CC BY
15
HayKOBHH BicHHK .HHyBMET iMeHi C.3. I^H^Koro, 2017, t 19, № 73
HayKOBHH BicHHK .HbBiBCbKoro Ha^oHaibHoro ymBepcHrery BeTepHHapHoi' MeguuHHH
Ta 6ioTexHonoriH iMeHi C.3. I^H^Koro Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies named after S.Z. Gzhytskyj
doi: 10.15421/nvlvet7308
ISSN 2518-7554 print ISSN 2518-1327 online
http://nvlvet.com.ua/
УДК 636.7:611.018.46:577.121:57.086.13
Ыохш1чш критерп оцшки функщонального стану К1Сткового мозку собак
Л.А. Водоп'янова, К.Д. Югай, О.М. Бобрицька, С.Л. Антiпiн
Харювська державна зооветеринарна академiя, вул. Академiчна, 1, смт Мала Данилiвка, Дергачiвський р-н, Харювська обл., 62341, Украна,
Юстковий мозок - це комплекс клтин, що тдтримують кровотворення в оргатзмг тварини. Високий терапевтичний потенцгал клтин юсткового мозку (ККМ) дае можливгсть використати гх за лгкування тварин ргзних захворювань, що викликають порушення гемопоезу, а також тсля застосування хтготерапп. Отже, клгнгчна потреба в клтинах юстко-вому мозку постшно зростае г вимагае створення резерву бюлоггчного матергалу. У клгнгчнгй ветеринар^ г трансплантологи е нагальна потреба в довгостроковому збергганш клтин юсткового мозку за допомогою технологи заморожування. Використання кргозахисту дозволяе збер1гати клтинний вмгст близький до показниюв контрольног групи, але багато роюв ведуться дослгдження, спрямоваш на вивчення мехашзмгв г боротьбу з негативними наслгдками кргопошкодження. Незва-жаючи на те, що в останнш час клтини гемопоетичног системи активно вивчаються, багато аспектгв гх бгохти все ще невизначет г заслуговують на особливу увагу. Визначали вмгст глюкозо-6-фосфату (Г-6-Ф), аденозинтрифосфату (АТФ), тровтоградног та молочног кислот у клтинах юсткового мозку собак до та тсля крюконсервування з диметилсульфокси-дом (ДМСО). Доведено, що 7% ДМСО виявився ефективним крюпротектором, що сприяе збереженню 83,51 ± 1,9% клтин. Показники ргвня АТФ, шровтоградног та молочног кислот у клтинах юсткового мозку собак тсля заморожування-вгдггргву в присутностг ДМСО залишались близькими до контрольног групи.
Ключовi слова: юстковий мозок, кровотворення, кргопошкодження, крюконсервування, глюкозо-6-фосфат, аденозинт-рифосфат, пгровтоградна кислота, молочна кислота.
Биохимические критерии оценки функционального состояния
костного мозга собак
Л.А. Водопянова, К.Д. Югай, О.Н. Бобрицкая, С.Л. Антипин
Харьковская государственная зооветеринарная академия, ул. Академическая, 1, пгт Малая Даниловка, Дергачёвский р-н, Харьковская обл., 62341, Украина
Костный мозг - это комплекс клеток, поддерживающих кроветворения в организме животного. Повышенный терапевтический потенциал клеток костного мозга (ККМ) дает возможность использовать их при лечении различных заболеваний, вызывающих нарушение гемопоэза, а также после применения химиотерапии. Таким образом, клиническая потребность в клетках костного мозга постоянно растет и требует создания резерва биоматериала. В клинической ветеринарии и трансплантологии есть необходимость в долгосрочном хранении клеток костного мозга с помощью технологии замораживания. Использование криозащиты позволяет сохранить клеточный состав близкий к показателям контроля, но ведутся исследования, направленные на изучение механизмов и борьбу с негативными последствиями криоповреждения.
Несмотря на то, что в последние время клетки гемопоэтической системы активно изучаются, многие аспекты их биохимии все еще неопределенны и заслуживают особого внимания. Определяли содержание глюкозо-6-фосфата (Г-6-Ф), аденозинтрифосфата (АТФ), пировиноградной и молочной кислот в клетках костного мозга собак до и после криоконсер-вирования с диметилсульфоксидом (ДМСО). Показано, что 7% ДМСО оказался эффективным криопротекторами, и спо-
Citation:
Vodopyanova, L.A., Yugay, K.D., Bobritskaya, O.N., Antipin, S.L. (2017). Biochemical criteria for evaluation of functional status of dogs bone marrow. Scientific Messenger LNUVMBT named after S.Z. Gzhytskyj, 19(73), 37-39.
