Конструирование полимерных иммуноглобулиновых препаратов для идентификации различных сероваров Legionella pneumophila в реакции слайд-агглютинации

Карбышев Г.Л.; Наркевич А.Н.; Кочеткова А.П.; Ларионова Людмила Владимировна; Симакова Д.И.; Люкшина Е.Ю.; Лысова Л.К.; Терентьев А.Н.; Шелохович А.И.; Сокиркина О.Г.

микробиология

ЛИТЕРАТУРА

1. Бондаренко В. М., Мацулевич Т. В. Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2007: 8-35.

2. Конев Ю. В. Нарушение микробиоценоза кишечника и его лечение. Справочник поликлинического врача. 2007; 7; 34-8.

3. Малое В. А., Гюлазян Н. М.Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта: современное состояние проблемы. Лечащий врач. 2007: 6: 10-4.

4. Отраслевой Стандарт "Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника" (ОСТ 91500.11.0004-2003, утвержден Приказом Министерства здравоохранения РФ № 231 от 09.06.2003). М.; 2003.

Поступила 06.06.12

А. Н. Наркевич, А. П. Кочеткова, Л. в. Ларионова, Д. И. Симакова, Е. Ю. Люкшина, Л. К. Лысова, А. Н. Терентьев, А. И. Шелохович, О. Г. Сокиркина

конструирование полимерных иммуноглобулиновых препаратов для идентификации различных сероваров Legionella pneumophila в реакции слайд-агглютинации

ФКУз Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора

В представленном исследовании решалась задача разработки полимерного диагностического препарата для идентификации эпидзначимых серогрупп Legionella pneumophila, сочетающего скорость учета реакции (1-5 мин) коагглютинирующих препаратов с цветной визуализацией и демонстративностью реакции агломерации объемной с полимерными диагностикумами. Для этого специально синтезированные полимерные микросферы сенсибилизировали сыворотками, обогащенными антителами к липополисахариду соответствующего серовара L. pneumophila. Полученные иммуноглобулиновые диагностические препараты выявляют возбудителя легионеллеза в реакции слайд-агглютинации на стекле в течение 1-5 мин. Полимерные диагностические препараты дают положительную реакцию с культурой соответствующего ему серовара и не дают реакции с другими гомо- и гетерологичными возбудителями инфекционных заболеваний.

Ключевые слова: полимерные диагностические препараты, серовары, слайд-агглютинация

G.L. Karbyshev, A.N. Narkevitch, A.P. Kochetkova, L.V. Larionova, D.I. Simakova, Ye.Yu. Lyukshina, L.K. Lysova, A.N. Terentiyev,

A.I. Shelokhovitch, O.G. Sokirkina THE DEVELOPMENT OF POLYMER IMMUNOGLOBULIN PREPARATIONS TO IDENTIFY DIFFERENT SEROVARS LEGIONELLA PNEUMOPHILIA IN REACTION OF SLIDE-AGGLUTINATION The article deals with the results of study targeted to develop polymer diagnostic preparation to identify epidemically significant serogroups Legionella pneumophilia. The preparation combines rate of record (1-5 min) of reaction ofparagglutinining preparations with color visualization and demonstrative of reaction ofvolume agglomeration with polymer diagnosticums. The specially synthesized polymer microspheres were sensibilized with serums enriched with antibodies to lipopolysaccharide of corresponding serovar L. pneumophilia. The derived immunoglobulin diagnostic preparations detect agent of legionellesis in the reaction of slide-agglutination on glass during 1-5 min. The polymer diagnostic preparations provide positive reaction with culture of corresponding serovar and no reaction with other gomologic and geterologic agents of infectious diseases.

Key words: polymer diagnostic preparation, serovar, slide-agglutination

Г. Л. Карбышев,

Уже в первые годы изучения возбудителя легионеллеза установлено, что, несмотря на сходство различных штаммов легионелл по питательным потребностям и гомологии ДНК, сыворотки к различным серогруппам Legionella pneumophila взаимодействуют только с гомологичными серогруппами [5, 8, 10].

