CC BY
0
При л о ж ен и е 1
Селиванова Д. С., Пшеничникова О. С., Щемелева Е. Ю., Абрамова Т. В., Яковлева Е. В., Зозуля Н. И., Сурин В. Л. МУТАЦИОННЫЙ СПЕКТР ГЕНА ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ VIIУ РОССИЙСКИХ ПАЦИЕНТОВ
ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России
Введение. Фактор свертывания крови VII (РУН, проконвер-тин) относится к группе витамин К зависимых факторов свертывания крови. Это один из белков, запускающих процесс гемокоагуля-ции при повреждении стенки кровеносного сосуда. Концентрация проконвертина в плазме зависит от различных параметров. Одной из причин снижения активности РУН является наследственный дефицит фактора свертывания крови VII (М1М #227500) — редкое аутосомно-рецессивное наследственное заболевание, которое обусловлено патогенными вариантами гена ¥7.
Цель работы. Целью данного исследования было описать спектр мутаций гена Р7 и взаимосвязь генотипа и лабораторного фенотипа у пациентов с дефицитом РУН.
Материалы и методы. В исследование были включены 55 неродственных пациентов (12 мужчин и 43 женщины) с дефицитом РУН. Анализ первичной структуры гена Р7 был выполнен методом секвенирования по Сэнгеру.
Результаты и обсуждение. Патогенные варианты в гене ^7были обнаружены у 38 (69,1%) из 55 пациентов. Мы идентифицировали 24 разные мутации. Из них 15 нарушений были встречены однократно, семь патогенных вариантов обнаружены дважды и одна мутация определена в четырех случаях. Преобладающей мутацией в российской популяции была микроделеция с.1391^е1С (р. Рго464Н18£8''"32). Она обнаружена у 22 пациентов (40%, N=55), в 29 аллелях (46%, N=63). Анализ показал, что данное нарушение сцеплено с функциональными полиморфизмами гэ36209567 и гэ6046, они наследуются единым гаплотипом. Пять
патогенных вариантов ранее не были описаны в международных базах данных. Одним из них была мутация сплайсинга с.347-Ю>А, четыре другие представляли собой миссенс-мута-ции, р.01у22Азр, р.Суз2388ег,
р.11е243ТЬг и р.Туг392Суэ. Алгоритмы прогнозирования патогенности оценили все новые
Домены белка FVII
CÍ1 Про пептид
(Сигнальный пептид)
Структура гена F7
1 2
□ □
rs510335 rs5742910 rs56l241
варианты как вероятно патогенные. Обнаруженные дефекты были отмечены во всех функционально значимых частях гена, но главным образом локализованы в самом протяженном домене белка РУЛ — сериновой протеазе. У большинства исследованных пациентов генетические нарушения соответствовали показателям активности РУН: 25 пациентов являлись гомозиготными носителями мутаций или компаундами (активность РУН 0,1—10%). Из 13 гетерозиготных носителей у 10 активность РУН соответствовала ожидаемой (3070%), однако для 3 пациентов была меньше 10%. У 17 пациентов патогенных вариантов гена Р7 не обнаружено, тем не менее для 11 из них мы предполагаем влияние на активность фактора свертывания функциональных полиморфизмов промотора и сериновой про-теазы гена 'Р7У эти пациенты являются гомозиготными носителями минорных аллелей данных генетических вариантов. Также влияние функциональных полиморфизмов может быть причиной низкой активности фактора у пациентов с одной мутацией в гетерозиготном состоянии.
Заключение. Спектр мутаций гена^7 отражает тенденции, выявленные для этого гена в других странах. Выделяется мажорная (46%) мутация — с.139Ые1С (р.Рго464Н18£8''"32), сцепленная с полиморфизмами гэ36209567 и гэ6046. Остальная часть спектра — это мутации, выявленные один или два раза. Генотипы ¥7 довольно четко отражают уровень активности РУН. Гомозиготное носительство минорных аллелей функциональных полиморфизмов гена ¥7 может снижать показатели активности РУН.
