CC BY
0
Онкоиммунология
© Коллектив авторов, 2024
Есипова Д. Д.1' 2, Муругин В.В.1, Полеткина A.A.1, Пащенков М.В.1, 2, Муругина Н.Е.1
Индукция и механизмы противоопухолевой активности макрофагов человека при сочетанной активации NOD-и Toll-подобных рецепторов
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Лечение злокачественных опухолей - одна из наиболее актуальных задач современной медицины. Перепрограммирование опухоль-ассоциированных макрофагов в противоопухолевые клетки-эффекторы - перспективное направление в иммунотерапии онкологических заболеваний. Сильными индукторами противоопухолевой активности макрофагов являются сигналы от паттерн-распознающих рецепторов (ПРР) врожденного иммунитета. Ранее мы показали, что сочетание агонистов NOD1 и TLR4 эффективно индуцирует активность макрофагов против клеток эритромиелоидного лейкоза K562 [1].
Цель настоящей работы - изучение активности макрофагов человека, стимулированных агонистом рецептора NOD1 в сочетании с агонистами TLR4 и TLR7/8, против клеток диссеминированных и солидных опухолей, а также анализ механизмов противоопухолевой активности макрофагов.
Материал и методы. В качестве мишеней для макрофагов использовали клетки эри-тромиелоидной линии К562, клетки человеческой эпителиоидной карциномы шейки матки линии HeLa и клетки человеческой колорекгальной карциномы линии HT29, несущие ген зеленого флуоресцентного белка (GFP). Клетки опухоли инкубировали совместно с макрофагами в присутствии агонистов NOD1, TLR4, TLR7/8 раздельно и в сочетании. В качестве контроля выступали опухолевые клетки без макрофагов. Для анализа антипролиферативных свойств макрофагов проводили анализ клеточного цикла опухолевых клеток с помощью проточной цитометрии. Количество погибших клеток определяли с помощью окрашивания аннексином-V и пропидий-иодидом. Экспрессию мРНК TNF в макрофагах оценивали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с обратной транскрипцией.
Результаты. Сочетания агонистов NOD1+TLR4 и NOD1+TLR7/8 эффективно индуцировали активность макрофагов против клеток K562, HeLa и HT29. Активность сочетаний агонистов во всех случаях была выше, чем активность отдельно взятых агонистов. Макрофаги, активированные сочетанием агонистов NOD1+TLR4, тормозили пролиферацию опухолевых клеток K562 и усиливали их гибель.
Обсуждение содержит анализ полученных данных и оценку применимости предложенных моделей репрограммирования макрофагов в отношении различных опухолевых клеточных линий.
Заключение. Сочетания агонистов NOD- и Toll-подобных рецепторов эффективно индуцируют активность макрофагов против опухолевых клеточных линий, полученных из диссеминированных и солидных опухолей.
Ключевые слова: макрофаги; противоопухолевый иммунитет; клетки K562; клетки HeLa; клетки HT29; пат-терн-распознающие рецепторы; NOD; TLR4; TLR7/8; фактор некроза опухолей; апоптоз; пролиферация; клеточный цикл
Статья получена 01.07.2024. Принята в печать 03.08.2024.
Для цитирования: Есипова Д.Д., Муругин В.В., Полеткина A.A., Пащенков М.В., Муругина Н.Е. Индукция и механизмы противоопухолевой активности макрофагов человека при сочетанной активации NOD- и Toll-подоб-ных рецепторов. Иммунология. 2024; 45 (4): 486-494. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-4-486-494
Для корреспонденции
Муругина Нина Евгеньевна -кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-7000-5729
Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 21-15-00211.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Муругина Н.Е., Пащенков М.В.; сбор и обработка материала - Есипова Д.Д., Муругин В.В., Полеткина A.A.; статистическая обработка - Есипова Д.Д.; написание текста - Есипова Д.Д., Муругина Н.Е.; редактирование - Пащенков М.В.
Esipova D.D.1, 2, Murugin V.V.1, Poletkina A.A.1, Pashenkov M.V.1 2, Murugina N.E.1
Induction and mechanisms of antitumor activity of human macrophages upon combined activation of NOD- and Toll-like receptors
1 National Research Center Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation
2 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Ministry of Health of the Russian Federation, 117997, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. The treatment of malignant tumors is one of the most urgent tasks of modern medicine. Reprogramming of tumor-associated macrophages into antitumor effector cells is a promising direction in immunotherapy of cancer. Strong inducers of the antitumor activity of macrophages are signals from the pattern-recognition receptors (PRR) of innate immunity. Previously, we showed that the combination of NOD1 and TLR4 agonists effectively induces macrophage activity against erythromyeloid leukemia cells K562 [1].
