CC BY
18
УДК 616.24-002-022:616.9
Г.Л.Карбышев, А.Н.Терентьев, Л.М.Веркина, А.Н.Наркевич, И.Р.Симонова,
А.П.Кочеткова, Л.К.Лысова
КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА Сообщение 3. Конструирование и экспериментальные испытания легионеллезного серогруппы 1 иммуноглобулинового полимерного диагностикума
Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт
Обобщены результаты исследований по конструированию легионеллезного иммуноглобулинового полимерного диагностикума, предназначенного для выявления растворимого легионеллезного антигена в моче, в объектах внешней среды, а также для идентификации выделенных культур. Определен диапазон чувствительности диагностикума, который составил от 1 до 50 мкг/мл антигена по белку. Показана достаточная специфичность диагностикума. Полученный препарат рекомендуется для диагностики болезни легионеров на ранних стадиях заболевания.
Ключевые слова: легионеллез, диагностика, иммуноглобулиновый диагностикум.
Способы обнаружения легионеллезного антигена в качестве экспрессных методов диагностики на ранних стадиях заболевания широко применяются и основаны в большинстве случаев на трех серологических реакциях: иммуноферментном анализе, ра-диоиммунном и прямой иммунофлюоресценции [1]. Легионеллезный антиген был обнаружен в моче трех из пяти больных во время вспышки заболеваний в Филадельфии в 1977 г. [2]. Исследования показали, что растворимый легионеллезный антиген появляется в моче у больных в первые 3 дня от начала заболевания, и его экскреция может сохраняться до 1 года, при этом антиген в сыворотке крови в большинстве случае не определяется [10]. Растворимый легионеллезный антиген выделяют у 80 % больных [9]. Чувствительность метода, по данным разных авторов, составила от 70 до 100 %, а специфичность до 100 % [9, 15]. Метод стал широко применяться для диагностических целей. Дальнейшие исследования по применению иммуноферментного метода обнаружения легионеллезного антигена в моче позволили предложить этот метод для окончательного подтверждения диагноза [12] на ранних стадиях заболевания - в первые 2-3 дня [3, 7, 8, 9, 10, 13].
Для стандартизации метода и унификации диагностических исследований предложены два коммерческих набора для определения растворимого легионеллезного антигена в моче методом иммуно-ферментного анализа: Biotest Legionella Urin Antigen EIA; Biotest AG, Германия и Legionella urinary antigen EIA; Binax, Portland, Maine, США [6].
Особый интерес представил анализ литературы по использованию метода латексной агглютинации для выявления легионеллезных антигенов как для идентификации выделенных культур, так и для выявления антигена в клинических образцах и объектах окружающей среды. Эти препараты использовались для идентификации культур [14], обнаружения легионелл в объектах окружающей среды и обнаружения легионелл в клиническом материале (плев -ральном экссудате и мокроте) [5]. Предложены ком-
мерческие латексные иммуноглобулиновые препараты для выявления легионеллезного антигена «Se-robact Legionella», Австралия [4] и «L-CLON Le-gionella» США [11].
Целью настоящих исследований явилось конструирование отечественного иммуноглобулинового полимерного диагностикума для выявления ле-гионеллезного антигена в моче и объектах внешней среды.
Материалы и методы
В работе использовали штамм Legionella pneumophila Philadelphia серогруппы 1, ATCC 15976, типичный по культуральным, морфологическим, серологическим, биохимическим свойствам.
Для культивирования микроорганизмов и накопления бактериальной массы применяли элективную питательную среду (СЭЛ), разработанную в Ростовском НИПЧИ и рекомендованную для практического здравоохранения.
Для конструирования иммуноглобулинового полимерного диагностикума использованы иммунные сыворотки, полученные различными способами: по классической схеме иммунизации, коммерческие производства института им. Н.Ф.Гамалеи, полученные нами модифицированным методом с применением иммуномодулятора Т-активина в процессе иммунизации и с применением способа эмульгирования корпускулярного антигена (бактериальной массы Legionella pneumophila) в полном адъюванте Фрейнда.