РУН а
Gla
3
4 5
з-оо-с
- известные патогенные варианты (N=19)
- ранее не описанные патогенные варианты (N=5)
- функциональные полиморфизмы
rs362095G7 rs604$ c.l39ldeJ
Рис.
Сергеев В. С.1, Гапоненко И. Н.1, Маркелов В. В.1, Сеничкина Д. А.1, Беловежец Т. Н.2, Горчаков А. А.1, Кулемзин С. В.2, Шакирова А. И.1, Лепик К. В.1, Попова М. О.1, Кулагин А. Д.1
IN VITRO И IN VIVO СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ Т-КЛЕТОК С AHTH-CD19 ХИМЕРНЫМ АНТИГЕННЫМ РЕЦЕПТОРОМ НА ОСНОВЕ АРХИТЕКТУРЫ CD8H-T/CD28/CD3(YFF, ОБЕСПЕЧИВАЮЩЕЙ СНИЖЕННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ
К АКТИВАЦИИ
'НИИ ДОГиТ им. P.M. Горбачевой ПСПбГМУ им. И.П. Павлова, 2ИМКБ СО РАН
Введение. В целях обеспечения доступа пациентов в РФ к высокоэффективной и малотоксичной анти-С019 CAR-T терапии ПСПбГМУ им. И.П. Павлова в составе консорциума академических учреждений разработало препарат анти-С019 CAR-T нового поколения, PGCT-002. Ключевыми особенностями PGCT-002 являются использование архитектуры химерного антигенного рецептора CD8H-T/CD28/CD3(YFF, обеспечивающего препарату оптимальный баланс эффективности и токсичности, а также обогащение Т-лимфоцитами с Т naive-like / Т stem cell-like memory фенотипом
Цель работы. Разработка химерного антигенного рецептора новой архитектуры для препаратаанти-С019 CAR-T PGCT-002.
Материалы и методы. Разработан дизайн и синтезированы 4 конструкции анти-С019 химерных антигенных рецепторов (CAR) на основе FMC63scFv, не склонного к олигомеризации шарнирного и трансмембранного домена молекулы CD8a (CD8H/T) и различными вариантами эндоплазматического домена: 2 CAR классической архитектуры — 4-lBB-CD3£ и CD28-CD3£, 2 CAR с измененной структурой эндоплазматического домена — CD28-CD3^YFF, в котором в дистальных мотивах ITAM остатки тирозина были заменены на остатки фенилаланина, и CD28-Fc£Rly. Ключевые параметры Т-клеток с разными CAR сравнивались в тестах in vitro
(интенсивность активации по степени экспрессии маркера CD69, цитотоксичность в отношении клеток-мишеней, пролиферация, секреция цитокинов) при культивировании с CD19+ клетками линии NALM6 и in vivo в тесте контроля роста опухолевой массы у мышей линии NBSGWnpH введении клеток линии Raji-luc с использованием прижизненной визуализации хемилюминесценции.
Результаты и обсуждение. При со-культивировании с CD19+ клетками линии NALM6 ж vitro Т-лимфоциты с CAR на основе 4-1ВВ-CD3(, CD28-CD3( и CD28-CD3^YFF продемонстрировали сходные параметры экспансии, цитотоксической активности и секреции цитокинов 11-2 и INFg, в то время как Т-клетки с CAR CD28-Fc£Rly характеризовались подавленными свойствами к пролиферации и секреции цитокинов. При этом интенсивность экспрессии (MFI) маркера активации CD69 была существенно ниже у Т-лимфоцитов с CAR CD28-FceRly и CD28-CD3(YFF, подтверждая сниженный потенциал к активации в сравнении с CAR классической архитектуры. В исследовании in vivo тестировались Т-клетки с CAR4-1BB-CD3£, CD28-CD3^h CD28-CD3(YFF. Во всех случаях CAR-T клетки существенно увеличили продолжительность жизни мышей NBSGW с привитой линией Raji-luc (14 дней и более) в сравнении с контролем (нетрансдуцированные лимфоциты от того же донора, гибель всех животных к 14-му дню). На 21-й
I ГЕМАТОЛОГИЯ ИТРАНСФУЗИОЛОГИЯ | RUSSIAN JOURNAL OF HEMATOLOGY AND TRANSFUSIOLOGY (GEMATOLOGIYA I TRANSFUSIOLOGIYA) | 2024; TOM69; №2 |
день после введения CAR-T клетки с CAR CD28-CD3^YFF контролировали рост опухолевой массы на том жеуровне или лучше Т-клеток с CAR классической архитектуры.
