CC BY
29
© Ляховська Н.В.
УДК [577.21:616.5-002]-053.3/.5
ЗВ'ЯЗОК ПОЛ1МОРФ1ЗМА ГЕНА TLR4 З КЛ1Н1КО-1МУНОЛОГ1ЧНИМИ ПОКАЗНИКАМИ ПРИ АТОП1ЧН1Й БРОНХ1АЛЬН1Й АСТМ1
Ляховська Н.В.
Науково-дослiдний Ыститут генетичних та iмунологiчних основ розвитку патологи та фармакогенетики Вищого державного навчального закладу Украши «Украшська медична стоматолопчна академiя», м. Полтава
Исследована значимость полиморфизма Asp299Gly с заменой A на G в позиции 896 (rs4986790) гена TLR4 и связь с иммунорегуляторными факторами в механизмах развития атопической бронхиальной астмы (АБА). Нами было обследовано 45 человек больных АБА . Диагноз АБА и степень ее тяжести установлен в соответствии с утвержденными критериями полиморфизм гена TLR4 896A/G статистически достоверно (р = 0,04) встречается в группе больных АБА чем у практически здоровых лиц, что позволяет рассматривать ген TLR 4, как ген-кандидат этого заболевания. У больных, которые несут аллель 896G гена TLR4 заболевание начиналось с детства (р = 0,03), в спектре сенсибилизации присутствовали пищевые факторы (р = 0,02) и проявления другой аллергической патологии (р = 0,045). Единичный нуклеотидный полиморфизм гена TLR4 у больных атопической астмой с компенсированным течением характеризуется существенным снижение уровня IL-10, абсолютного количества CD4+,/25+/ Foxp3+ - клеток и отсутствием взаимосвязей этих лимфоцитов с другими иммунологическими показателями. Исследование генетических аспектов атопической бронхиальной астмы позволяют оптимизировать лечебно-диагностические протоколы данной патологии и способствуют внедрению профилактических мероприятий по развитию и распространению аллергических заболеваний
Ключевые слова: атопическая астма, Толл-рецептор, полиморфизм.
Бронхiальна астма - це приклад мультифакторноТ патологи, яка виникае при взаемоди факторiв навко-лишнього середовища й спадковоТ схильностк В останн роки поряд iз кгишко - функцюнальними, iму-нолопчними дослщженнями активно проводиться ви-вчення генетичних основ атотчноТ бронхiальноТ аст-ми (АБА), осгальки такий пщхщ дозволяе розширити уявлення про мехашзми розвитку цього складного па-толопчного фенотипу [19]. Вивчення генетичних аспе-к^в схильност до бронхiальноТ астми створюють новi перспективи в розробц дiагностичних критерив, Ыди-вщуальних програм проф^актики й стратеги лкуван-ня атотчноТ патологи [4 ,15].
Генетика вродженого iмунiтету стала центром ак-тивних мiжнародних дослщжень, як можлива патоге-нетична ланка атопи [1]. Значна увага сконцентрована концепци одиничних замш у геномi ДНК (однонуклео-тидний полiморфiзм — ОНП), яга кодують структуру Toll-подiбного рецептора 4, порушуючи тим самим регуляцю вродженоТ iмунноТ системи при взаемоди iз цiлим рядом антигенiв, що може бути ключовим фактором дисбалансу рiзних видiв хелперних лiмфоцитiв у хворих на АБА [2, 3]. Доведена важлива роль цих патерн-розтзнавальних рецепторiв у патогенезi ряду захворювань: атопiчноТ БА у дп"ей [14], урогенiтальних iнфекцiй [13], запальних хвороб пародонту [16], сприйнятливосл до шфекци у ВIЛ-iнфiкованих [б], цукрового дiабету [17], ревматоТдного артриту [12], хроычного саркоiдозу [5].
Вивчення розповсюдженост ОНП Т1_Р 4 у хворих на АБА викликае особливу зацкавленють, оскiльки,
вiдмiнностi в генах, що контролюють захисн реакци оргаызму можуть визначати рiзний характер nepe6iry запального процесу i специфiчних iмyнологiчних реакцм.
Мета дослiдження оцiнити значимiсть полiморфiзмy Asp299Gly 3i змiною аденiна на гуашн в позицií 896 (rs4986790) гену TLR4 та його зв'язок з iмyнорегyляторними факторами в мехашзмах розвитку АБА.