Науковий вкник ЛНУВМБТ iMeHi С.З. Гжицького, 2017, т 19, № 73
собствует сохранению 83,51 ± 1,9% клеток. Показатели уровня АТФ, пировиноградной и молочной кислот в клетках костного мозга собак после замораживания-отогрева в присутствии ДМСО оставались близкими к контролю.
Ключевые слова: костный мозг, кроветворение, криоповреждение, криоконсервирование, глюкозо-6-фосфат, аденози-нтрифосфат, пировиноградная кислота, молочная кислота.
Biochemical criteria for evaluation of functional status of dogs bone marrow
L.A. Vodopyanova, K.D. Yugay, O.N. Bobritskaya, S.L. Antipin
Kharkov State Zooveterinary Academy, Akademichna Str., 1, Mala Danylivka, Kharkiv region, Dergachi district, 62341, Ukraine
Bone marrow is a complex of cells, that support hematopoiesis in an organism of animal. The bone marrow cells (BMC) have high therapeutic potential, it gives an opportunity to use them for treatment of different destructions of hematopoiesis and after chemotherapy. Thus, a clinical requirement in marrow increases constantly and requires creation of pool of biomaterial.
In clinical veterinary and transplantation there is a requirement to create long-term storage of bone marrow cells by freezing technology. Using cryoprotectant preserves cell structure close to the control, but research is conducted, to study the mechanisms and the fight against the negative effects of cryodestruction.
Despite the fact that these days the hematopoietic system cells are studied actively many aspects of their biochemistry are still uncertain and deserve special attention. The glucose-6-phosphate, ATP, pyruvic acid and lactic acid in the dogs' bone marrow cells before and after cryopreservation with dimethylsulfoxide have studied.
It was found that 7% DMSO was the most effective cryoprotectant and survive 83.51 ± 1.9% of cells. The ATP, pyruvic and lactic acids levels in dogs' bone marrow cells after freezing-thawed with DMSO were near to the control measure.
Key words: bone marrow, blood, cryodestruction, cryopreservation, glucose-6-phosphate, adenosinetriphosphate, pyruvic acid, lactic acid.
Вступ
Вщомо, що вс1м клтгинам постшно необхщна ене-рпя у виплад АТФ. Одночасно з тим, запасу АТФ у клггинах практично не юнуе i здшснюегься його пос-тшний синтез (Mamprin et al., 2005). Порушення, будь-якого етапу метаболiзму, що призводить до при-пинення синтезу АТФ, згубно для клггани, в зв'язку з цим метою дослiдження було оцшювання бiохiмiч-них критерпв та енергетичного стану ККМ собак.
MaTepia™ i методи дослвджень
ККМ були отримаш вщ 3—4 лигах собак (n = 10). Уа тварини були вшьш вщ паразипв i вакциноваш. ККМ отримували iз стегново! шстки методом шстко-вомозково! пункци з вимиванням середовищем 199. Концентрацш клгган в суспензи доводили до 1*107/мл шляхом розведення середовищем, 3% ембрь онально! сироватки кровi теляти, що мiстить, 91% -199 середовища, 6% цитрату натрш (робоче середо-вище) (Kawano et al., 2004; Goltsev et al., 2005; Warry et al., 2014).
Заморожування проводили в пластикових контейнерах по двоетапнш програмi пiсля додавання крюп-ротекторiв. Вщ^в проводили у водi за температури 41°С. Умiст метаболiтiв в ККМ собак встановлювали спектрофотометрично в свгжоотриманих ККМ, ввдми-тих вiд крюпротектору пiсля експозицп та заморожу-вання-вщ^ву (Cucaeva et al., 1983).
Науковi данi наведенi як середнi значення (М ± m) 10 незалежних експериментiв. Статистичну обробку результатiв проводили за методом Стьюдента-Фишера з використанням програми Microsoft Offiсe Excel.
