв: ДМСО - 10 %, 7 %, 5 %о, ПЕ0-400 - 10 %о, 15 %о, 20 %,, глщерин - 10 %>, 20 %,, 30 %>. Отримат результати вказують на те, що 7 % ДМСО е найбтьш ефективним ^iопротектором для бiльшостi видiв клтин юсткового мозку собак, особливо для клтин на рантх стадiях диференщацп. При застосуванш ДМСО зберiгаеться бтьш 80 % клтин юсткового мозку собак. ПЕ0-400 здатний зберiгати клтини тд час крюконсервування, але на заключних стадiях процесу юльюсть клтин значно скорочувалась. Глщерин, у вих
© Водоп'янова Л. А., Бобрицька О. М., Югай К. Д., Жукова I. О., 2016
12
дослгджених концентрацгях, виявився найменш ефективним кргопротектором з дослгджених.
Ключов1 слова: клгтини юсткового мозку, збереження клтин, крюконсервування, крюпротектори, життездаттсть клтин, ДМСО, глщерол, полгетиленоксид.
УДК 636.7:612.419:57.086.13
Водопьянова Л. А., к. б. н., доцент, Бобрицкая О. Н., к. вет. н., доцент, Югай К. Д., к. вет. н., доцент, Жукова И. А., д. вет. н., профессор
Харьковская государственная зооветеринарная академия, Харков, Украина
РАЗРАБОТКА МЕТОДА И ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ДОЛГОСРОЧНОГО ХРАНЕНИЯ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА СОБАК
Известно, что в замороженном состоянии биообъекты сохраняются продолжительное время. Процесс криоконсервирования костного мозга без использования криозащиты является очень неблагоприятным для клеток, это обуславливает применение криопротекторов при замораживании. Действие криопротекторов снижает нежелательные последствия замораживания-отогрева и сохраняет клетки до проведения трансплантации, но неправильно подобранный криопротектор может негативно влиять на сохранность и уровень энергетических процессов в клетках. Исследовали влияние криопротекторов и замораживания-отогрева на структурно-морфологическое состояние костного мозга собак. Использовали следующие конечные концентрации криопротекторов: ДМСО 10 %, 7 %о, 5 %о, ПЕО-400 - 10 %о, 15 %>, 20 %>, глицерин - 10 %>, 20 %>, 30 %. Полученные результаты характеризуют 7 % ДМСО как наиболее эффективный криопротектор для большинства видов клеток костного мозга собак, особенно для клеток на ранних стадиях дифференциации. При использовании ДМСО сохраняется более 80 % клеток костного мозга собак. ПЕ0-400 способен сохранять клетки в процессе криоконсервирования, однако на заключительных стадиях процесса количество клеток значительно сокращается. Глицерин, в исследованных концентрациях, оказался менее эффективным из числа исследованных криопротекторов.
Ключевые слова: клетки костного мозга, сохранность клеток, криоконсервирование, криопротекторы, жизнеспособность клеток, ДМСО, глицерин, полиэтиленоксид.
UDC 636.7:612.419:57.086.13
Vodopyanova L. A., PhD, associate professor, lecturer, Bobrytska O. M., PhD, associate professor, lecturer,
Yugay K. D. PhD, associate professor, lecturer, Zhukova I. O., doctor of veterinary science, Professor Kharkiv state zooveterinary academy, Kharkov, Ukraine
DEVELOPMENT OF METHODS AND EVALUATION OF LONG-TERM STORAGE
OF DOG'S BONE MARROW CELLS
It is known that the biological objects are stored frozen for a long time. The process of hone marrow cryopreservation without cryoprotectants is very unfavorable for the cells, it causes the use of cryoprotectants during freezing. Action cryoprotectants reduce the negative effects of freezing and thawing, and stores the cells prior to transplantation, but incorrectly selected cryoprotectant may adversely affect the safety and the level of energy processes in the cells. The effect of cryoprotectants and freezing-thawing on the structural and morphological status of dogs bone marrow. Final concentrations of cryoprotectants used: DMSO - 10 %,, 7 %,, 5 %, PE0-400 - 10 %,, 15 %, 20 %,, glycerol - 10 %,, 20 %,, 30 %. These results characterize 7 % DMSO as a cryoprotectant most effective for a lot of types of bone
13
marrow cells of dogs, especially for cells in the early stages of differentiation. DMSO stored for more than 80 % of bone marrow cells of dogs. PEO - 400 is able to maintain cells during cryopreservation, but the final stages of the process, amount of cells is greatly reduced. Glycerol in the concentrations tested, was less effective of the studied cryoprotectants.
