CC BY
63
© Сакевич В. Д., Шликова О. А., Кайдашев I. П. УДК 616.5-002.2.:575
ОСОБЛИВОСТ1 1МУННОГО СТАТУСУ ХВОРИХ НА АЛЕРГ1ЧНИЙ РИН1Т У ЗАЛЕЖНОСТ1 В1Д ПОЛ1МОРФ1ЗМУ ГЕН1В ТЬк 2,4 ТА ГАЛЕКТИНУ-10
Сакевич В. Д., Шликова О. А, Кайдашев I. П.
Науково-дослщний Ыститут генетичних та iмунологiчних основ розвитку патологи та фармакогенетики Вищого державного нав-чального закладу Укра'ни «УкраТнська медична стоматологiчна академiя», м. Полтава
В исследовании приведены теоретическое обобщение и новое решение научной задачи иммунологии и аллергологии по определению генетической детерминированности при аллергическом рините путем исследования роли толл-подобных рецепторов врожденного иммунитета с полиморфизмом ТЛ2 (^5743708), ЛЯ 4 (&4986790) и ае-10 (П5420297). В обследованных больных АР в 76% случаев имеет наследственную природу преимущественно со стороны/ матери (36°%), начинается преимущественно в детском и подростковом возрасте (88°%) и в 44°%о сопровождается другой аллергической патологией. При исследовании иммунного статуса больных АР у 15°% больных наблюдали умеренную и высокую эозинофилия, повышение среднего уровня общего иммуноглобулина Е, высокие значения которого достоверно были установлены./ у больных со средне- тяжелой формой течения (р = 0,0008), рост относительного количества Сй4+ СЭ25+ Гохр+3 Трег клеток со снижением содержания Т-10 и повышением И- 4. Вы/явлена достоверная разница между частотами генотипов в группах контроля и больных АР за полиморфизмом гена ТТЛ 4 (А£р299в!у). Впервые исследованы,! популяционную распространенность полиморфизма гв420297 гена галектину-10 среди лиц, проживающих в Полтавской области (СС-76%%; СГ-22%; ТТ-2%) Обнаружена достоверная разница между частотами генотипов в группах контроля и больны/х АР (р = 0,04), полиморфизм №420297 гена Ст.С-10 достоверно чаще встречается в группе больных АР. Вы/явлена достоверная ассоциация между наличием полиморфной аллели гена 0.0-10 и уровнями Ой4+, 0й4+ 0й25+, в группе гомозиготных носителей полиморфной аллели Т и аллеля С гена СТ.С-10 установлена достоверная ассоциация между наличием полиморфной аллели гена 010-10 и уровнями Сй4+Сй25+Рохр3+, Сй4+.
Ключевые слова: аллергический ринит, состояние клеточного и гуморального иммунитета полиморфизм, То11-подобные рецепторы, галектин-10.
Алерпчш захворювання, зокрема, тага поширеш, як бронхiальна астма, алерпчний ришт, атотчний дерматит з кожним роком стають все бтьш актуальною та серйозною проблемою [Kumar A., Yhosh В., 2009]. Алерпчний ришт (АР) - це захворювання, що характеризуемся IgE-опосередкованим iмунологiчним за-паленням, що розвиваеться в результат попадання алергешв на слизову оболонку носа [Van Cauwenberge Р.В. et al., 2001].
У даний час визнана точка зору, згщно з якою АР е мультифакторним захворюванням (МФЗ). Сьогодш поширеною концеп^ею е наслщування алерпчних за-хворювань та визначена досить велика ктькють гешв, що опосередковуе Тх машфестацю. Однак результати численних дослщжень суперечливг молекулярно-генетичш основи формування захворювання поки ви-вчеш недостатньо. Все це перетворюе АР в серйозну медико-со^альну проблему i диктуе необхщнють до-слщження причин i iмунологiчних механiзмiв розвитку даного захворювання для розробки адекватних лку-вально-профтактичних заходiв, що враховують етш-чну приналежнють, iмунологiчну реактивнють i гене-тичш особливост хворих.
Метою дослщження було визначення ролi поль морфiзмiв гешв, що контролюють структурш та регу-ляторш елементи неспецифiчноТ резистентности орга-
HÍ3My (толл-подiбних рецептов: 2258G/A гену TLR2 (rs5743708), 896A/G гену TLR4 (rs4986790) та гену га-лектину-10 (rs420297 C/T)) у патогенезi АР, для по-глиблення знань про iмyнологiчнi механiзми розвитку цього захворювання.