S. Otten и соавт. [9] показали, что серогруппспецифи-ческие антигены, выделенные из различных серогрупп L. pneumophila, имеют липополисахаридную природу.

С. Ciesielski и соавт. [3] описали характеристики липополисахарида (ЛПС) и других видов легионелл и продемонстрировали его взаимосвязь с серогрупповой специфичностью.

Для корреспонденции: Ларионова Людмила Владимировна, науч. сотр Адрес: 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40 Телефон: (8863) 240-91-13 E-mail: [email protected]

D. Jürgens и соавт. [6] изучили перекрестно-реагирующие липополисахаридные антигены и показали, что электрофорез и иммуноблоттинг можно использовать в серологическом типировании легионелл.

За последние годы такие методы, как иммунофер-ментный анализ, иммуноблоттинг, полимеразная цепная реакция, стали обычными в практике клинико-диагностических лабораторий. Однако при этом в определенной мере сужается сфера их применения до специализированных лабораторий.

В этом контексте агглютинационные тесты, наиболее часто используемые бактериологами, несмотря на существующие представления об их архаичности, не утратили своей актуальности и в современных условиях. Они имеют не только четко очерченную нишу применения в лабораторной диагностике, но и пути к совершенствованию и оптимизации.

В РостНИПЧИ разработан и сконструирован набор коагглютинирующих диагностикумов (КоА) для серологической идентификации L. pneumophila некоторых

клиническая лабораторная диагностика, № 3, 2013

Таблица 1

Проверка чувствительности

Иммуноглобу- Культура

линовыи диа- L. pneumophila серовар 1 L. pneumophila серовар 3 L. pneumophila серовар 6

109 5 ■ 108 108 109 5 ■ 108 108 109 5 ■ 108 108

К cepoвapу 1 ++++ ++++ ++++ - - - - - -

К cepoвapу 3 - - - ++++ ++++ ++++ - - -

К cepoвapу 6 - - - - - - ++++ ++++ ++++

серогрупп. В настоящее время данный набор прошел экспериментальные и полевые испытания [1, 2].

За рубежом для серологической идентификации L. pneumophila используют наборы иммуноглобулиновых диагностикумов производства «Oxoid» (Великобритания) и «Biorad» (США). Указанные наборы позволяют идентифицировать L. pneumophila серогруппы 1, суммарно серогрупп 2-15, но не дают возможности идентифицировать широко распространенные, эпидзначимые серогруппы 2, 3, 4, 6 и др.

В РостНИПЧИ разработан и утвержден на федеральном уровне полимерный легионеллезный диагностикум для выявления антител к возбудителю легионеллеза в цветной объемной реакции агломерации (ОРА).

Цель настоящего исследования - создание полимерного диагностического препарата для идентификации эпидзначимых серогрупп L. pneumophila, сочетающего скорость учета реакции (в течение 1-5 мин) коагглюти-нирующих препаратов с цветной визуализацией и демонстративностью ОРА.

Материалы и методы. В работе использовали типичные штаммы L. pneumophila сероваров 1, 3 и 6. Культуры выращивали на СЭЛ (среда элективная легионеллезная) в течение 3 сут. Кроликов иммунизировали культурами L. pneumophila сероваров 1, 3 и 6. после 2-часового кипячения, что позволило получить сыворотки, обогащенные антителами к ЛПС. Схема иммунизации кроликов

следующая: предварительные подкожные (п/к) инъекции тактивина (1, 2, 3-и сутки); 4-е сутки - внутривенная (в/в) инъекция 200 млн м.к. в забуференном физиологическом растворе (рН 7,2); 9, 10, 11-е сутки - п/к инъекции 200 млн м.к. с неполным адъювантом Фрейнда; 16-е сутки - в/в инъекция 500 млн м.к.; 21, 22 и 23-и сутки - п/к инъекции 500 млн м.к. в неполном адъюванте Фрейнда; 28-е сутки - в/в инъекция 1 млрд м.к. в забуференном физиологическом растворе (рН 7,2); 33, 34 и 35-е сутки -п/к инъекция 1 млрд м.к. в неполном адъюванте Фрейнда; 40-41-е сутки - тотальное обескровливание.

