CC BY
13
УДК 57.043:612.111
Денисова О.М., Жегунов Г.Ф., Xac6ayi Х.А., Ващенко В.В. ©
Хартвсъка державна зооветеринарна академ1я
ЕФЕКТИВШСТЬ ВИКОРИСТАННЯ КОМБ1НОВАНИХ СЕРЕДОВИЩ ДЛЯ КРЮКОНСЕРВУВАННЯ ЕРИТРОЦИТ1В БИКА
Досл1джували збережешстъ еритроцит1в быка теля крюконсервування nid захистом комбтованих KpioKOHcepeanmie, до складу яких входять проникаючi (ДМСО та 1,2-пропандюл) та непроникаючий (ПЕО-1500) крюпротектори. Комбтування проникающих KpionpomeKmopie з пол1мерами сприяе тдвищенню крюпротекторногефективност1.
Ключое1 слова: крюконсервування, еритроцити бика, крюпротектор
Зараз кнують методи крюконсервування кл1тин кров1 людини, що дозволяють збер1гати ïï протягом тривалого часу. G численш роботи з вивчення ефективност1 р1зних cnoco6iB заморожування-вщ1гр1ву й впливу кр1опротбктор1в на збережешеть еритроцит1в людини. Розширення д1апазону дослщжень мсхашзм1в стабшзаци кл1тин, охоплюючи еритроцити шших ссавщв, яю характеризуються певними особливостями структури, дозволяе дослщников1 бшьш ч1тко виявити загальш принципи оргашзацп кл1тин, спрямоваш на пщвищення стшкост1 до несприятливих факторîb. Зокрема, еритроцити коня, бика й собаки, маючи видов! особливост1 в оргашзацп мембранно-цитоскелетного комплексу й регуляцп ioHHoro гомеостазу, становлять значний штерес для виявлення загальних законом1рностей реакци кл1тин на стресов1 фактори процесу крюконсервування.
KpiM загальнобюлопчного значения дослщження поводження еритроциив р1зних тварин в умовах низьких температур, виникають передумови для розробки метод1в крюконсервування кров1 тварин для використання у ветеринарнш медицин!.
Переливания кров1 здавна вважаеться високоефективним методом штенсивно1 Tepaniï. Перелита кров, кр1м загальновщомих функцш: замкно!, ¿муностимулюючо1, оксигенеруючо!, поживно!, виконуе й своерщну буферну функцш. Еритроцити здатш пасивно адсорбувати на свош поверхш велику кшьккть антигешв, таких як бактер1альш полюахариди, токсини або Bipycn. При такш адсорбци не вщбуваеться шактиващя BipyciB, але спостер1гаеться значне зниження штоксикацп. У важких випадках врятувати тварину можна, тшьки використовуючи гемотрансфузш. При застосуванш переливания icHye проблема стерильност1 кров1 донора, тому що гарант1я того, що донор не е нос1ем якого-небудь шфекцшного агента, як правило, вщеутня. Тому виникае необхщшеть створення банк1в кров1 донор1в. У такий cnoci6 гемотрансфуз1я крюконсервованих еритроциив може значною м1рою полегшити л1кування при
© Денисова О.М., Жегунов Г.Ф., Xacôayi Х.А., Ващенко В.В., 2013
71
деяких шфекцшних, швазшних захворюваннях, а також при отруеннях I значних крововтратах.
Розкриття мехашзм1в крюзахисту й крюпошкодження еритроцит1в тварин дозволить розробити низькотемпературш технологи збер1гання кл1тин I створити банк кров1 тварин. Створення таких банюв дасть можливкть завжди мати запас рщкюних груп кров1 тварин.
Останшм часом активно розробляються нов1 методи створення ефективних крюзахисних середовищ для низькотемпературного збер1гання р1зних кл1тин та тканин. Одним з них е використання комбшацш двох та бшьше крюпротектор1в. Використання таких крюконсерванив приводить до отримання високих результат крюконсервування стволових кл1тин периферично! кров1 та юсткового мозку людини [4, 7], гемопоетичних кл1тин кордово! кров1 [5], еритроцшгв людини [2].
Мета роботи - вивчення збереженост1 еритроцит1в бика теля низькотемпературно! консерваци (-196 °С у рщкому азот1) пщ захистом комбшованих крюконсерванив.