Заключение. Из 4 тестируемых конструкций CAR вариант с архитектурой CD8H/TM-CD28CD3^mut продемонстрировал
оптимальный баланс функциональных свойств 1п у'йго и 1п сохранение потенциала к пролиферации, цитотоксичности и секреции ци-токинов 'т у&го, подавлению роста опухолевой массы ¿п ^¿ро науровне CAR классической архитектуры, при этом обладая сниженным потенциалом к активации.
Сердюк А. И., Дианов Д. В., Кузнецова В. С., Давыдова В. Д., Корнеев К. В., Лебедева В. О., Боголюбова А. В. ОПТИМИЗАЦИЯ КОНСТРУКЦИИ ХИМЕРНОГО АНТИГЕННОГО РЕЦЕПТОРА, НАПРАВЛЕННОГО НА В-КЛЕТОЧНЫЙ АНТИГЕН СБ19
ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России
Введение. На протяжении последнего десятилетия активно развивается направление терапии злокачественных заболеваний крови с использованием Т-лимфоцитов, модифицированных химерным антигенным рецептором (CAR). Показано, что для различных мишеней на поверхности опухолевых клеток лучше подходят разные комбинации антиген-распознающих и костимуляторных доменов в составе CAR, и конструирование новых последовательностей CAR не теряет своей актуальности.
Цель работы. Изучить силу активации Т-клеток при использовании различных вариантов антиС019 CAR конструкта.
Материалы и методы. С помощью методов молекулярного клонирования были созданы конструкции, кодирующие анти-С019 CAR и имеющие в структуре различные регуляторные элементы, антиген-распознающий, костимуляторный и цитокиновый домены. Посредством лентивирусной трансдукции были получены стабильные линии репортерных клеток Jurkat Е6-1 TPR, несущие исследуемые CAR и гены флуоресцентных белков под промоторами транскрипционных факторов NFAT, NF В и АР-1. Степень активации определяли методом проточной цитометрии после кокультивации с клетками-мишенями, несущими на поверхности антиген CD19.
Результаты и обсуждение. В работе были выявлены элементы конструкции, необходимые для получения CART-клеточного
продукта, демонстрирующего сильную активацию в ответ на предъявление антигенного стимула. Так, наиболее эффективным промотором являлся полноразмерный EF-la. Также было проведено сравнение человеческого сигнального пептида GM-CSFR с сигнальным пептидом мышиного Igk и показано, что активация CAR сильнее при наличии GM-CSFR. В качестве антигенраспознающего домена рассматривали scFv FM.C63 и XS6, причем большийуровень активации наблюдали при использовании последнего. В то же время, длина линкера между цепями scFv не влияла на силу активации. Кроме того, было показано, что костимуляторный домен CD28 вызывал более сильную активацию, что может потенциально приводить к приобретению клетками истощенного фенотипа при длительной кокультивации с клетками-мишенями.
Заключение. Представленные результаты расширяют понимание роли различных доменов в составе CAR конструктов и возможностях их применения в клинической практике. Следующий этап работы с использованием CAR-T-клеток, полученных из Т-лимфоцитов периферической крови здоровых доноров, позволит изучить способность различных CAR-T-клеточных продуктов к элиминации опухолевых клеток. Использование же в конструкции CAR генов провоспали-тельных цитокинов потенциально позволит увеличить эффективность подобной иммунотерапии.
Синяев А. А., Попова М. О., Рогачева Ю. А., Власова Ю. Ю., Смирнова А. Г., Бондаренко С. Н., Моисеев И. С., Кулагин А. Д.