Key words: bone marrow cells, preservation of cells, cryopreservation, cryoprotectants, cell viability, DMSO, glycerol, polyethylenoxide.
Вступ. Трансплантащя клгтин шсткового мозку (ККМ), що мають здатшсть розвиватися у pi3m кттини кров^ використовуються у сучаснш ветеринарнш медицин як ефективний зааб лiкування рiзноманiтних захворювань кровотворно! системи [7]. Потреба у ККМ тварин збшьшуеться щороку та вимагае створення ефективних методiв зберiгання клгтин. Низькотемпературне консервування (при -196 °С) ККМ людини, дозволяе зберiгати матерiал до трансплантування впродовж декшькох рошв [6]. До того ж у ветеринарнш практицi подiбнi методи лише розробляються. Дослiдження способiв збер^ання ККМ собак тд захистом рiзних крiопротекторiв, дозволить розробити ефективну методику !х крiоконсервування i довгострокового збер^ання для подальшого застосування в терапи тварин.
Мета i завдання дослгдження. Визначення найбiлъш ефективного крiопротектора для крюконсервування клiтин кiсткового мозку собак. Для досягнення поставлено! мети вивчали вплив факторiв крiоконсервування та дiю рiзних кондентрацiй проникаючих та непроникаючих крiопротекторiв на збереженiстъ клiтин шсткового мозку собак.
Матерiали i методи. ККМ собак отримували вiд статевозрiлих самщв 3-4 рошв (n=8) у ввдповвдносп з «Загальними принципами експериментгв на тваринах», що погоджен I Нацюнальним конгресом по бiоетицi (Кшв, 2001) методом шстковомозково! пункцл [5]. Для вибору крiопротекторiв приймали до уваги дат по ефективносп використання розчишв дiметилсулъфоксиду (ДМСО), глiцерину, полiетиленоксиду з М.м. 400 (ПЭ0-400) за крюконсервування ККМ людини. Крюконсервування проводили за наявносп криопротекторiв в наступних шнцевих концентрацiях: ДМСО - 10 %, 7 %, 5 %, ПЕ0-400 - 10 %, 15 %, 20 %, глiцерин - 10 %, 20 %, 30 %. 1нкубащя клiтин з ДМСО - 10 хвилин, ПЕО та глщерином - 30 хвилин за температури 4 °С. Заморожування проводили двоступово: перший етап - занурення в пари рвдкого азоту (-80 °С, температура контролювалася термопарою), другий етап занурення в рвдкий азот (-196 °С). Розморожування проводили через 24 години, на водян1й банi 41°С за постiйного похитування впродовж 1-3 хвилин. Крюпротектори вилучали шляхом додавання до ККМ розчину, що складаеться з 199 середовища, цитрату натрто, сиворотки кровi ембрiоналъноl телячо!, з подальшим центрифугуванням. Визначення збереженостi ККМ собак проводили за допомогою суправ^ального фарбування трипановим син1м за стандартною методикою [2, 3] в свiжоотриманiй суспензп (контроль), вiдмитих вiд крюпротектору п1сля iнкубацil та заморожування-вiдiгрiву суспензiях клiтин.