Матерiали та методи
Нами було обстежено 45 оаб хворих на АБА. Дiагноз АБА та ступшь ii тяжкосл встановлено вiдповiдно до затверджених критерив (наказ МОЗ Украши №767 та мiжнароднi рекомендацií GINA, 2011) на базi алергологiчного i пyльмонологiчного вщдтення Полтавськоí обласно!' клiнiчноí лiкарнi. Анамнестичн данi зiбранi шляхом анкетування з ви-користанням спецiального опитувальника. Уам пацieнтам з АБА були проведет загальноклУчш лабораторнi, iнстрyментальнi та алерголопчне обсте-ження. Наявнiсть сенсибiлiзацií до алергеыв дiагностовано шляхом проведення шгарного тесту-вання (прик-тест) з основними аероалергенами (побу-товими, пилковими, епщермальними, грибковими) i харчовими алергенами (ТОВ «1мунолог», м. Вiнниця). Обстеження проводили за умови вщсутност у патента загострення основного чи сyпyтнiх хрошчних, вiдсyтностi гострих iнтеркyрентних iнфекцiйних захворювань та тяжко1 сyпyтньоí патологи, яка б могла вплинути на результати дослщження. До групи кон-
* Цитування при атестац/ï Kadpie: Ляховська Н.В. Зв'язок пол'1морф'13ма гена TLR4 з лнкочмунолопчними показниками при атопчнй бронхальнй астмi. - 2013. - Т. 17, № 3-4. - С. 27-30.
тролю увмшли 90 практично здорових oci6, без алерголопчного анамнезу з бази ДНК НД1 генетичних та iмунологiчних основ розвитку патологií та фармако-генетики ВДНЗУ «Украíнська медична стоматолопчна академiя». Дослiдження проводили вщповщно надано!' письмовоí згоди на проведення обстеження та ухвали комiсií з етичних питань та бюетики вказа-ного навчального закладу. Видiлення геномно! ДНК здiйснювали методом фенол-хлороформно! екстракцп. Визначення полiморфiзму 896A/G гену TLR4 проведено методом полiмеразноí ланцюгово! реакцп з використанням специфiчних праймерiв [13].Фенотип лiмфоцитiв аналiзували шляхом визначення рiвнiв експресií поверхневих антигенiв штин з використанням моноклональних антитiл CD4, CD25 (виробництво «Сорбент», Росiя) та
внутршньоштинного бiлку FoxP3 («eBioscience», США) методом проточно1 цитофлюориметрií. Визначення проводили на проточному цитофлюорометрi EPIX LX-MCL (Beckman Coulter, США), використовую-чи програму System II TM software, рiвень загального
IgE, штерлейгану-4,10 (ТОВ «Укрмед-Дон», УкраТна) визначали в сироватц KpoBi за допомогою непрямого iмуноферметного аналiзу. Математичну обробку от-риманих даних здiйснювали з використанням програ-ми «STATISTICA 6.0» (StatSoft Inc).
Результати дослiдження та ix обговорення
Було проаналiзовано частоту полiморфiзму Asp299Gly 3i змiною аденiну на гуашн в позицiТ 896 (rs 4986790) ген у TLR4 у хворих на АБА та в грут популяцшного контролю (табл.1). У зразках ДНК 90 оаб, що входили до групи контролю, мутантний генотип GG не був виявлений, частота гетерозиготного генотипу AG склала 4,5% (4 особи), частота «дикого» генотипу АА становила 95,6% (86 оаб). У хворих на АБА вщповщш дат були такими: GG - не був виявле-ний, AG - 15,6% (7 оаб), генотип АА -84,4% (38 оаб), тобто мiж частотами генотипiв у грут контролю та у хворих на АБА в^^чаеться достовiрна рiзниця (р = 0,04), що характеризуе ген TLR 4, як ген - кандидат в розвитку АБА.