The aim of the work was to study activity of human macrophages stimulated by a NOD1 agonist in combination with a TLR4 or a TLR7/8 agonist against cell lines derived from disseminated and solid tumors, as well as to analyze the mechanisms of antitumor activity of reprogrammed macrophages.
Material and methods. Erythromyeloid K562 cells, human epithelioid cervical carcinoma HeLa cells and human colorectal carcinoma HT29 cells carrying green fluorescent protein (GFP) gene were used as targets for macrophages. Tumor cells were coincubated with macrophages in the presence of NOD1, TLR4, TLR7/8 agonists separately and in combination. Tumor cells without macrophages were used as controls. To analyze the antiproliferative properties of macrophages, the cell cycle of tumor cells was analyzed using flow cytometry. The number of dead cells was determined by staining with annexin-V and propidium iodide. TNF mRNA expression in macrophages was evaluated by real-time reverse transcript PCR.
Results. Combinations of NOD1+TLR4 and NOD1+TLR7/8 agonists effectively induced macrophage activity against K562, HeLa and HT29 cells. The activity of agonist combinations in all cases was higher than the activity of individual agonists. Macrophages activated by a combination of NOD1+TLR4 agonists inhibited the proliferation of K562 tumor cells and enhanced their death.
Discussion contains an analysis of the data obtained and an assessment of the applicability of the proposed models of reprogramming macrophages in relation to various cell lines.
Conclusion. Combinations of NOD- and Toll-like receptor agonists effectively induce macrophage activity against tumor cell lines derived from disseminated and solid tumors.
Keywords: macrophages; antitumor immunity; K562 cells; HeLa cells; HT29 cells; pattern-recognition receptors; NOD1; TLR4; TLR7/8; tumor necrosis factor; apoptosis; proliferation; cell cycle
Received 01.07.2024. Accepted 03.08.2024.
For citation: Esipova D.D., Murugin V.V, Poletkina A.A, Pashenkov M.V, Murugina N.E. Induction and mechanisms of antitumor activity of human macrophages with combined activation of NOD- and Toll-like receptors. Immunologiya. 2024; 45 (4): 486-94. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-4-486-494 (in Russian)
Funding. The study was supported by the grant of Russian Science Foundation No. 21-15-00211.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Concept and design of the study - Murugina N.E., Pashchenkov M.V.; collection and processing of material - Esipova D.D., Murugin V.V., Poletkina A.A.; statistical processing - Esipova D.D.; writing the text - Esipova D.D., Murugina N.E.; editing - Pashchenkov M.V.
For correspondence
Nina E. Murugina -PhD, Senior Researcher of the Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-7000-5729
Введение
Опухоль-ассоциированные макрофаги (ОАМ) - один из основных компонентов стромы злокачественных опухолей, они могут оказывать разнонаправленное действие на опухолевую прогрессию. Известно, что макрофаги обладают выраженной пластичностью и в зависимости от микроокружения могут дифференцироваться в альтернативно активированные проопухолевые (М2) или в классически активированные противоопухолевые (М1) макрофаги. По умолчанию ОАМ имеют свойства М2-макрофагов, вырабатывают цитокины и ростовые факторы, способствующие росту, инвазии и метаста-зированию опухолевых клеток. Клинико-патологиче-ские исследования показали, что накопление М2-макро-фагами в опухолях коррелирует с неблагоприятным клиническим исходом [2]. Так, по данным C. Medrek и соавт., инфильтрация опухоли молочной железы М2-макрофа-гами обусловливает более высокий индекс пролиферации и в связи с этим более высокую степень злокачественности [3]. В то же время опухоли, имеющие в своем составе ОАМ, лучше реагируют на химиотерапевтичес-кие препараты благодаря фенотипическому и функциональному перепрограммированию макрофагов в сторону противоопухолевого (М1) фенотипа [4]. Таким образом, функциональное состояние ОАМ может оказывать существенное влияние на клинический исход онкологического заболевания.
Макрофаги реализуют свою противоопухолевую активность посредством многих механизмов. S. Kalish и соавт. дифференцировали М1-подобную популяцию макрофагов (названную ими М3-макрофагами), используя индукторы М1-перепрограммирования в сочетании с ингибированием факторов транскрипции, отвечающих за формирование М2-фенотипа. Противоопухолевый эффект М3-макрофагов был обусловлен их анти-пролиферативным действием [5]. Активированные макрофаги также могут индуцировать апоптоз опухолевых клеток в культуре [6].