Результата та ix обговорення
Ввдомо, що крюпротектори, яш використовуються для зниження негативних ефекпв заморожування-в1д1гр1ву, сам можуть впливати на клггини за крюко-нсервування. Ранше нами було проведено пор1вняль-m дослвдження показник1в збереження ККМ собак тсля заморожування-вщ^ву за наявносп непрони-каючих i проникаючих кр1опротектор1в (ДМСО, rai-церин, полiетиленглiколь-400) (Vodop'janova and Zhegunov, 2006). ДМСО показав себе як перспектив-нiший крiопротектор, саме тому, за вивчення енерге-тичних субстрапв клiтини ми використовували ряд концентрацш ДМСО.
Встановлено, що змiна в змюп АТФ i Г-6-Ф у кль тинах ввдбуваються вже на еташ шкубаци. Зниження рiвня цих речовин, ввдбуваетъся як в присутносп крiопротектора в середовищi шкубаци, так i без нього (табл. 1). За цих умов не ввдбуваеться вiрогiдних змiн у змiстi ПВК. Рiвень молочно! кислоти в клгшнах, iнкубованих без крiопротектора, не пвдвищуеться щодо контролю, а за наявносп ДМСО п^двищуеться на 25% i 9% вiдповiдно з ДМСО - 10% i ДМСО - 7%. Пюля крiоконсервування клiтин з ДМСО виникае невелике збiльшення рiвня Г-6-Ф i лактату порiвняно з даними контролю. За цих умов вщзначено незначне зниження рiвня АТФ. Встановлено, що за тривало! шкубаци швидшсть i узгодженiсть бiохiмiчних проце-ав у клiтинах змiнюеться, за цих умов шдвищуються витрати енергетичного потенщалу, викликане чис-ленними чинниками, а саме: переход на анаеробний глiколiз в клiтинах in vitro, пригноблення бюлопчно-го окислення рiзними шпбгторами, формування дода-ткових шляхiв метаболiзму. ККМ використовують анаеробний глiколiз для синтезу АТФ.
Hay^btí вкник ЛHУBMБТ iмeнi C.З. Г^идь^го, 2017, т 19, № 73
Змкт субстрат1в енергетичного обм1ну в ККМ собак
Таблщя 1
KKM Cyбcтpaт eнepгeтичнoгo oбмiнy (мкмoль / г бiлкa)
АТФ Г-6-Ф nBK лaктaт
ima^im KKM 2,318 ± 0,067 0,702 ± 0,042 0,141 ± 0,01 1,256 ± 0,063
iнкyбoвaнi без кpioпpoтeктopa 2,000 ± 0,028* 0,500 ± 0,06*** 0,145 ± 0,004 1,310 ± 0,079
iнкyбoвaнi з flMCO 10% 2,091 ± 0,05* 0,750 ± 0,045 0,156 ± 0,002 1,318 ± 0,07**
iнкyбoвaнi з flMCO 7% 2,208 ± 0,09 0,686 ± 0,052 0,149 ± 0,003 1,130 ± 0,08
кpioкoнcepвoвaнi з flMCO 10% 1,737 ± 0,108** 0,809 ± 0,027* 0,166 ± 0,004 *** 1,567 ± 0,069** *
кpioкoнcepвoвaнi з flMCO 7% 2,046 ± 0,087* 0,852 ± 0,052**** 0,163 ± 0,003* 1,371 ± 0,043** *
* - з^чсим вipoгiднi щoдo KKM coбaк (кoнтpoль), Р < 0,05. ** - pнaчeння дocтoвipнi щoдo M^^KI, Р < 0,01.
*** - з^чсим дocтoвipнi щoдo кoнтpoлю, Р < 0,001. # - з^чсим дocтoвipнi щoдo клггин пicля eкcпoзицiï з кpioпpoтeктo-pib, Р < 0,05.
Отже, пiдтверджуeться необхiднiсть якнайшвид-шого проведення трансплантацп бiологiчного матерь алу, а тривале збер^ання ККМ in vitro неможливе, осшльки в клiтинaх шдвищуеться утворення лактату, що згубне для клгтини (Prohorova et al., 1982; Idei et al., 2008; Gajduk et al., 2016). Уповшьнення метаболь зма, аж до мiнiмaльноï потреби в глюкш та АТФ, можливо тшьки за кpiоконсepвувaння.
Зниження piвня АТФ тсля крюконсервування, може бути пов'язано з пвдвищенням витрат енергетичного мaтepiaлу на ввдновлення структури i функцiй у клiтинaх, що веде за собою компенсаторне збшьшен-ня piвня Г-6-Ф (табл. 1) (Patel et al., 2000; Baust and Baust, 2007).