В сыворотках определяли титр в стандартной реакции агглютинации и в реакции объемной агломерации с использованием легионеллезного антигенного полимерного диагностикума. Из каждой серии сывороток выделяли иммуноглобулиновую фракцию метанольным методом и определяли концентрацию белка по Лоури.
Полимерные микросферы диаметром (2 ± 0,5) мкмоль/г получали методом анионной по-
лимеризации акрилового альдегида в водно-щелочной среде. Окрашенные частицы получали добавлением красителя в полимеризационную смесь в процессе синтеза. Выход полимерного носителя составил 75 %, содержание альдегидных групп -1,3 ммоль/г.
Лиофилизацию диагностикума осуществляли в
3 % желатозо-сахарозной среде высушивания с предварительным замораживанием в парах азота в течение (10 ± 2) мин. Лиофилизацию проводили в течение (23 ± 1) ч.
Результаты и обсуждение
Характеристики сывороток, использованных для конструирования, сенсибилизирующие дозы и активность экспериментальных серий иммуноглобулиновых препаратов представлены в таблице.
Сыворотка, полученная по классической схеме иммунизации. В препарате иммуноглобулинов, полученных из сыворотки по классическому методу иммунизации, концентрация белка составила 4,54,7 мг/мл. Чувствительность полученного препарата составила S-106 м.к./мл, однако реакция была трехкрестовая, контроли имели вид колечка-пуговки. После лиофилизации препарат существенно терял активность (10s м.к./мл), контроли становились не четкими, время их формирования затягивалось на 3-4 ч.
Коммерческая легионеллезная сыворотка производства им. Н.Ф.Гамалеи. Концентрация белка в препарате иммуноглобулина составила 5,6 мг/мл. Сенсибилизирующие дозы варьировали от 1 до 6 мг/мл. Оптимальную дозу подобрать не удалось. Чувствительность препарата составила 10 м.к./мл, агломерат в лунке был не на всю лунку, контроли с нормальной кроличьей сывороткой не четкие, оседали в виде колечка.
Сыворотка, полученная с использованием для иммунизации эмульгированной бактериальной массы. Концентрация белка в препарате иммуноглобулина варьировала от 5,S до 6,S мг/мл. При использовании фосфатного буфера 0,15 М (рН 7,2) получен препарат при сенсибилизирующей дозе 4,5 мг/мл на 100 мг полимерных сфер. Чувствительность в РАО составила 2-10 м.к./мл. Контроли формировались за 1,5-2 ч. После лиофильного высушивания активность препарата сохранялась.
Сыворотка, полученная при иммунизации с применением иммуномодулятора (Т-активина).
Концентрация белка в препарате иммуноглобулина варьировала от 7,0 до 7,7 мг/мл. При использовании фосфатного буфера 0,15 М (рН 7,2) и сенсибилизирующей дозе 2,4 мг/мл получен препарат, чувствительность которого составила 10 м.к./мл. После лиофильного высушивания препарат активность не терял.
Таким образом, подбор вариантов иммунизации в получении сывороток позволил сконструировать легионеллезный серогруппы 1 иммуноглобулиновый полимерный препарат со стабильными физико-химическими свойствами, высокой чувствительностью и специфичностью, не изменяющимися после лиофилизации и в процессе хранения.
Используя оптимальные параметры, получено три серии легионеллезного серогруппы 1 иммуноглобулинового диагностикума. В РАО диагностикум формировал реакцию и контроли с нормальной кроличьей сывороткой в течение 1,5-2 ч.