Титр сыворотки определяли в ОРА с культурами L. pneumophila сероваров 1, 3 и 6.

Титр антител к ЛПС L. pneumophila определяли в дот-блотте с препаратом ЛПС L. pneumophila. ЛПС получали по методу Dar Veean и соавт. [3]. Для получения диагностику-ма использовали специально синтезированные полиакро-леиновые микросферы размером 1 мкм, окрашенные сафранином. Для сенсибилизации микросфер выделяли иммуноглобулины из легионеллезных сывороток метанольным методом [4]. Содержание белка в препаратах иммуноглобулина определяли по О. Lowry и соавт. [7]. Сенсибилизацию проводили в забуференном физиологическом растворе (рН 7,2) 2 ч при 20oC, а затем 16 ч в холодильнике. В качестве сенситина использовали иммуноглобулины или нативную сыворотку. Чувствительность диагностикумов проверяли в реакции слайд-агглютинации на стекле с 1 млрд м.к. L. pneumophila сероваров 1, 3, 6 и двукратными разведениями культур. Специфичность исследовали в перекрестной реакции слайд-агглютинации с теми же гомологичными культурами легионелл, а также на наборе штаммов гетеро-логичных бактериальных культур.

Результаты и обсуждение. Титры сывороток к се-ровару 1 L. pneumophila 1:1600-1:3200, к серовару 3 1:1600-1:3200, к серовару 6 1:1600. Титр противолипо-полисахаридных антител, титр сывороток, полученных к культурам после 30 мин кипячения, составил 1:1601:320; титр сывороток, полученных после кипячения культур в течение 2 ч, - 1:1280-1:2560. Содержание белка в препаратах иммуноглобулинов 4 мг/мл. Доза сенсибилизации 1,4 мг белка на 25 мл носителя или 100-200 мкл соответствующей сыворотки.

В результате сенсибилизации полимерных микросфер получены три полимерных иммуноглобулино-вых диагностикума для идентификации возбудителя L. pneumophila сероваров 1, 3 и 6. Результаты исследования чувствительности и специфичности представлены в табл. 1, 2, которые учитывали в течение 1-5 мин.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о следующем:

1) сконструированные полимерные легионеллезные диагностикумы выявляют возбудителя легионеллеза в реакции слайд-агглютинации на стекле в течение 1-5 мин в концентрации 108;

2) каждый из полученных диагностикумов дает положительную реакцию с культурой только соответству-

Таблица 2

Проверка специфичности

Бактериальная культура Полимерные иммуноглобулиновые легионеллезные диагностикумы

к серовару 1 к серовару 3 к серовару 6

L. pneumophila серовар 1 L. pneumophila серовар 2 L. pneumophila серовар 3 L. pneumophila серовар 4 L. pneumophila серовар 5 L. pneumophila серовар 6 L. pneumophila серовар 7 Chlamidia pneumoniae Chlamidia pneumoniae без ЛПС

E. coli

Listeria monocytogenes Yersinia pseudotuberculosis

F. tularensis Salmonella spp. Shigella spp.

++++

организация лабораторной службы

ющего ему серовара L. pneumophila и не дает реакции с другими гомологичными и гетерологичными возбудителями инфекционных заболеваний;

3) сыворотки, на основе которых приготовлены диа-гностикумы, обогащены антителами к ЛПС соответствующего серовара;

4) диагностикумы выявляют легионеллезный ЛПС соответствующего серовара.

Заключение. Результаты проведенного исследования дают возможность создания набора полимерных диагностических препаратов для идентификации отдельных сероваров возбудителя легионеллеза в течение 1-5 мин в цветной, демонстративной реакции слайд-агглютинации.

ЛИТЕРАТУРА

1. Карбышев Г. Л., Лысова Л. К., Терентьев А. Н., Веркина Л. М., Кочеткова А. П. Конструирование и экспериментальные испытания набора коагглютинирующих диагностикумов легионел-лезных серогрупп 1-7. Научная мысль Кавказа. 2006; 8 (приложение): 276-80.