Результати дослiдження. За показниками, що представлен! на рисунку 1 видно, що в« дослiдженi розчини крiопротекторiв на стадil iнкубацil, оказують негативний невеликий вплив на збереженють ККМ собак, що 6!льш виражено в присутност^ ДМСО в концентрацп 10 %.
Можливо, це пов'язано з токсичними властивостями розчин1в ДМСО, що мають концентращю вище концентрацп 8 % (~ 1 М) [4], або з високою тошчнютю середовища, що складаеться на основ! проникаючих крiопротекторiв i робить кттини чутливими до замiщення Ф!з!олог!чного середовища на крюзахисне [8].
Заморожування суспензп ККМ собак без використання крюзахисту негативно ввдображаеться на життездатностi клгтин i робить суспензiю непридатною для трансплантацл (рис. 2).
14
100 -, 90 -ВО -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 -0 -
10 20
контроль глщерин
10
15
ПЕО - 400
ДМСО
концентрац!я крюпротектору , %
Рис.1. Показники збереженосл ККМ собак шсля шкубацп з розчинами крiопротекторiв. *** - вiрогiдно вщносно св1жоотримано! суспензи (контроль), р< 0,001. ** - вiрогiдно ввдносно контролю, р< 0,01.
| 40 Н
глщерин ПЕО -400 ДМСО без
кртпротектору
концентрата кртпротектору , %
Рис.2. Показники збереженост ККМ собак шсля заморожування-вад^ву пiд захистом рiзних концентрацiй крiопротекторiв. * * * - вiрогiдно вiдносно свiжоотриманiй суспензи (контроль), р< 0,001. # # # - достовiрно вщносно клiтин iнкубованих з крiопротектором, р< 0,001.
Розчини ПЕ0-400 забезпечують високий рiвень збереженост ККМ, а найбшьш вираженi крiопротекторнi властивостями мають розчини ДМСО 7 та 10 %.
Глщерин виявився менш ефективним крюпротектором з дослiджених. Можливо, це пов'язано зi зниженою проникаючою здатнiстю глщерину скрiзь плазматичнi мембрани бiльшостi титв ККМ при температурi шкубаци, в цьому випадку вiн дie як екзоцелюлярний крюпротектор [1].
Висновки. Пюля заморожування-вш^ву кюткового мозку собак без крюиротектора зберiгаeться лише незначна кшькють клiтин, що становить менше шж 6 % вiд показнишв контролю. Встановлено, що ДМСО в 7 %, 10 % концентращях та ПЕ0-400 в 10 % i 15 % концентращях забезпечують збереження близько 80 % клгтин юсткового мозку собак тсля заморожування-вiдiгрiву. Глщерин надае недостатньо високий рiвень захисту клiтин кiсткового мозку собак за проведения крiоконсервування, що становить ввд 50 % до 60 % ввд показнишв контролю.
Перспективи подальших дослiджень. Подальша розробка та дослвдження методiв довгострокового зберiгання елеменпв гемопоезу, дозволить одержати показники, важлив^ для створення банку трансплантацiйного матерiалу.
15
Лггература
1. Белоус А. М., Грищенко В. И. Криобиология. - Киев: Наук. думка, 1994.- 430 с.
2. Пушкарь Н. С., Цуцаева А. А., Иткин Ю. А., Шраго М.И. Консервирование костного мозга при ультранизких температурах с ПЭО-400: Метод. рекомендации. - М., 1984.- l 1 c.
3. Цуцаева А. А., Аграненко В. А., Федорова Л. И. Криоконсервирование клеточных суспензий. - Киев: Наук. думка, 1983. - 240 с.
4. Fuller B. J. Cryoprotectants: the essential antifreezes to protect role in the frozen state / Fuller B. J. // Cryoletters - 2004. - Vol. 25, №6. - P. 375-388.
5. Kushida T. A new method for bone marrow harvesting / Kushida T., Inaba M., Ikebukuro K., Ngahama T. et al. // Stem cells. - 2000. - Vol. 18, № 6. - P. 453-456.