Чувствительность препарата при трехкратном воспроизведении составила 106 м.к./мл. Для изучения специфичности использовались микробные взвеси с концентрацией 109 м.к./мл следующих микроорганизмов: Legionella pneumophila серогруп-пы 2-7, Y. pestis штамм EV 1769, Y. pestis штамм EV 231, F. tularensis 117, F. tularensis 126, Y. pseudotuberculosis 715, Y. pseudotuberculosis 719, V. cholerae 177, S. typhimurium 9206, S. typhimurium 1155, S. dy-senteriae 196, S. dysenteriae 657, Y. enterocolitica 5515, E. coli 10393, B. abortus. Со всеми вышеперечисленными культурами иммуноглобулиновый диагностикум давал отрицательные результаты, начиная с концентрации 5-10 м.к./мл.
Чувствительность диагностикума проверена в имитационном опыте с образцами мочи человека в двух вариантах: для определения количества микробных клеток и определения концентрации растворимого легионеллезного антигена.
Для определения количества микробных клеток взвесь Legionella pneumophila серогруппы 1 в конечной концентрации 109 м.к./мл в 5,0 мл мочи титровали до 103 м.к./мл. Затем каждое разведение концентрировали путем центрифугирования при
4 тыс. об/мин в течение 10 мин. Осадок суспендировали в 100 мкл физиологического раствора. Чувствительность д5иагностикума в имитационном опыте составила 10 м.к./мл.
Для определения концентрации антигена в 1,0 мл мочи добавляли растворимый легионеллез-ный антиген до конечной концентрации 2 мг/мл по
Характеристика сывороток, использованных для конструирования, сенсибилизирующие дозы и активность экспериментальных серий иммуноглобулиновых препаратов
Сыворотки, полученные РА РАО Концентрация Сенсибилизи- Активность препарата
белка по Лоури рующая доза жидкого сухого
Классическим способом 1:320-1:640 1:160-1:320 4,5-4,7 мг/мл 0,5-2,0 мг на 100 мг сфер S-106 м.к./мл 108 м.к./мл
Из института им. Н. Ф. Гамалеи 1:160-1:320 1:80-1:160 5,6 мг/мл 6 мг на 100 мг сфер 108 м.к./мл > 108 м.к./мл
С эмульгированным антигеном 1:320-1:640 1:160-1:320 5,8-6,8 мг/мл 4,4 мг на 100 мг сфер 2-106 м.к./мл 2-106 м.к./мл
С применением Т-активина 1:640-1:1280 1:640-1:1280 7-7,7 мг/мл 53 2,8 мг на 100 мг сфер 106 м.к./мл 106 м.к./мл
Калибровочная кривая для количественного определения растворимого легионеллезного антигена в моче
белку (по методу Лоури). Полученный образец титровали по 50 мкл, начиная с разведения 1:40 до 1:2560, и результат определяли в реакции объемной агломерации с полученным диагностикумом. Для количественного определения растворимого легио-неллезного антигена построена калибровочная кривая (рисунок). Диапазон чувствительности составил от 50 до 1 мкг/мл легионеллезного антигена по белку. Предел чувствительности диагностикума составил 2 мкг/мл по белку. Отсекающее значение от неспецифических результатов (cut-off) составил 50 мкг/мл растворимого антигена по белку. Полученные данные свидетельствуют о высокой чувствительности и специфичности иммуноглобулинового полимерного диагностикума.
Диагностикум в лиофильном состоянии сохранял активность при хранении в течение 3 лет (срок наблюдения).