2. Карбышев Г. Л. Совершенствование серологической диагностики легионеллеза: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. 2007.

3. Ciesielski С. А., Beazer M. J., Wang W. L. Serogroup specifity of Legionella pneumophila is related to LPS characteristics. Infect. Immun. 1986; 54: 2.

4. Dubert J. M., Stiewicz P., Rebeyrotte P. Nouvelle method de separation des proteins seriques par methanol application au serum de lapinet de cheval. Ann. Inst. Pasteur. 1953; 84: 370-81.

5. Johnson W., Pesanti E., Elliott J. A. Serospecificity and opsonic activity of antisera to Legionella pneumophila. Infect. Immun. 1979; 26 (2): 698-704.

6. Jürgens D., Fehrenbach F. J. Cross-reacting lipopolysaccharide antigens in Legionella pneumophila serogroups 1 to 14. Infect. Immun. 1995; 63: 2180-4.

7. Lowry O. H., Rosebrough N. G., Farr A. L., Bandal R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193 (1): 265-75.

8. McKinney R. M., Thacker L., Harris P. P. et al. Four serogroups Legionnaires' disease bacteria defined by direct immunofluorescens. Ann. Intern. Med. 1979; 90: 621-4.

9. Otten S., Iyer S., Johnson W., Montgomery R. Serospecific antigens of Legionella pneumophila. J. Bacteriol. 1986; 167: 893-904.

10. Wong К. H., Schalla W. O., Arko R. J. et al. Immunochemical, serologic and immunologic properties of major antigens isolated from the Legionnaires' disease bacterium: observation bearing on the feasibility of a vaccine. Ann. Intern. Med. 1979; 90: 634-8.

Поступила 25.06.12

организация лабораторной службы

Ю. в. Эмануэль1, в. И. Трофимов2, Н. А. Филиппова2, в. Л. Эмануэль1

направления и опыт интеграции клинико-лабораторной диагностики и отраслевой медицины

1Кафедра клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины, 2кафедра госпитальной терапии ГБОУ вПО Санкт-Петербургский госмедуниверситет им. И. П. Павлова минздравсоцразвития России

Статья посвящена актуальным вопросам преподавания лабораторной медицины студентам лечебного факультета и врачам, обучающимся по различным программам послевузовского образования. Рассматриваются основные модели взаимодействия между врачами-клиницистами и специалистами лабораторной диагностики. Предложенная модель преподавания лабораторной медицины разработана в сотрудничестве с клиническими кафедрами и основана на принципе «клинико-лабораторного консилиума». В основе данной системы лежат анализ клинических случаев конкретных пациентов, а также клинические разборы. В качестве примера приведен алгоритм обсуждения одной из используемых в преподавании ситуационных задач.

Ключевые слова: преподавание, лабораторная медицина, клинико-лабораторный консилиум, ситуационные задачи

Yu.V. Emanuel, V.I. Trofimov, N.A. Filippova, V.L. Emanuel

THE DIRECTIONS AND EXPERIENCES OF INTEGRATION OF CLINICAL LABORATORY DIAGNOSTIC

AND BRANCH MEDICINE

The article considers the actual issues of teaching laboratory medicine to students of medical faculty and to physicians getting trained in different programs ofpostgraduate education. The major models of interaction between clinical physicians and .specialists of laboratory diagnostic are considered. The proposed model of teaching of laboratory medicine is developed in collaboration with clinical chairs and is based on the principle of "clinical laboratory council ofphysicians". The analysis of clinical cases of specific patients and clinical analytical critiques are in the basement of the given system. The algorithm of considering one of situation tasks used in teaching is presented as example.

Key words: education, laboratory medicine, clinical laboratory council ofphysicians, situation task

Для корреспонденции:

Эмануэль Юлия Владимировна, канд. мед. наук, ассистент каф. клин. лаб. диагностики

Адрес: 197022, Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, 6/8, корп. 11 Телефон: (812)233-97-26 E-mail: [email protected]