Зниження piвня ПВК i тдвищений вмiст молочноï кислоти пiсля вiдiгpiвaння, вказуе на дом^вання анаеробних пpоцeсiв у розморожених клгганах, однак аеробне отримання eнepгiï можливо ввдразу пiсля введения клiтин in vivo.
Висновки
Отpимaнi дaиi, тдтверджують припущення про iснувaння зaлeжиостi м1ж piвнeм енергетичного обмь ну та збереженням ККМ. Застосування 7% ДМСО сприяе високому збереженню ККМ собак та збере-женню piвня Г-6-Ф, АТФ, ПВК. Вщновлення функць онування, мeтaболiзму та енергетичних пpоцeсiв тсля тpaнсплaитaцiï вiдбувaeться швидше в клгганах, де бiохiмiчнi зрушення були тшмальт.
Перспективи подальших досл1джень. Крюконсерву-вання ККМ собак iз застосуванням ДМСО дозволяе зберегти piвeнь енергетичного обшну в клiтинaх на прийнятному для трансплантацп piвнi, змiни мЫмаль-m i це не повинно вщбиватися на функцiонaльних та терапевтичних властивостях ККМ, що застосовують-ся за лжування piзиих порушень гемопоезу у собак.
Бiблiографiчнi посилання
Warry, E.E., Willcox, J.L., Suter, S.E. (2014). Autologous peripheral blood hematopoietic cell transplantation in dogs with T-cell lymphoma. Vet. Intern. Med. 28(2), 529-37.
Baust, J.G., Baust, J.M. (2007). Advances in biopreserva-tion. Ed. by - By Tayloor & Francis Group. LLC, 1562.
Mamprin, M.E., Vega, F., Rodrigues, J.V. (2005). Adenosine 5 triphoshate transport and accumulation during the cold preservation of rat hepatocytes in University of Wisconsin solution. World J. Gastroenterol. 11(13), 1957-1964.
Gajduk, M.B., Gutyj, B.V., Gufrij, D.F. (2016). Therapeutic effectiveness of the drug RBS - DOG as immune modulating means in the treatment of dogs with wounds at hypo ergic type of inflammation. Scientific Messenger LNUVMBT named after S.Z. Gzhytskyj, 18, 2(66), 35-39.
Goltsev, A.M., Dubrava, T.G., Kozlova, Yu.A., Gurina, T.M., Ostankov, M.V. (2005). Ocenka gemopojetich-eskogo potenciala stvolovyh krovetvornyh kletok kostnogo mozga s izmenennym ishodnym statusom pod dejstviem faktorov kriokonservirovanija. Prob-lemy kriobiologii. 15(3), 320-323 (in Russian).
Kawano, Y., Lee, C.L., Watanabe, T., Abe, T. (2004). Cryopreservation of mobilized blood stem cells at a higher cell concentration without the use of a programmed freezer. Ann. Hematol. 83(1), 50-54.
Cucaeva, A.A., Agranenko, V.A., Fedorova, L.I. (1983). Kriokonservirovanie kletochnyh suspenzij. Pod red. A.A. Cucaevoj. - K.: Nauk. dumka (in Russian).
Vodop'janova, L.A., Zhegunov, G.F. (2006). Sohrannost' kletok kostnogo mozga sobak posle jekspozicii s krioprotektorami i zamorazhivanija v zhidkom azote. Problemy kriobiologii. 16(2), 207-210 (in Russian).
Idei, K., Matsuura, S., Fujino, Y. (2008). Investigation of Various Methods for the Cryopreservation of Canine Bone Marrow- Derived CD34+ Cells. J. Vet. Med. Sci. 70(11), 1211-1217.
Prohorova, M.I., Zolotova, L.A., Flerov, M.A. (1982). (1982). Metody biohimicheskih issledovanij (lipidnyj i jenergeticheskij obmen). L.: Izd. Leningrad. univer. (in Russian).
Patel, S.D., Paroutsakis, E.T., Winter, J.N., Muller, W.M. (2000). The lactate issue revisited: novel feeding protocols to examine inhibition of cell proliferation and glucose metabolism in hematopoietic cell cultures. Biotechnol. Prog. 16(5), 885-892.
Cmammn nadiurnm do peda^iï 17.03.2017