Таким образом, полученный легионеллезный иммуноглобулиновый полимерный диагностикум обладает высокой чувствительностью и специфичностью и предназначен для количественного определения растворимого легионеллезного антигена в моче, объектах внешней среды, а также для идентификации возбудителя при бактериологических исследованиях.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Эпидемиология, профилактика легионеллеза и борьба с ним: меморандум совещания ВОЗ // Бюл. ВОЗ. - 1990. -Т. 68. - № 2. - С. 7-17. - 2. Berdal B.P., Farshy C.E., Feeley J.C. // J. Clin. Microbiol. - 1979. - Vol. 9, N 9. - P. 575578. - 3. Birtles R.J., Harrison T.G., Samuel D., Taylor A.G. // J. Clin. Pathol. - 1990. - Vol. 43, N 8. - P. 685-690. -4. Chen S., Hicks L., Yuen M., Mitchell D. // J. Clin. Microbiol. - 1994. - Vol. 32, N 12. - P. 3054-3055. - 5. Della F., Tort J., Morera M.A., Espaulella J., Armengol J. // Thorax. - 1993. - Vol. 18, N 12. - P. 1227-1229. - 6. Dommgu-ez J.A., GaH N., Pedroso P., Fargas et al. // J. Clin. Microbiol. - 1998. - Vol. 36, N 9. - P. 2718-2722. - 7. Formica N., Yates M., Beers M. et al. // Epidemiol. Infect. - 2001. -Vol. 127, N 2. - P. 275-280. - 8. Helbig J.H., Luck P.C., Witzleb W. // Z. Gesamte. Hyg. - 1989. - Vol. 35, N 10. -P. 591-593. - 9. Kashuba A.D., Ballow C.H. // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. - 1996. - Vol. 24, N 3. - P. 129-139. -10. Kohler R.B. // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. - 1986. -Vol. 4. - P. 47S-59S. - 11. Leland D.S., Kohler R.B. // J. Clin. Microbiol. - 1991. - Vol. 29. - N 10. - P. 2220-2223. -12. Plouffe J.F., File T.M., Breiman R.F. et al. // Clin. Infect. Dis. - 1995. - Vol. 20, N 5. - P. 1286-1291. - 13. Ramirez J.A., Summersgill J.T. // J. Med. Assoc. - 1994. - Vol. 92, N 2. - P. 62-65. - 14. Richardson I.R., Lightfoot N.F. // Med. Lab. Sci. - 1992. - Vol. 49, N 2. - P. 144-146. - 15. Ruf B., Schurmann D., Horbach I. et al // J. Infect. Dis. - 1990. -Vol. 162, N 6. - P. 1341-1348.
G.L.Karbyshev, A.N.Terentiev, L.M.Verkina, A.N.Narkevich, I.R.Simonova, A.P.Kochetkova, L.K.Lyssova
Construction of the Preparations for Legionellosis Serologic Diagnosis. Communication 3. Construction and Experimental Trials of Serogroup 1 Legionellosis Immunoglobulin Polymer Diagnosticum
Rostov-on-Don Anti-Plague Research Institute
Summarized are the results of investigations into constructing a serogroup 1 legionellosis immunoglobulin polymer diagnosticum designated to detect the soluble legionellosis antigen in urinal specimens, various environmental objects as well as to identify microbial cultures isolated from them. The diagnosticum sensitivity was measured to range from 1 to 50 |ig protein /ml with fairly good specificity. The preparation is recommended to diagnose the legionary‘s disease early at the onset.
Key words: legionellosis, diagnostics, immunoglobulin diagnosticum.
Поступила 26.05.05.
УДК 616.988.26
Е.В.Найденова1, И.Н.Шарова\ С.А-Щербакова1, Ю.И.Яшечкин1, Н.В.Хуторецкая2, В.Ф.Ларичев2, К.А.Саркисян3, М.С.Воробьева3, А.М.Бутенко2, А.Н.Куличенко1, Д.К.Львов2, В.В.Кутырев1
ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК ВИРУСА КРЫМСКОЙ-КОНГО ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ МЕТОДОМ ОТ-ПЦР
1Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов;
2НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, 3ГИСК им. Л.А.Тарасевича, Москва
В работе изложены материалы по разработке и апробации тест-системы «Г енКонго» для выявления РНК вируса ККГЛ методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции. Эффективность тест-системы подтверждена при проведении государственных испытаний в ГИСК им. Л.А.Тарасевича.
Ключевые слова: вирус КГГЛ, лабораторная диагностика, ПЦР.
Крымская геморрагическая лихорадка (КГЛ) - общей интоксикацией, наличием выраженного ге-
это острое вирусное природно-очаговое лихора- моррагического синдрома и высокой леталь-
дочное заболевание человека, характеризующееся ностью - от 10 до 50 % (в зависимости от пути пе-