Таблиця 1
Розподл частот генотиПв та алелей гену TLR4 у хворих на АБА та в групi контролю
Генотип,алель Популяцшний контроль (n=90) Хвор1 на АБА (n=45) р*
AA 95,6 (86) 84,4 (38)
AG 4,5 (4) 15,6 (7) 0,04
GG 0 0
G 97,8 (176) 92,2 (83) 0,06
A 2,2 (4) 7,8 (7)
Особливютю хворих, що е ноаями мутантноТ алелi (табл.2.) е прояви полюенсибозацп, а саме поеднання побутовоТ та пилковоТ алергп з харчовими факторами - це вiдмiчено у вах 7 хворих (р = 0,013). У 6 оаб ^еТ групи (р=0,03) прояви аБа починалися в ранньому дитинствi; 4 па^енти пройшли типовi етапи
"атотчного маршу". Характерною клiнiчною ознакою вказаного ОНП TLR4 була супутня алерпчна патологiя (ринiт та кон'юктивiт) (р=0,045). Переважна бiльшiсть хворих мали захворювання ШКТ та частi прояви ГРВ1.
Таблиця 2
Клiнiчнi особливот перебiгу АБА в залежнот eid полiморфiзму 896A/G гену TLR4
Наявн1сть ознаки Хвор1 на АБА нос1Т «дикоТ» алел1 А TLR4, (n=38) Хвор1 на АБА носи мутантноТ алел1 G гену TLR4, (n=7) р*
Пол1сенсиб1л1зац1я, що включае харчов1 фактори так н1 7 31 7 0 0,013
Супутж алерг1чн1 захворювання (рин1т, кон'юктив1т) так н1 6 32 5 2 0,045
В анамнез! прояви "атоп1чного маршу" так н1 7 31 6 1 0,029
Част ГРВ1 так ж 17 21 5 2 0,344
При аналiзi даних, що характеризуюсь стан iмунноТ системи у носив гомо- та гетерозиготи TRL4 - нами виявлено ряд цкавих фак^в, яга можуть в^фгравати важливу роль у розумЫы особливостей iмунопатогенезу АБА.
Грунтуючись на класичних положеннях сучасноТ iмунологiчноТ науки [7] можна в^^тити ознаки дисбалансу у дiяльностi iмунноТ системи у вказаних групах хворих з компенсованим переб^ом АБА. Це в першу чергу стосуеться високоТ активносп CD4 - лiмфоцитiв. Характерною ознакою (табл.4) компенсованого переб^у АБА у па^етчв з гетерозиготними змiнами TLR4 е зменшенням кiлькостi (з 17 до 6) статистично достовiрних взаемозв'язгав та суттеве збiльшення си-ли кореляцп цих зв'язкiв, як приклад - пряма кореля^я мiж рiвнями IgE та IL4, яка вщображае ти-повий для АБА взаемозв'язок iмунорегулюючоТ та
ефекторноТ ланок патогенезу. Вщммчеы достовiрнi змiни рiвня С04+/25+/Рохр3+ та 11_10 у хворих з полiморфiзмом 896АЮ гену Т1_Р4 (табл.3). Як вiдомо, вказаний iнтерлейкiн е одним iз двох основних ефек-торних медiаторiв Т-гед клiтин [18, 8]. ЗмЫи рiвня !1_-10 можна розглядати, як системну iмунну реакцю, як натуральних, так й Ыдукованих Т-регулюючих лiмфоцитiв - це пщтверджують ряд авторiв [11].
Факт достг^рного зменшення рiвня С04+/25+/Рохр3+ у взаемозв'язку з його основним медiатором - 11_10 у носiíв гетерозиготного варiанту гена Т1_Р4 може бути важливим фактором у iмуногенетичному патогенезi АБА. Т-гед клiтини кон-тролюють реакцií не тiльки адаптивного, але i врод-женого iмунiтету, в тому чи^ i ИР [ 9]. Вщомо, що завдяки наявносл Толл - подiбних рецепторiв на поверхн вказаних регулюючих клiтин вони можуть ак-
тивуватися тими ж факторами, що активують ефек-TopHi клiтини вродженого iмунiтету [10]. Доведено, що пiдсилення активност Т-регулюючих клiтин в pезультатi повторно!' стимуляцп патогенами обумов-лено не ттьки формуванням клiтин пам'ятi, але i експанаею цих регуляторних кгмтин пiд впливом
активацiï через То11 - пoдiбнi рецептори [9]. Виходячи з цього, можливо, що генетичнi змши TLR4 можуть при-зводити до порушення в дiяльнoстi iншoï складово'1' цього механiзму, в нашому випадку - супресп ланки: Т-reg- штин та IL10.