Матер1али 1 методи. Матер1алом дослщження були еритроцити бика. Вс1 тварини були здоровими, статевозршими самцями. Тварини були ¿мушзоваш, вшьш вщ паразит1в. Кров бика (в1ком 2-4-х роюв) забирали з яремно! вени. Дослщження проводили згщно з «Загальними принципами дослщження на тваринах», що були одобрен! III Нацюнальним конгресом з бюетики (Кшв, 2007) та узгодженш з положениями «Свропейсько! конвенци про захист хребетних тварин» (Страсбург, 1985 р.).
Кров заготовляли на глюкозо-цитратному консервант! I збер1гали до крюконсервування не бшьше 48 годин при 4 °С. Еритроцити перед проведениям експерименту центрифугували при 350 § 1 трич1 промивали ¿зотошчним сольовим розчином (150 мМ №С1, 5 мМ фосфатний буфер, рН 7.4).
Для крюконсервування використовували комбшоваш крюпротектори, до складу яких входили диметилсульфоксид (ДМСО), 1,2-пропандюл (1,2-ПД), пол1етиленоксид м.м. 1500 (ПЕ0-1500). Розчини крюпротектор1в в концентращях 5 - 30 % готували на сахарозно-сольовому середовищ! (50 мМ №С1 + 200 мМ сахарози + 5 мМ фосфатний буфер, рН 7,4) або сольовому середовищ! (150мМ №С1 + 5 мМ фосфатний буфер, рН 7,4).
Розчин крюпротектору додавали до кл1тинно! суспензи при юмнатнш температур! у стввщношенш 1:1 (по об'ему) по краплям з1 швидкютю приблизно 10 мл за хвилину. Крюконсервування проводили у пол1етиленових контейнерах об'емом 10 мл. Заморожування здшснювали до температури (-196 °С) шляхом швидкого занурення контейнеру у рщкий азот. Вщ1гр1в кл1тинно! суспензп здшснювали на водянш баш при температур! 42-44 °С з постшним колиханням контейнеру до повного вщ1гр1ву.
Крюпротектор видаляли сершним центрифугуванням при 350 § [3]. На першому етат до крюконсервованих еритроцит1в додавали р1вний об'ем гшертошчного сольового розчину (600 мМ №С1, 5мМ фосфатний буфер, рН
72
7,4). Шсля чого еритроцити дв1ч1 промивали ¿зотошчним сольовим розчином (150 мМ NaCl, 5мМ фосфатний буфер, рН 7,4) .
Р1вень гемол1зу розраховували теля спектрофотометричного визначення кшькост1 гемоглобшу в супернатант1, вим1рюючи оптичну густину при 543 нм [6]:
% гемол1зу = [Ai/ A2]x100 %, де, А1 - оптична густина супернатанту дослщжувано! проби; А2 - оптичиа густина при повному гемол1з1 контрольно! проби.
Статистичну обробку даних проводили параметричним методом з використанням критерт знатв [1]. Для розрахунтв використовували комп'ютерну програму "Stat Graphics ". Кглъкгстъ експеримент1в у кожши cepii dowidie була не менше п'яти.
Результата i обговорення. Комбшування у середовищ1 заморожування непроникаючих крюпротектор1в з проникаючими дозволяе зменшити !х концентрацию без змши збереженост1 та осмотично! стшкост1 заморожених кл1тин. Тому були використаш проникаюч1 крюпротектори - пропандюл-1,2 та ДМСО, i непроникаючий - ПЕО-1500.
зо -
70 -60 -
г? 50 -
i 40 -
о
Ц 30 -
20 -
10 -
о -
rh гЬ rb
1 23456789
Середовище
Рис. 1. Збережешсть еритроцит1в бика теля кршконсервування з проникаючими i непроникаючим кршпротекторами у сольовому середовищ1 (150 mM NaCl+10mM фосфатний буфер, рН 7,4). Середовища м!стять: 1 - 10% ДМС0+10% пропандюл-1,2; 2 - 5% ДМСО+15% пропандюл-1,2; 3 - 15% пропандюл-1,2;+5% ДМСО; 4 - 10% ПЕ0-1500+10% пропандюл-1,2; 5 - 5% ПЕ0-1500+5% пропандюл-1,2; 6 - 5% ПЕ0-1500+15% пропандюл-1,2; 7 - 10% ПЕ0-1500+10% ДМСО; 8 - 5% ПЕ0-1500+ 15% ДМСО; 9 - 15% ПЕ0-1500+5% ДМСО.