Ранее мы показали, что активация макрофагов путем сочетанной стимуляции ПРР TLR4 и NOD1 вызывает мощное транскрипционное и метаболическое перепрограммирование макрофагов, а также индуцирует их противоопухолевую активность [1, 7]. Такие макрофаги не обладают всеми характеристиками М1-макрофагов (в частности, они не вырабатывают интерлейкин-12), но эффективно замедляют рост клеток эритромиелоидного лейкоза K562 in vitro. В настоящей работе представлены расширенные данные о противоопухолевой активности макрофагов, активированных сочетаниями агонистов NOD- и Toll-подобных рецепторов, в том числе установлены отдельные механизмы противоопухолевой активности.
Материал и методы
Реактивы. Синтетические агонисты рецепторов NOD 1 (лауроил-Э-изоглутамил-мезо-диаминопимели-новая кислота или C12-iE-DAP]) и TLR7/8 (резикви-мод или R848), а также природный агонист TLR4 -
ультрачистый ЛПС, полученный из E. coli O111 :B4, были закуплены у фирмы InvivoGen (США); рекомбинантный человеческий гранулоцитарно-макрофагальный коло-ниестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) - у Sci-Store (Россия); лентивирусные частицы LVT-TagGFP2 -у фирмы «Евроген» (Россия); набор для определения апоптоза Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit A211 - у Vazyme (КНР); пропидий-йодид (PI) - у фирмы Sigma (США); РНКаза А - у Thermo Scientific (США); набор для иммуноферментного определения фактора некроза опухоли (ФНО) Альфа-ФНО-ИФА-БЕСТ -у фирмы Вектор-Бест (Россия). Полная культураль-ная среда (ПКС) представляла собой RPMI-1640 (Life Technologies, Великобритания) или DMEM (ПанЭко, Россия) (для суспензионных и адгезионных культур соответственно) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Life Technologies) и 10 % фетальной телячьей сыворотки (BioWest, США).
Опухолевые клеточные линии. В качестве мишеней для макрофагов использовали клетки человеческого эритромиелоидного лейкоза линии К562, человеческой эпителиоидной карциномы шейки матки линии HeLa и человеческой колорекгальной карциномы линии HT29, несущие ген зеленого флуоресцентного белка (GFP). GFP-экспрессирующие опухолевые клетки были получены путем трансдукции лентиви-русом LVT-TagGFP2 с последующей проточной сортировкой GFP+-KneTOK. В отдельных опытах использовали нативные опухолевые GFP--KneTKH. Клетки K562 вели на среде RPMI-1640 (Life Technologies) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Life Technologies) и 10 % фетальной телячьей сыворотки (Thermo Fisher, США), клетки HeLa и HT29 - на DMEM («ПанЭко», Россия) с теми же добавками. Клетки пассировали каждые 2-3 сут. Для опыта использовали клетки на 2-е сутки после пересева.
Культивирование макрофагов. Каждый эксперимент повторяли на культурах макрофагов, полученных не менее чем от 3 различных доноров. Венозную кровь получали от здоровых доноров обоих полов в возрасте 20-60 лет. Макрофаги получали путем культивирования моноцитов крови с ГМ-КСФ в течение 6 сут, как было описано ранее [1]. Забор крови одобрен локальным этическим комитетом ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России (протокол № 10/2017).
Оценка противоопухолевых свойств макрофагов. Макрофаги трипсинизировали, подсчитывали и помещали в 24-луночные планшеты в количестве 2 • 105 клеток на лунку в полной культуральной среде (ПКС, состав аналогичен среде для клеток K562). Через 24 ч инкубации ПКС полностью отбирали и заменяли на свежую. Далее к макрофагам добавляли: C12-iE-DAP (конечная концентрация - 1 мкг/мл), ЛПС (конечная концентрация - 10 нг/мл), R848 (конечная концентрация -1 мкг/мл и 5 мкг/мкл), раздельно и в сочетаниях, либо равный объем ПКС. Сразу после внесения агонистов в лунки вносили опухолевые GFP+-KneTKH в количестве 4 • 103 на лунку (в дальнейшем макрофаги названы эффекторы, опухолевые клетки - мишени, соотношение
Я §
х ^
э
Sc
К Щ Л 1С
200 -| 175 -150 -125 -1007550250-
&
&
!
150 п
125 -
100 -
75-
50-
25-
HeLa Без ЛПС агонистов
С12 С12 + ЛПС
Y
HeLa + Макрофаги
£
HT29 Без ЛПС С12 С12 + ЛПС агонистов
Э
200 п
175-
150-
£ 125-
е
ио
Ч X?