КОЛОНИЗАЦИЯ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫМИ БАКТЕРИЯМИ С МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ
ПРИ ОСТРОЙ РЕАКЦИИ «ТРАНСПЛАНТАТ ПРОТИВ ХОЗЯИНА«
НИИ ДОГиТ им. Р. М. Горбачевой
Введение. РТПХ увеличивает риск и тяжесть инфекционных осложнений (ИО). Колонизация грамотрицательными (ГО) бактериями с множественной лекарственной устойчивостью (ЖЛУ) коррелирует с более высокой частотой ИО.
Цель работы. Изучить колонизацию ГО бактериями с МЛУу пациентов с острой РТПХ: эпидемиологию, влияние на частоту ИО, а также влияние на исходы.
Материалы и методы. В нашем центре мы провели анализ ИО у пациентов с РТПХ. Ретроспективное исследование включен 131 взрослый пациентов (табл.) с острой РТПХ после алло-ТГСК со медианой наблюдения 513 дней (22—2688). Анализ проводился в соответствии со статистическими рекомендациями ЕВМГ.
Результаты и обсуждение. Кумулятивная частота (КЧ) бактериальных инфекций (БИ) составила 39,6% (95%ДИ 31,3—47,9). В многофакторном анализе поражение ЖКТ при острой РТПХ увеличивает риск БИ: ОР 2,8 (95%ДИ 1,4—5,4), p<0,01. А среди всех ИО, только БИ в группе оРТПХ значимо влияли на общую выживаемость: ОР 2,9 (95%ДИ l,5-5,5),p<0,01. Частота колонизации ESBL-продуцирующими ГО бактериями составила 75,5% (я=99), СРЕ — 32% (я=42). Преимущественно представлена К. pneumoniae (я=52, 53%) и Е. coll (я=15, 15%). КЧ ГО бактериальных инфекций 28,2% (95%ДИ 20,8—36,1), основной возбудитель — К.pneumoniae (n=17, 71%). Колонизация ESBL-продуцентами значимоувеличивает КЧ ГО бактериальных инфекций: 33,3% (95%ДИ 24,3—42,6) против 12,5% (ДИ 95% 3,9-26,2),p=0,0192. Также как и колонизация СРЕ: 42,9% (95%ДИ 27,8-57,1) против 21,3% (95%ДИ 13,5-30,3), Р<0,01. КЧ ГО инфекций кровотока (ИК) составила 12,9% (95%ДИ 7,9—19,3). Влияния колонизации ESBL (p=0,18) и СРЕ (р=0,16) на КЧ ИК не обнаружено. Этиология представлена К. pneumoniae (я=14, 82%), P. aeruginosa (я=2, 12%), Acinetobacter sp. (я=1, 6%). Среди пациентов с ИК (я=17, 100%):
совпадение по культуре между возбудителем и колонизацией в 10 из 17 случаев (59%); совпадение механизма резистентности: 8 из 17 (47%); смерть от сепсиса в 16 из 17 случаев (94%). Колонизация СРЕ значительно увеличивает 1-годичную безрецидивную летальность:
38,4% (95%ДИ 23,9-52,8) против 20,3% (95%ДИ 12,7-29,3),р=0,0286.
Заключение. Колонизация ГО бактериями с МЛУ значимо влияет на КЧ ГО бактериальных инфекций, но не влияет на КЧ ИК; колонизация СРЕ значимоувеличивает 1годичную безрецидивную летальность.
Таблица. Характеристика пациентов
Группа острой РТПХ (п=131)
N %
Возраст, медиана 37(18-67]
Мужчины Женщины 64 67 48,9 51,1
Стандарт Терапия «спасения» 85 46 64,9 35,1
Донор Haplo MRD MUD MMUD 24 17 53 37 18,3 13 40,5 28,2
Источник СК PBSC ВМ 100 31 76,3 23,7
Режим кондиционирования RIC MAC 114 17 87 13
Степень РТПХ 2 3 4 63 55 13 48 42 10
Follow-up, медиана 513 дней (22 - 2688]
