МУТАЦИОННЫЙ СПЕКТР ГЕНА ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ VII У РОССИЙСКИХ ПАЦИЕНТОВ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

При л о ж ен и е 1

Селиванова Д. С., Пшеничникова О. С., Щемелева Е. Ю., Абрамова Т. В., Яковлева Е. В., Зозуля Н. И., Сурин В. Л. МУТАЦИОННЫЙ СПЕКТР ГЕНА ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ VIIУ РОССИЙСКИХ ПАЦИЕНТОВ

ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России

Введение. Фактор свертывания крови VII (РУН, проконвер-тин) относится к группе витамин К зависимых факторов свертывания крови. Это один из белков, запускающих процесс гемокоагуля-ции при повреждении стенки кровеносного сосуда. Концентрация проконвертина в плазме зависит от различных параметров. Одной из причин снижения активности РУН является наследственный дефицит фактора свертывания крови VII (М1М #227500) — редкое аутосомно-рецессивное наследственное заболевание, которое обусловлено патогенными вариантами гена ¥7.

Цель работы. Целью данного исследования было описать спектр мутаций гена Р7 и взаимосвязь генотипа и лабораторного фенотипа у пациентов с дефицитом РУН.

Материалы и методы. В исследование были включены 55 неродственных пациентов (12 мужчин и 43 женщины) с дефицитом РУН. Анализ первичной структуры гена Р7 был выполнен методом секвенирования по Сэнгеру.

Результаты и обсуждение. Патогенные варианты в гене ^7были обнаружены у 38 (69,1%) из 55 пациентов. Мы идентифицировали 24 разные мутации. Из них 15 нарушений были встречены однократно, семь патогенных вариантов обнаружены дважды и одна мутация определена в четырех случаях. Преобладающей мутацией в российской популяции была микроделеция с.1391^е1С (р. Рго464Н18£8''"32). Она обнаружена у 22 пациентов (40%, N=55), в 29 аллелях (46%, N=63). Анализ показал, что данное нарушение сцеплено с функциональными полиморфизмами гэ36209567 и гэ6046, они наследуются единым гаплотипом. Пять

патогенных вариантов ранее не были описаны в международных базах данных. Одним из них была мутация сплайсинга с.347-Ю>А, четыре другие представляли собой миссенс-мута-ции, р.01у22Азр, р.Суз2388ег,

р.11е243ТЬг и р.Туг392Суэ. Алгоритмы прогнозирования патогенности оценили все новые

Домены белка FVII

CÍ1 Про пептид

(Сигнальный пептид)

Структура гена F7

1 2

□ □

rs510335 rs5742910 rs56l241

варианты как вероятно патогенные. Обнаруженные дефекты были отмечены во всех функционально значимых частях гена, но главным образом локализованы в самом протяженном домене белка РУЛ — сериновой протеазе. У большинства исследованных пациентов генетические нарушения соответствовали показателям активности РУН: 25 пациентов являлись гомозиготными носителями мутаций или компаундами (активность РУН 0,1—10%). Из 13 гетерозиготных носителей у 10 активность РУН соответствовала ожидаемой (3070%), однако для 3 пациентов была меньше 10%. У 17 пациентов патогенных вариантов гена Р7 не обнаружено, тем не менее для 11 из них мы предполагаем влияние на активность фактора свертывания функциональных полиморфизмов промотора и сериновой про-теазы гена 'Р7У эти пациенты являются гомозиготными носителями минорных аллелей данных генетических вариантов. Также влияние функциональных полиморфизмов может быть причиной низкой активности фактора у пациентов с одной мутацией в гетерозиготном состоянии.

Заключение. Спектр мутаций гена^7 отражает тенденции, выявленные для этого гена в других странах. Выделяется мажорная (46%) мутация — с.139Ые1С (р.Рго464Н18£8''"32), сцепленная с полиморфизмами гэ36209567 и гэ6046. Остальная часть спектра — это мутации, выявленные один или два раза. Генотипы ¥7 довольно четко отражают уровень активности РУН. Гомозиготное носительство минорных аллелей функциональных полиморфизмов гена ¥7 может снижать показатели активности РУН.