¡3^
100 -
75-
50-
25-
Без ЛПС агонистов
С12 С12 + ЛПС
150 п
125-
T H к
100 Н
75-
8* 50 Н
^ н & °
Ч х= О
¿3
25 А
Без ЛПС агонистов
С12 С12 + ЛПС
Y
HT29 + Макрофаги
Рис. 1. Противоопухолевая активность макрофагов, активированных агонистами NOD1, TLR4 и их сочетанием А и В — количество живых клеток HeLa (А) и HT29 (В) после сокультивирования с макрофагами в течение 72 ч без агонистов и в присутствии агонистов и их сочетания; Б и Г — количество живых клеток HeLa (Б) и HT29 (Г) после 72 ч культивирования с C12-iE-DAP, ЛПС и их сочетанием без макрофагов. Количество живых клеток HeLa или HT29 выражено в процентах по отношению к их числу в культурах без макрофагов и без агонистов, принятому за 100 % (контроль). Число экспериментов n = 3 (A, Г) и n = 4 (Б, В); ** — p < 0,01; C12 — C12-iE-DAP (агонист NOD1); ЛПС — липополисахарид (агонист TLR4).
**
0
**
0
0
эффектор : мишень = 50 : 1). Суммарный объем среды в лунках составлял 400 мкл. Контролем служили опухолевые ОГР+-клетки без макрофагов. Планшеты инкубировали в течение 72 ч в С02-инкубаторе (37 °С, 5 % С02), после чего оценивали количество живых опухолевых клеток методом проточной цитометрии. Для этого клетки ресуспендировали в имеющемся объеме супер-натанта и переносили в цитометрические пробирки. К оставшимся клеткам добавляли трипсин, инкубировали в течение 30 мин в С02-инкубаторе, ресуспендировали и переносили в цитометрические пробирки. Во все пробы вносили Р1 (конечная концентрация - 1
мкг/мл). Пробы записывали на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciences, США) в течение 120 с на высокой скорости, что соответствует 30 % объема пробы (400 мкл). Постоянство скорости потока контролировали с помощью частиц Flow-Check™ (Beckman Coulter, США). Живые опухолевые клетки определяли как GFP+PP-события. Пробы с неприлипшими и прилипшими клетками из каждой лунки записывали раздельно, число живых опухолевых клеток в обеих пробах суммировали. Результаты выражали в процентах по отношению к численности живых опухолевых клеток в культурах без макрофагов в том же эксперименте.
2500 П 22502000-
а
8 1750-&
! 1500 -
m
§ 1250-
II 1000-
§
а 750-
н О
5002500-
Неактивированные макрофаги
С12
ЛПС
R848
C12+ C12+ ЛПС R848
Рис. 2. Экспрессия мРНК TNF в макрофагах, активированных агонистами NOD1, TLR4, TLR7/8 и их сочетаниями в течение 4 ч
С12 — C12-iE-DAP (агонист NOD1); R848 — резиквимод (аго-нист TLR7/8), n = 4; * - p < 0,05; ** - p < 0,01.
Исследование клеточного цикла опухолевых
клеток. Во избежание утечки GFP при обработке клеток этанолом, клетки вначале фиксировали 1 % пара-формальдегидом (5 мин, 4 °C). Далее пермеабилизиро-вали мембраны 70 % этанолом (30 мин, на льду), после чего клетки окрашивали PI (1 мкг/мл) в присутствии РНКазы А (0,2 мг/мл) (15 мин при комнатной температуре). Процент GFP+-KtferoK, находящихся в Gj/M-фазе клеточного цикла, оценивали на проточном цитометре FACSCalibur.
Оценка клеточной гибели. Чтобы предотвратить поглощение погибших клеток макрофагами, использовали 24-луночные трансвелл-планшеты с полупроницаемыми мембранами (диаметр пор - 8 мкм, BD Biosciences, США). Макрофаги (2 • 105), а также агонисты NOD1 и TLR4 помещали в нижние камеры планшетов, клетки К562 (4 • 103) - в верхние. Клетки K562 в данном эксперименте не несли GFP. Через 72 ч собирали клетки из верхних камер и окрашивали их PI и аннексином-V-FITC в соответствии с инструкцией к набору Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit A211 (Vazyme, КНР). Оценивали процентное содержание опухолевых клеток, окрашивающихся аннексином-V и/или PI.
Исследование экспрессии генов с помощью поли-меразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипцией. Экспрессию гена TNF в макрофагах, стимулированных C12-iE-DAP, ЛПС, R848 раздельно и в сочетаниях анализировали с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени, как описано ранее [8].