Таблиця 3
lмунологiчнi показники у хворих на АБА в залежнот eid генотипу 896A/G гену TLR4
№ Показник Hociï "дико!' алелГ (AA), хвopi на АБА (n=38) Hociï мутантноТ алелi (AG), хвopi на АБА (n=7)
1. CD 4+ , Г/л 0,67 ± 0,07 0,78 ± 0,17
2. CD 4+/25+,Г/л 0,16 ± 0,02 0,27 ± 0,08
3. CD 4+/25+/Foxp3+ , Г/л 0,07 ± 0,01 * 0,03 ± 0,01*
4. Лейкоцити, Г/л 6,55 ± 0,4 8,7 ± 1,89
5. Еозинофти, Г/л 0,06 ± 0,01 0,05 ± 0,02
6. Лiмфoцити, Г/л 1,47 ± 0,13 2,05 ± 0,45
7. IgE, МОд 163,8 ± 14,4 170,8 ± 45,8
8 IL10, пг/л 0,45 ± 0,02 * 0,35 ± 0,03*
9 IL 4, пг/л 63,09 ± 9,28 38,6 ± 8,18
" р < 0,05 у пор'вняннi з групою оСб носив "дикоï алел"
Таблиця 4
Сила кореляцйного зв'язку iмунологiчних показниюв в залежнот eid генотипу 896A/G гену TLR4
Кореляцшж пари * Hociï "дико! алелi" (АА), хвopi на АБА (n=38) Hociï мутантно!' алелi (AG), хвopi на АБА (n=7)
1 CD4+ та CD4+/25+ 0,47 --
2 CD4+ та CD4+/25+/Foxp3+ 0,54 --
3 CD4+ та лейкоцити 0,73 0,93
4 CD4+ та еoзинoфiли 0,49 --
5 CD4+ та лiмфoцити 0,87 0,99
6 CD4+/25+ та Tii^o^™ 0,54 --
7 CD4+/25+ та лейкоцити -- 0,81
8 CD4+/25+/Foxp3+та лейкоцити 0,46 --
9 CD4+/25+/Foxp3+ та лiмфoцити 0,41 --
10 CD4+/25+/Foxp3+ та IL10 0,52 --
11 Лейкоцити та еозинофти 0,59 --
12 Лейкоцити та лiмфoцити 0,75 0,92
13 Еозинофти та лiмфoцити 0,60 --
14 IgE та IL4 0,63 0,96
15 IL10та IL4 -- -0,77
*- Bei вказанi пари е статистично достов/'рними ( р< 0,05)
Пщтвердженням положень [20] про важпивють iMyHope^rcircwoï дм CD4+/25+/Foxp3+ у хворих на АБА може бути поява у оаб i3 гетерозиготними змшами гену TLR4 достатньо'1' сипи негативнонаправпеного корепяцмного взаемозв'язку IL10 та IL4, якi характе-ризують супресивну дiю одного з основних медiаторiв Т-reg- кпiтин на Ыдуктор синтезу апергозначущих iмyногпобyпiнiв.
Висновки
1. Полiморфiзм гену TLR4 896 A/G статистично вь рогiднiше частiше ( р =0,04) зyстрiчаeться в грут хворих на АБА шж у практично здорових осiб, що дозво-пяе розгпядати ген TLR4, як ген-кандидат в розвитку цього захворювання.
2. У хворих, яга несуть апепь 896G гену TLR4 захворювання починалось з дитинства (р=0,03), в спек-трi сенсиб^заци бупи харчовi чинники (р=0,02) та мапи мюце прояви iншоï аперпчноТ патопогiï (р=0,045).
3. Одиничний нукпеотидний полiморфiзм гену TLR4 у хворих на атотчну астму з компенсованим пе-ребiгом характеризуеться суттевим зменшення рiвня
IL-10, a6conKrmoT KinbKOCTi CD4+/25+/Foxp3+ - ktmtmh Ta BiflCyTHiCTbKI B3aCMO3B'fl3KiB qMX fliM^IOqMTiB 3 iHWMMM iMyHonoriHHMMM noKa3HMKaMM.