Бачимо, що бшьша збережешсть кл1тин спостер1гаеться при кршконсервування еритроципв з крюконсервантами, в склад яких входять 10% ДМС0+10% пропандюл-1,2, 15% пропандюл-1,2+5% ДМСО та 5% ПЕ0-1500+
73
15% ДМСО (рис.1). При додаванш в середовище сахарози (рис.2) спостерыгаэться зниження р1вня пошкоджеиия кл1тин на 10 %.
Найкраща збережешсть кл1тин була выдмычена при використанш сумш1 крюпротектор1в, що мктять ДМСО+пропандюл-1,2.
Рис. 2. Збережешсть ернтроцнтчв бика шсля кршконсервування з проникаючими 1 непроникаючим кршпротекторами у сахарозно-сольовому середовищ1 (200 mM сахарози + 50 mM NaCl + 10mM фосфатний буфер, рН 7,4). Середовища шстять: 10 - 10% ДМС0+10% пропандюл-1,2; 11 - 5% ДМСО+15% пропандюл-1,2; 12 - 15% пропандюл-1,2;+5% ДМСО; 13 - 10% ПЕ0-1500+10% пропандюл-1,2; 14 - 15% ПЕ0-1500+5% пропандюл-1,2; 15 -5% ПЕ0-1500+15% пропандюл-1,2; 16 - 10% ПЕ0-1500+10% ДМСО; 17 - 5% ПЕ0-1500+ 15% ДМСО; 18 - 15% ПЕ0-1500+5% ДМСО.
Вщомо, що проникаюч1 крюпротектори необхщно видаляти ¿з кл1тин перед трансфуз1ею для попередження осмотичного л1зису. Видалення крюпротектору з еритроцит1в шляхом трикратного вщмивання сольовим середовищем з поступовим зниженням концентрацп сол1 призводить до збшьшення р1вня пошкодження еритроцит1в у вс1х вар1антах.
При крюконсервуванш еритроципв пщ впливом сольового середовища (рис. 3) задовшьний р1вень збереженост1 кл1тин досягаеться при використанш 5% ПЕ0-1500+15% ДМСО (гемол1з 25,9% ± 0,5%). 1нш1 крюконсерванти менш ефективш.
74
Рис. 3. Збережешсть ернтроцнтчв бика теля заморожування-вщ1гр1ву та вщмивання кршпротектору, що були кршконсервоваш пщ захистом кр1оконсервант1в у сольовому середовищ1 (150 тМ КаС1 + 10тМ фосфатний буфер, рН 7,4): 1 - 10% ДМСО+10% пропандюл-1,2; 2 - 5% ДМСО+15% пропандюл-1,2; 3 - 15% пропандюл-1,2;+5% ДМСО; 4 - 10% ПЕ0-1500+10% пропанд1ол-1,2; 5 - 15% ПЕ0-1500+5% пропанд1ол-1,2; 6 - 5% ПЕ0-1500+15% пропандюл-1,2; 7 - 10% ПЕ0-1500+10% ДМСО; 8 - 5% ПЕ0-1500+ 15% ДМСО; 9 - 15% ПЕ0-1500+5% ДМСО.
Коли для приготування кр1оконсервант1в використовували сахарозно-сольове середовище, то еритроцити п1сля кр1оконсервування та в1дмивання крюпротектору збер1галися значно краще (рис. 4). Низький р1вень пошкодження спостер1гаеться при використанш у якост1 кр1опротектор1в сумш1 10% ДМС0+10% пропандюл-1,2, 5% ДМСО+15% пропандюл-1,2, а також 5% ПЕ0-1500+15% ДМСО.
75
Рис. 4. Збережетсть еритроцит1в бика теля заморожування-вщ1гр1ву та вщмивання кршпротектору, що були кршконсервоват пщ захистом кршконсервант1в у сахарозно-сольовому середовищ1 (200 mM сахарози + 50 тМ ЫаС1 + 10тМ фосфатний буфер, рН 7,4): 10 - 10% ДМСО+10% пропандюл-1,2; 11 - 5% ДМСО+15% пропандюл-1,2; 12 - 15% пропандюл-1,2;+5% ДМСО; 13 - 10% ПЕ0-1500+10% пропандюл-1,2; 14 - 15% ПЕ0-1500+5% пропандюл-1,2; 15 - 5% ПЕ0-1500+15% пропандюл-1,2; 16 - 10% ПЕ0-1500+10% ДМСО; 17 - 5% ПЕ0-1500+ 15% ДМСО; 18 - 15% ПЕ0-1500+5% ДМСО.