Анализ данных. Данные проточной цитометрии обрабатывали в программе FlowJo™ v10 (FlowJo™ Software, США). Для статистического анализа использовали программу GraphPad Prism 6 (GraphPad Software,
США). Для множественных сравнений использовали непараметрический тест Фридмана с коррекцией Данна. Данные каждого эксперимента на графике представлены отдельными точками. «Усы» - 25-75-й про-центили, линия внутри - медиана.
-р Результаты
Противоопухолевый ответ макрофагов человека, активированных агонистами NOD1 и TLR4, в отношении клеток HeLa и HT29
Ранее в наших исследованиях было показано, что сокультивирование макрофагов человека (эффекторов) с опухолевыми клетками К562 (мишенями) стимулирует рост последних, тогда как активация макрофагов агонистами NOD1 и TLR4 по отдельности отменяет проопухолевый эффект, а активация сочетанием этих агонистов приводит к 3-кратному снижению количества живых опухолевых клеток [1]. Чтобы оценить применимость полученных данных для других клеточных линий, нами был оценен противоопухолевый эффект макрофагов в отношении адгезионных клеточных линий, полученных из солидных злокачественных опухолей: карциномы шейки матки HeLa и колорекгальной карциномы HT29. Использовали те же экспериментальные условия, что и в работе Н.Е. Муругиной и соавт. [1].
При сокультивировании клеток HeLa и HT29 с макрофагами в течение 72 ч как без агонистов, так и в присутствии отдельно взятых агонистов NOD1 или TLR4, наблюдалась тенденция к снижению количества живых опухолевых клеток в культуре (рис. 1А, B). Активация макрофагов сочетанием агонистов NOD1 и TLR4 приводила к достоверному снижению численности клеток HeLa и HT29 по сравнению с контролем [медиана 25 % от контроля для HeLa (см. рис. 1А) и 18,3 % от контроля для HT29 (см. рис. 1В)]. Добавление агонистов NOD1 и TLR4 в чистые культуры опухолевых клеток, не содержащие макрофагов, не оказывало достоверного влияния на количество живых опухолевых клеток при оценке спустя 72 ч (рис. 1Б, Г). Таким образом, сочетание агонистов NOD1 и TLR4 индуцировало выраженную противоопухолевую активность макрофагов по отношению к клеточным линиям, полученным из солидных злокачественных опухолей.
Противоопухолевый ответ макрофагов человека, активированных агонистами рецепторов NOD1 и TLR7/8, в отношении клеточных линий K562, HeLa и HT29
Исходя из логики работы системы врожденного иммунитета, можно предположить, что эффекты агонистов NOD1 и TLR4 не специфичны для этих рецепторов. В связи с этим исследовали противоопухолевую активность макрофагов, активированных агонистом NOD1 в сочетании с агонистом рецепторов TLR7 и TLR8 (R848). Ранее мы показали, что одним из медиаторов противоопухолевого ответа макрофагов против клеток К562 является ФНО [1]. Сочетание агонистов NOD1+TLR7/8 вызывало более выраженную экспрес-
**
а
э
250 п 225200-
2
■f 175-
Й &
150-
125-
% £
S £ 100 4
75-
50-
25-
Тт
э
250 225
S-г 200
* S3
и g 175
2 я
S3 S
§ я 150
a .ji
а з 125
100
75
50
25
BR
+
oR
+
oR
+
oR
+
э
200 п
175-
^ = и ¡а
Э
Е-
и
150-
125-
100-
% е
75-
50-
25-
150 п
125-
100-
q га
¡3
S &
75-
50-
25-
Y
K562 + Макрофаги
t *
HeLa Без С12 V агонистов
Y
HeLa + Макрофаги
R848 С12+
R848 j
* ft
ix
HT29 Без С12 агонистов
R848
С12 + R848
Y
HT29 + Макрофаги
200
175
150
125
100
75
50
25
э
К к
Без С12 агонистов
R848 С12+ R848
150
125
Е-
H
2 я 100
75
& 50
25
Без С12 агонистов
R848 С12+ R848
Рис. 3. Противоопухолевая активность макрофагов, активированных агонистами NOD1, TLR7/8 и их сочетанием А, В и Д — количество живых клеток К562 (A), HeLa (В) и HT29 (Д) после сокультивирования с макрофагами в течение 72 ч без агонистов и в присутствии агонистов. Б, Г и Е — количество живых клеток К562 (Б), HeLa (Г) и HT29 (Е) после 72 ч культивирования с агонистами без макрофагов. Число живых клеток K562, HeLa и HT29 после культивирования без макрофагов и без агонистов принято за 100 % (контроль). Число экспериментов n = 7 (A), n = 3 (Б, Г) и n = 4 (В, Д, Е); * — p < 0,05, ** — p < 0,01, *** - p < 0,001. С12- C12-iE-DAP (агонист NOD1); R848-резиквимод (агонист TLR7/8).