4. flocrniflweHHA reHeTMHHMX acneKTiB aTonHHoT 6po-HxianbHOi acTMM fl03B0nflK>Tb om"MMi3yBaTM niKyBanbHO-fliarHOCTMHHi npoTOKO^M flaHOi naTononi Ta cnpMAKiTb BnpoBaflxeHHro npo^inaKTMHHMX 3axofliB ^oflo po3BMTKy Ta po3noBcroflxeHHa anepmHMX 3axBoproBaHb.
^iTepaiypa
1. Bottcher M. TLR4 polymorphism is associated with asthma and reduced lipopolysaccharideinduced interleukin-12(p70) responses in Swedish chi ldren / M. Bottcher // J. Allergy clin. immunol. - 2004. - P. 561-567.
2. Ferwerda B. Functional Consequences of Toll-like Receptor 4 Polymorphisms / B. Ferwerda, M. BB. Mccall, K. Verheijen, B. J. Kullberg // MOL MED. — 2008. — Vol. 14, № 5—6. — P. 346—352.].
3. Garcia Rodriguez C. Toll-like receptor 4 dependent pathways as sensors of endogenous «danger» signals. New evidences and potential therapeutic targets / C. Garcia Rodriguez // Imunologia. - 2007. - Vol. 26, № 4. — P. 210—215
4. Holloway J.W. Genetics of allergic disease / J.W. Holloway, I .A. Yang, S.T. Holgate // J. Allergy. Clin. Immunol. - 2010. - № 125. - P. 81
5. Pabst S., Baumgarten G., Stremmel A. et al. Toll-like receptor (TLR) 4 polymorphisms are associated with a chronic course of sarcoidosis / Clin. Exp. Immunol. - V. 143, № 3. - Р. 420-426.
6. Papadopoulos A. I., Ferwerda B., Antoniadou A. et al. Association of Toll-Like Receptor 4 Asp299Gly and Thr399Ile Polymorphisms with Increased Infection Risk in Patients with Advanced HIV-1 Infection / Clin. Infect. Dis. - 2010. -V. 51, № 2. - Р. 242-247.
7. Peakman M.. Basic and clinical Immunology/ M. Peakman, D. Vergani.- 2 edition. -USA- 2009.- 486 p.
8. Рор S. Single cell analysis shows decreasing Fохр3 and TGFbeta coeKpreissing CD4+ CD25+regulatory T cells during autoimmune diabetes/ S. Рор, C. Wong, D. Culton. et al. // J Exp Med - 2005 - P 1333-1346
9. Sakaguchi S. Control of immune resроnses by naturally arising CD4 regulatory T се!^ that еxрress toll-like гесерЬге/ S. Sakaguchi // J. Ехр. IV^d. - 2003. - tol. 197. - Р 397-401).
10. Таа^^ L. S., A^ar A. N. Реriрhеral generatijn and function оf CD4+CD25+ regulatory T cells // Curr. Top. Mikro-biol. Immunol. - 2005. - tol.6. - Р.152-162
11. Vahlemkamp T. W., Tompkins M. B., Tompkins W. A. The role of CD4+CD25+ regulatory T cells tin viral infection // Vet. Immun. Immunopathol. - 2005 - Vol.108. - Р. 219 -225.).
12. Белоглазова К.В., Шлыкова О.А., Измайлова О.В., Кайдашев И.П. Полиморфизм гена Toll-like рецептора 4 Asp299Gly у больных ревматоидным артритом / Про-блеми екол. та мед. - 2009. - Т.13, № 5-6. - С. 15-17.
13. 1змайлова О.В., Шликова О.А., Боброва Н.О. та Ы. Роль полiморфiзму Toll-подiбного рецептора 4
Asp299Gly у розвитку бактерiальних Ыфекцш, що пе-редаються статевим шляхом / Проблеми екол. та мед.
- 2009. - Т.13, № 5-6. - С. 3-6.
14. Крючко Т.О., Кайдашев 1.П., Вовк Ю.О. и др. Генетич-ний полiморфiзм Toll-подiбного рецептора 4 у дтей з атотчною бронхiальною астмою / КлЫ. iмунол. Алер-гол. 1нфектол. - 2011. - № 5. - С. 52-54.