РУН а

Gla

3

4 5

з-оо-с

- известные патогенные варианты (N=19)

- ранее не описанные патогенные варианты (N=5)

- функциональные полиморфизмы

rs362095G7 rs604$ c.l39ldeJ

Рис.

Сергеев В. С.1, Гапоненко И. Н.1, Маркелов В. В.1, Сеничкина Д. А.1, Беловежец Т. Н.2, Горчаков А. А.1, Кулемзин С. В.2, Шакирова А. И.1, Лепик К. В.1, Попова М. О.1, Кулагин А. Д.1

IN VITRO И IN VIVO СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ Т-КЛЕТОК С AHTH-CD19 ХИМЕРНЫМ АНТИГЕННЫМ РЕЦЕПТОРОМ НА ОСНОВЕ АРХИТЕКТУРЫ CD8H-T/CD28/CD3(YFF, ОБЕСПЕЧИВАЮЩЕЙ СНИЖЕННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ

К АКТИВАЦИИ

'НИИ ДОГиТ им. P.M. Горбачевой ПСПбГМУ им. И.П. Павлова, 2ИМКБ СО РАН

Введение. В целях обеспечения доступа пациентов в РФ к высокоэффективной и малотоксичной анти-С019 CAR-T терапии ПСПбГМУ им. И.П. Павлова в составе консорциума академических учреждений разработало препарат анти-С019 CAR-T нового поколения, PGCT-002. Ключевыми особенностями PGCT-002 являются использование архитектуры химерного антигенного рецептора CD8H-T/CD28/CD3(YFF, обеспечивающего препарату оптимальный баланс эффективности и токсичности, а также обогащение Т-лимфоцитами с Т naive-like / Т stem cell-like memory фенотипом

Цель работы. Разработка химерного антигенного рецептора новой архитектуры для препаратаанти-С019 CAR-T PGCT-002.

Материалы и методы. Разработан дизайн и синтезированы 4 конструкции анти-С019 химерных антигенных рецепторов (CAR) на основе FMC63scFv, не склонного к олигомеризации шарнирного и трансмембранного домена молекулы CD8a (CD8H/T) и различными вариантами эндоплазматического домена: 2 CAR классической архитектуры — 4-lBB-CD3£ и CD28-CD3£, 2 CAR с измененной структурой эндоплазматического домена — CD28-CD3^YFF, в котором в дистальных мотивах ITAM остатки тирозина были заменены на остатки фенилаланина, и CD28-Fc£Rly. Ключевые параметры Т-клеток с разными CAR сравнивались в тестах in vitro

(интенсивность активации по степени экспрессии маркера CD69, цитотоксичность в отношении клеток-мишеней, пролиферация, секреция цитокинов) при культивировании с CD19+ клетками линии NALM6 и in vivo в тесте контроля роста опухолевой массы у мышей линии NBSGWnpH введении клеток линии Raji-luc с использованием прижизненной визуализации хемилюминесценции.

Результаты и обсуждение. При со-культивировании с CD19+ клетками линии NALM6 ж vitro Т-лимфоциты с CAR на основе 4-1ВВ-CD3(, CD28-CD3( и CD28-CD3^YFF продемонстрировали сходные параметры экспансии, цитотоксической активности и секреции цитокинов 11-2 и INFg, в то время как Т-клетки с CAR CD28-Fc£Rly характеризовались подавленными свойствами к пролиферации и секреции цитокинов. При этом интенсивность экспрессии (MFI) маркера активации CD69 была существенно ниже у Т-лимфоцитов с CAR CD28-FceRly и CD28-CD3(YFF, подтверждая сниженный потенциал к активации в сравнении с CAR классической архитектуры. В исследовании in vivo тестировались Т-клетки с CAR4-1BB-CD3£, CD28-CD3^h CD28-CD3(YFF. Во всех случаях CAR-T клетки существенно увеличили продолжительность жизни мышей NBSGW с привитой линией Raji-luc (14 дней и более) в сравнении с контролем (нетрансдуцированные лимфоциты от того же донора, гибель всех животных к 14-му дню). На 21-й