а
0
0
а
0
0
0
0
сию мРНК TNF, чем сочетание NOD1+TLR4 (рис. 2); можно ожидать, что сочетание агонистов NOD1+TLR7/8 является не менее мощным стимулятором противоопухолевой активности макрофагов.
При сокультивировании клеток К562 с макрофагами в присутствии агониста TLR7/8 наблюдали тенденцию к снижению количества опухолевых клеток при концентрации R848, равной 1 мкг/мл (рис. 3А). При концентрации R848, равной 5 мкг/мл, обнаружено достоверное снижение количества опухолевых клеток (медиана 44 % от контроля, p < 0,01) (см. рис. 3А). Комбинация агонистов NOD1 и TLR7/8 при любой из двух концентраций R848 вызвала достоверное уменьшение количества опухолевых клеток [для сочетания C12-iE-DAP+R848 (1 мкг/мл): медиана 33 % от контроля, p < 0,01; для сочетания C12-iE-DAP+R848 (5 мкг/мл): медиана 22 % от контроля, p < 0,0001; см. рис. 3А]. Эти результаты сопоставимы или превосходят таковые, полученные при использовании сочетания C12-iE-DAP+.nnC (медиана 33 % от контроля [1]). Добавление агонистов NOD1 и TLR7/8 в культуры клеток K562, не содержащие макрофагов, не оказывало достоверного влияния на количество живых опухолевых клеток (рис. 3Б).
Для экспериментов с клетками HeLa и HT29 была выбрана концентрация агониста TLR7/8, равная 5 мкг/мл, так как она обусловливала больший противоопухолевый эффект. При сокультивировании клеток HeLa с макрофагами в присутствии агониста TLR7/8 наблюдали тенденцию к снижению количества опухолевых клеток, в то время как в присутствии комбинации агонистов NOD1 и TLR7/8 наблюдалось достоверное уменьшение количества опухолевых клеток (рис. 3В, медиана 37 % от контроля, p < 0,05). При сокультивировании клеток HT29 с макрофагами в присутствии как отдельно взятого агониста TLR7/8, так и сочетания агонистов NOD1 и TLR7/8, наблюдали достоверное снижение числа опухолевых клеток (рис. 3Д, медиана соответственно 18 и 17 % от контроля, p < 0,05 для обоих сравнений). Активность комбинации агонистов NOD1+TLR7/8 в отношении клеток HeLa и HT29 в целом сопоставима с активностью комбинации NOD1+TLR4 (см. рис. 1, 3). Как и в случае с клетками K562, инкубация опухолевых клеток HeLa и HT29 с C12-iE-DAP, R848 и их сочетанием в течение 72 ч не влияла на численность клеток (рис. 3Г, Е).
Эти данные показывают, что сочетанная активация рецепторов NOD1 и TLR7/8, как и сочетанная активация NOD1 и TLR4, индуцирует противоопухолевую активность макрофагов в отношении клеток диссеминированных (К562) и солидных (HeLa, HT29) опухолей.
Макрофаги, активированные сочетанием агонистов NOD1 и TLR4, оказывают антипролиферативное действие на клетки K562
Антипролиферативное действие является одним из механизмов противоопухолевой активности макрофагов, в связи с чем нами был исследован вклад данного механизма на модели макрофагов, активированных аго-
нистами рецепторов NOD1 и TLR4. Был исследован клеточный цикл клеток К562 после их сокультивирова-ния с макрофагами в течение 72 ч в присутствии агонистов NOD1 и TLR4 раздельно и в сочетании (рис. 4А). При сокультивировании клеток К562 с макрофагами без агонистов не выявлено достоверного изменения количества клеток в фазе G2/M. При добавлении агонистов NOD1 и TLR4 по отдельности была выявлена тенденция к снижению количества делящихся клеток, в то время как сочетанная стимуляция агонистами способствовала достоверному снижению количества клеток, находящихся в фазе G2/M (медиана 22,7 против 37,5 % для культуры К562 без макрофагов, p < 0,05). Таким образом, макрофаги, активированные сочетанием агонистов рецепторов NOD1 и TLR4, ингибируют пролиферацию клеток К562.