15. Лапшин В.Ф. Бронхiальна астма й фенотипи свистячих хритв у дтей / В.Ф Лапшин., Т.Р. Уманець // Кл^чна iмунологiя. Алерголопя. 1нфектолопя. - 2010. - № 2. - С. 66-69.
16. Островська Л.Й., Петрушанко Т.О., Кайдашев 1.П. По-лiморфiзм Asp299Gly гена Toll-подiбного рецептора 4 у генезi змш ясен у ваптних / Укр. стоматол. альманах. -2009. - № 6 - С. 17-19.
17. Сульская Ю. В. Генетический полиморфизм Toll-like рецепторов 4 типа у больных сахарным диабетом 2 типа / Таврический медико-биологический вестник. -2009. - Т. 12, № 3 (47). - С. 72-74.
18. Фрейдин М.Б. Регуляторные Т-клетки: происхождение и функция// Мед биология. - 2005. - Т.7, №4. - С.347 -354.
19. Фрейдин М. Б. Генетика бронхiальноí астми / М. Б Фрейдин, Л. М. Огородова, А. Н. Цой, Н. Г. Бердникова.
- М. : Атмосфера, 2010. - 78 с.
20. Ярилин А.А., Донецкова А.Д. Естественные регулятор-ные Т-клетки и фактор роста//Иммунология. - 2006 -№3. - С.176 -186
English version: RELATIONSHIP OF GENE'S POLYMORPHISM OF TOLL-LIKE RECEPTOR 4 WITH CLINICAL AND IMMUNOLOGICAL PARAMETERS IN ATOPIC ASTHMA
Lyakhovskaya N. V.
Bronchial asthma is an example of multifactorial disease that occurs in the interaction of environmental factors and genetic predisposition. The aim of the study was to evaluate the significance of polymorphism Asp299Giy change A to G at position 896 (rs4986790) TLR4 gene and its relationship with the immunoreguiatory factors in the mechanisms of atopic asthma (AAA). Materials and Methods: We examined 45 people AA patients. The diagnosis of the AA and its severity is set in accordance with the approved criteria. Results: TLR4 gene polymorphism 896A / G statistically significant (p = 0.04 ) is found in the group of patients with AA than in heatthy individuals, which allows us to consider TLR 4 gene as a candidate gene in the disease. In patients who carry the gene TLR4 896G allele the disease began in chHdhood (p = 0.03), the spectrum of sensitization were dietary factors (p = 0.02), and there were other manifestations of allergic disease (p = 0.045). A single nucleotide polymorphism of TLR4 gene in patients with atopic asthma is characterized by over-compensated signfficant reduction in IL-10, the absolute number of CD4 + / 25 +/ Foxp3+ - cells and abcence of reia-tionnshifs between these lymphocytes and other immunological parameters. Conclusion: The study of the genetic aspects of atopic asthma optimize diagnostic and treatment protocols of this disease and contribute to the implementation of preventive measures for the development and dissemination of allergic diseases.
Kay words: atopic asthma, Toll like receptor, polymorphism
Bronchial asthma is an example of multifactorial disease that occurs in the interaction of environmental factors and genetic predisposition. In recent years the study of the genetic basis of atopic asthma (AA) is actively pursued, as this approach allows to extend the understanding of the mechanisms of development of this complex pathological phenotype [19]. The study of the genetic aspects of asthma propensity to create new perspectives in the development of diagnostic criteria for individual programs of atopic disease [4,15]. Genetics of innate immunity has become a center of active international studies as a possible pathogenetic link of
atopy [1]. Much attention is focused concept on single nucleotide polymorphism in the genome DNA ( SNP) coding structure of Toll - like receptor 4, that can be a key factor imbalance various lymphocytes lymphocytes in patients with AA [2, 3]. The important role of these patterns recognition receptors is prove in the pathogenesis of several diseases : atopic asthma in children [14], urogenital infections [13], inflammatory periodontal disease [16], gerpevirusny infection [6], diabetes mellitus [17] rheumatoid arthritis [12], chronic sarcoidosis [5].
* To cite this English version: Lyakhovskaya N. V. Relationship of Gene's Polymorphism of To-ike Receptor 4 with arnical and Immunological Parameters in atopic asthma // Problemy eko/ogii ta medytsyny. - 2013. - Vol 17, № 3-4. - P. 30 -33.