6. Sppurr E. E. Cryopreserved human haematopoietic stem cells retain engraftment potential after extended (5-14 years) criostorage / Sppurr E. E., Wiggins N. E., Marsden K. A., Lowenthal R. M. Ragg S. S. // Cryobiology.- 2002.- Vol. 44, № 3 - P. 210-217.
7. Van de Ouweland F. Enrichement and cryopreservation of bone marrow progenitor cells for autologous reinfusion / Van de Ouweland F., De Witte T., Geerdink P., Haanen C. // Cryobiology. - 1982. - Vol. 19, № 3. - P. 292-298.
8. Willhite D. H. Dimethyl sulfoxide / Willhite D. H., Katz P. I. // J.Appl. Toxicol. - 1984. - Vol. 4, № 3. - P. 155-159.
References
Belous, A. M. Grischenko V. I. (1994). Kriobiologiya. - Kiev: Nauk. dumka, 430. (in Russian). Pushkar, N. S., Tsutsaeva, A. A., Itkin, Yu. A., Shrago, M. I. (1984). Konservirovanie kostnogo mozga pri ultranizkih temperaturah s PE0-400: Metod. rekomendatsii. - M., 11. (in Russian).
Tsutsaeva, A. A., Agranenko, V. A., Fedorova, L. I. (1983). Kriokonservirovanie kletochnyih
suspenziy. - Kiev: Nauk. dumka, 240. (in Russian). Fuller, B. J. (2004). Cryoprotectants: the essential antifreezes to protect role in the frozen state /
Fuller B. J. // Cryoletters. Vol. 25, № 6. - P. 375-388. Kushida, T. (2000). A new method for bone marrow harvesting / Kushida T., Inaba M.,
Ikebukuro K., Ngahama T. et al. // Stem cells. - Vol. 18, № 6. - P. 453-456. Sppurr, E. E.(2002). Cryopreserved human haematopoietic stem cells retain engraftment potential after extended (5-14 years) criostorage / Sppurr E. E., Wiggins N. E., Marsden K. A., Lowenthal R. M., Ragg S. S. // Cryobiology.- Vol. 44, №3 - P. 210-217. Van de Ouweland, F. (1982). Enrichement and cryopreservation of bone marrow progenitor cells for autologous reinfusion / Van de Ouweland F., De Witte T., Geerdink P., Haanen C. // Cryobiology. Vol. 19, № 3. - P. 292-298. Willhite, D. H. (1984). Dimethyl sulfoxide / Willhite D. H., Katz P. I. // J.Appl. Toxicol. - Vol. 4, №.3. - P. 155-159.
Стаття надтшла до редакцй 13.03.2016
УДК 614.95:636.4
Головаха В. I., д. вет. н., © Гарькавий В. О., Москаленко В. П., Смельяненко О. В., к. вет. н.
Бтоцерюеський нацюнальний аграрный утеерситет, Украгна
Суслова Н. I., к. вет. н. Днтропетроеський держаений аграрно-економ1чний утеерситет
ЯК1СНА ГОД1ВЛЯ СВИНЕЙ-ОСНОВА ПРОФ1ЛАКТИКИ ВНУТР1ШН1Х
ХВОРОБ
В статт1 наведет дат ргзних джерел, що еисетлюють питання еиробництеа кормге для год1ел1, ттенсифжацп галузг сеинарстеа у малих i середнх фермерських господарстеах за рахунок замти зерноеих кормiе на тетра^онн сухi комбжорми. По причит, що концентрати е годiелi сеиней рiзко порушують у них фiзiологiчний процес траелення, значно послаблюють гх iмунimеm, знижують природню резистенттсть теарин, на^дком чого е факт, що еа сеинокомплекси з термтом експлуатацИ' бтьше трьох роюе неблагополучн по рiзноманimних тфекщях, збудники яких при зеичному
© Головаха В. I., Гарькавий В. О., Москаленко В. П., Смельяненко О. В., Суслова Н. I., 2016
16