Макрофаги, активированные сочетанием агонистов NOD1 и TLR4, вызывают накопление Annexm-V+Pr-клеток в культуре клеток K562
Гибель клеток К562 в присутствии макрофагов, активированных сочетанием C12-1E-DAP и ЛПС, оценивали путем окрашивания FITC-меченным аннексином-V и пропидий-иодидом. Поскольку аннексин-V был помечен FITC, использование GFP-трансгенных клеток К562 не представлялось возможным, так как FITC и GFP обладают схожими спектрами эмиссии. Поэтому использовали клетки К562, не меченные GFP, а для разделения опухолевых клеток и макрофагов применяли трансвелл-планшеты с полупроницаемыми мембранами. Использование трансвелл-планшетов позволило избежать фагоцитоза погибших клеток К562 макрофагами. Макрофаги активировали сочетанием агонистов рецепторов NOD1 и TLR4, поскольку для данного сочетания ранее был продемонстрирован достоверный противоопухолевый [1] и антипролиферативный эффект (см. рис. 4А). При культивировании клеток K562 с неактивированными макрофагами число погибших опухолевых клеток (aHHeKCHH-V+PI+) не отличалось от такового в контроле, однако при активации макрофагов сочетанием агонистов это число возрастало в 3,3 раза (p < 0,05, рис. 4Б). Накопления клеток, окрашивающихся только PI или только аннексином-V, не отмечено. Вид гибели опухолевых клеток (апоптоз, некроз, некроптоз и т.д.) нуждается в дальнейшем уточнении, поскольку клетки с двойным окрашиванием aHHeKCHH-V+PI+ возникают на конечном этапе различных видов клеточной гибели.
Обсуждение
Перспективное направление в лечении онкологических заболеваний - активация собственных иммунных резервов организма и воздействие на опухолевое микроокружение, которое включает клетки врожденного и адаптивного иммунитета, способные бороться с опухолью. В частности, перспективной точкой приложения имму-нотерапевтических препаратов являются ОАМ как самая многочисленная популяция клеток врожденного имму-
э
50 -,
аее ■^Зю 40-\ ¿ю о ™ ^
О .
30-
m «
к
и £ 20 H
10-
К562 Без ЛПC агонистов
C12 C12 + ЛПC
Y
К562 + Макрофаги
о
1000 п
) 900800700600500400300200100-
4
К562 Без C12 + ЛШ
агонистов
V____J
У
К562 + Макрофаги
Рис. 4. Механизмы противоопухолевой активности макрофагов при активации агонистами N001 и ТЬК4
А — процентное содержание опухолевых клеток, находящихся в 02/Ы-фазе клеточного цикла, среди всех опухолевых клеток в пробе; Б — количество погибших клеток К562 после сокультивирования с макрофагами без агонистов и с агонистами МОР1+ТЬЯ4. * — р < 0,05. С12 — С12-1Е-ОАР (агонист МОР1); ЛПС — липополисахарид (агонист ТЬК4).
а
0
0
нитета в ткани опухоли. Макрофаги обладают выраженной пластичностью и в зависимости от микроокружения могут приобретать как про-, так и противоопухолевую активность. Перспективными индукторами противоопухолевой активности макрофагов являются агонисты ПРР и их синергически взаимодействующие комбинации.
Ранее мы показали, что сочетание агонистов ПРР NOD1 и TLR4 эффективно индуцирует противоопухолевую активность макрофагов человека против клеток эритромиелоидного лейкоза K562 in vitro [1]. В настоящем исследовании установлено, что макрофаги, стимулированные этим сочетанием агонистов, обладают активностью и против клеточных линий, полученных из солидных опухолей (см. рис. 1). Кроме того, продемонстрирована сопоставимая противоопухолевая активность макрофагов, обработанных сочетанием агонистов NOD1 и TLR7/8 (см. рис. 3). Эти данные позволяют предположить, что сочетанная стимуляция различных NOD- и Toll-подобных рецепторов индуцирует универсальные эффекгорные механизмы макрофагов, направленные на борьбу со злокачественными опухолями. К числу таких механизмов могут относиться ингибирование пролиферации и индукция гибели клеток опухоли (см. рис. 4).
■ Литература/References
1. Муругина Н.Е., Муругнн В.В., Пащенков М.В. Противоопухолевая активность макрофагов человека, активированных агонистами рецепторов NOD1 и TLR4 in vitro. Иммунология. 2022; 43 (5): 548-57. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-548-557 [Murugina N.E., Murugin V.V., Pashchenkov M.V. Antitumor activity of macrophages activated by NOD1 and TLR4 receptor agonists in vitro. Immunologiya. 2022; 43 (5): 548-57. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-548-557 (in Russian)]
2. Choi J., Gyamfi J., Jang H., Koo J.S. The role of tumor-associated macrophage in breast cancer biology. Histol Histopathol. 2018; 33 (2): 133-45. DOI: https://doi.org/10.14670/HH-11-916
Приобретение опухолевыми клетками резистентности к противоопухолевым препаратам, в том числе тар-гетным, - серьезная проблема в онкологии. Один из подходов к ее решению - поиск новых способов воздействия на опухоль, базирующихся на различных биологических принципах. Предложенный нами способ индукции противоопухолевой активности макрофагов, основанный на использовании синергически взаимодействующих комбинаций NOD- и ТЫ1-подобных рецепторов, может быть хорошим дополнением к существующим методам лечения злокачественных опухолей и заслуживает дальнейшего изучения в экспериментах in vivo.