Пояснити ефектившеть комбшованих крюпротектор1в можливо з вщомих даних про мехашзми проникаю чих та непроникаючих крюпротектор1в. Непроникаюч1 крюпротектори знижують температуру замерзания розчину, однак, виникае значна дегщратащя кл1тин та досягнення ними мЫмального об'ему. Проникаюч1 крюпротектори потраплять до кл1тин та знижують !х дегщратацш. Але це призводить до ризику утворення внутр1шньокл1тинних кристал1в льоду. Таким чином, д1я окремо проникаючих чи непроникаючих крюпротектор1в знижуеться негативними ефектами. Одним з пщход1в виршення ще! проблеми е включения в середовище з непроникаючим крюпротекторам проникаючого.
Висновки. Виходячи з даних про р1вень гемол1зу теля крюконсервування та вщмивання крюпротектору можна зробити висновок, що найбшьш яккний р1вень захисту еритроцит1в вщ фактор1в низькотемпературного консервування надають крюпротектори, що м1стять:
- 10% ДМС0+10% пропандюл-1,2+200 тМ сахарози+50 тМ ШС1+5 тМ фосфатний буфер;
- 5% ДМСО+15% пропандюл-1,2+200 тМ сахарози+50 тМ ШС1+5 тМ фосфатний буфер;
76
- 15%ДМСО+5% ПЕО-1500+200 mM сахарози+50 mM NaCl+5 mM фосфатний буфер.
Таким чином, можливо сказати про вщносну ефектившсть використання комбшованих крюпротектор1в. Вони забезпечують оптимальну дегщратацш кл1тин, що забезпечуе ix стшкють до осмотичних дш.
Перспективи подальших дослщжень. Збережешсть еритроцит1в теля розморожування недостатнш параметр для визначення життездатност1 кл1тин. Тому, плануеться провести оцшку деконсервованих кл1тин на можливють i'x функцюнування в pyoni кров1 теля впливу фактор1в низькотемпературного впливу.
Л1тература
1. Бейли Н. Статистические методы в биологии. - М.: Мир, 1963. - 71 с.
2. Рамазанов В.В. Осмотические свойства эритроцитов, замороженных в средах с непроникающими и проникающими криопротекторами / В. В. Рамазанов, В.А. Бондаренко. - Проблемы криобиологии, 2010. - Т.20, №1. - С. 47-57.
3.Семенова Н.В. Сравнительное изучение криоконсервированных эритроконцентратов при различных способах их отмывания / Н.В. Семенова, Л.И. Федорова, В.Л. Виноградов и др// Гематология и трансфузиол.- 1986. - № 10. - С. 42-52.
4. Clapisson G. Cryopreservation with hydroxyethylstarch (HES) + dimethylsulfoxide (DMSO) gives better results than DMSO alone / G. Clapisson, C. Salinas , P. Malacher et al. // Bull Cancer. - 2004. - Vol.91(4). - P. 97-102.
5. Liu K.Y. Study on non-programmed process using dimethyl sulfoxide and hydroxyethyl starch as cryoprotectants in cryopreservation of cord blood hematopoietic cells / K.Y. Liu , W.C. Dong, Y.L.Wang et al. // Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. - 2004. - Vol.12(5). - P.670-673.
6. Mazur P. Permeability of the human erythrocyte to glycerol in 1 and 2 M solutions at 0 or 20 degrees C / P. Mazur, Miller R.H. // Cryobiology. - 1976. -Vol.13(5). - P.507-522.
7. Rowley S. D. A randomized phase III clinical trial of autologous blood stem cell transplantation comparing cryopreservation using dimethylsulfoxide vs dimethylsulfoxide with hydroxyethylstarch / S.D. Rowley, Z. Feng, L. Chen et al. // Bone Marrow Transplant. - 2003. Vol.31(11). - P. 1043-1051.
Summary
O.M. Denysova, G.P. Zegunov, H.A. Hacbaui, B.B. Vachenko EFFICIENCY EMPLOYMENT OF COMBINED CRYOPRESERVATIVES FOR CRYOPRESERVATIOV OF BOVINES ERYTHROCYTE
The integrity of bovines erythrocytes after cryopreservation with protection combined cryopreservatives, containing penetrating (DMSO, 1,2-propane diol) and non-penetrative (PEG-1500) cryoprotectants were studied. Combination a penetrating cryoprotectants with a polymer promotes increase the protection efficiency during freezing-thawing.
Рецензент - д.вет.н., професор Стефаник В.Ю.
77