Выводы
1. Макрофаги, активированные сочетанием агонистов рецепторов NOD1 и TLR4, подавляют рост клеток HeLa и HT29 in vitro.
2. Сочетания агонистов NOD1+TLR4 и NOD1 + TLR7/8 индуцируют схожую противоопухолевую активность макрофагов.
3. Макрофаги, активированные сочетанием агонистов NOD1 и TLR4, реализуют противоопухолевое действие против клеток К562 путем ингибирования их пролиферации и индукции клеточной гибели.
3. Medrek C., Ponten F., Jirstrom K., Leandersson K. The presence of tumor associated macrophages in tumor stroma as a prognostic marker for breast cancer patients. BMC Cancer. 2012; 12: 306. DOI: https://doi. org/10.1186/1471-2407-12-306
4. Rebelo S.P., Pinto C., Martins T.R., Harrer N., Estrada M.F., Loza-Alvarez P., Cabejadas J., Alves P.M., Gualda E.J. Sommergruber W., Brito C. 3D-3-culture: A tool to unveil macrophage plasticity in the tumour microenvironment. Biomaterials. 2018; 163: 185-97. DOI: https://doi. org/10.1016/j.biomaterials.2018.02.030
5. Kalish S., Lyamina S., Manukhina E., Malyshev Y., Raets-kaya A., Malyshev I. M3 Macrophages Stop Division of Tumor Cells
In Vitro and Extend Survival of Mice with Ehrlich Ascites Carcinoma. Med Sci Monit Basic Res. 2017; 23: 8-19. DOI: https://doi. org/10.12659/msmbr.902285
6. Weigert A., Tzieply N., Knethen A. Von, Johann A.M., Schmidt H., Geisslinger G., Brüne B. Tumor cell apoptosis polarizes macrophages role of sphingosine-1-phosphate. Mol Biol Cell. 2007; 18 (10): 3810-19. DOI: https://doi.org/10.1091/mbc.e06-12-1096
7. Budikhina A.S., Murugina N.E., Maximchik P.V., Dagil Y.A., Niko-laeva A.M., Balyasova L.S., Murugin V.V., Selezneva E.M., Pashchen-
Сведения об авторах
Есипова Дарья Дмитриевна - лаборант лаб. клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; студент VI курса ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0009-0006-0807-2529
Муругин Владимир Владимирович - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-1011-2554
Полеткина Анастасия Андреевна - лаборант лаб. клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-5583-5414
Пащенков Михаил Владимирович - д-р мед. наук, зав. лаб. клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; проф. кафедры иммунологии МВФ ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6995-1790
Муругина Нина Евгеньевна - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-7000-5729
kova Y. G., Chkadua G.Z., Pinegin B.V., Pashenkov M.V. Interplay between NOD1 and TLR4 Receptors in Macrophages: Nonsynergistic Activation of Signaling Pathways Results in Synergistic Induction of Proinflammatory Gene Expression. J Immunol. 2021; 206 (9): 2206-20. DOI: https://doi. org/10.4049/jimmunol.2000692
8. Pashenkov M.V., Balyasova L.S., Dagil Y.A., Pinegin B.V. The Role of the p38-MNK-eIF4E Signaling Axis in TNF Production Downstream of the NOD1 Receptor. J Immunol. 2017; 198 (4): 1638-48. DOI: https://doi. org/10.4049/JIMMUN0L.1600467
Authors' information
Daria D. Esipova - Lab. Technician of the Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Student of the 6th year, N.I. Pirogov RNRMU of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0009-0006-0807-2529
Vladimir V. Murugin - PhD, Senior Researcher of the Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-1011-2554
Anastasia A. Poletkina - Lab. Technician of the Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-5583-5414
Mikhail V. Pashenkov - MD, PhD, Head of the Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Prof. of the Immunology Chair, Medical-Biological Faculty, N.I. Pirogov RNRMU of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6995-1790
Nina E. Murugina - PhD, Senior Researcher of the Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-7000-5729