Матерiали та методи дослiдження.
Для виршення висунутих завдань проведено об-стеження 45 пацieнтiв вiком вщ 19 до 65 рокiв хворих на АР, на стадп шшчно'Т ремiсií захворювання, якi пе-ребували на диспансерному облку в пол^шчному вiддiленнi четвертоТ мiськоТ клiнiчноТ лкарш та алер-гологiчномy вiддiленнi ПолтавськоТ обласноТ клiнiчноТ лiкарнi iм.Склiфосовського. Групу порiвняння склали 95 практично здорових о^б з банку ДНК Науково-дослiдного iнститyтy генетичних та iмyнологiчних основ розвитку патологiТ та фармакогенетики Вищого державного навчального закладу УкраТни «УкраТнська медична стоматологiчна академiя», якi були анкето-ванi та кгмшчно обстеженi для виключення алерпчних захворювань.
Дiагноз АР встановлювали на основi критерiТв дiа-гностики ARIA (2008) за алгоритмом дiагностики при-йнятим в УкраТш та затвердженим МОЗ УкраТни. Ягасть життя хворих визначали за допомогою загаль-новизнаних опитувальнигав (Adult Rhinoconjunctivitis
* Цитування при атестацп кадр1в: Сакевич В. Д., Шликова О. А., Кайдашев I. П. Особливой iмунного статусу хворих на алерпчний puHim у залежнот вiд полiморфiзму гешв TLR 2,4 та галектину-10 // Проблеми екологп i медицини. - 2014. - Т. 18, № 3-4. - С. 34 -39.
Quality of Life Questionnaire). Апергологiчне обстежен-ня проводипося за загальноприйнятою методикою шляхом постановки шфних prick-TecTiB (ТОВ «1муно-пог», Вiнниця, Украша).
Отримання периферичноТ кровi пацieнтiв здмсню-вапи шляхом забору кровi з кубiтапьноï вени натще-серце одноразовим пластиковим шприцом в об'eмi 1 мл у стерильну суху скляну пробiрку з гепарином (25 ОД/мл) для отримання суспензп мононуклеарних кль тин периферичноТ кровi; в об'eмi 4 мл у вакуумну про-бiрку з ЕДТА (8,4 мг K3EDTA) для видiпення ДНК; та в об'eмi 5 мл у стерильну суху скляну пробiрку без до-давання антикоагулян^в для отримання сироватки.
Отримання суспензп мононуклеарних штин пе-риферичноТ кровi здiйснювали шляхом центри-фугування в градieнтi щiльностi фiкол-верографiну (1,077 г/мл). Сироватку видтяли з периферичноТ кро-вi, зiбраноï натщесерце у стерильну суху скляну про-бiрку без додавання антикоагулянтiв, шляхом Ыкубу-вання та центрифугування [Беркало Л.В. та Ы., 2003]. Видiлення геномно'1' ДНК проводили методом фенол-хлороформноТ екстракцiï [Епринцев А.Т. и др. 2008]. Визначення полiморфiзмiв толл-подiбних рецетгрв: 2258G/A гену TLR2, 896A/G гену TLR4 проведено методом полiмеразноï ланцюговоТ реакцiï (ПЛР). Ампль фкацю проводили за допомогою амплiфiкатора «Те-рцик» («ДНК-Технология», Москва) за вщповщною програмою з використанням специфiчних ол^онукле-отидних праймерiв iз наступним рестрикцмним аналь зом [1змайлова О.В. та Ы., 2011]. Детекцiя продуктiв амплiфiкацiï проведена за допомогою електрофорезу в 3% агарозному гелi («Helikon», Москва) в 1 х TBE (50 мМ трис-НзВОз та 2 мМ ЕДТА, рН 8.0) з подаль-шою вiзуалiзацieю результатiв у УФ-свпл та фото-графуванням.
Для визначення полiморфiзму генiв проводили ви-дiлення геномно'1' ДНК з периферичноТ кровi обстежу-ваних за допомогою набору «ДНК-экспресс-кровь» (ООО НПФ «Литех», Россия), амплiфiкували за допомогою алель-специфiчноï полiмеразноï ланцюговоТ реакцiï в 35 мкп реакцiйноï сумiшi з додаванням по 5 пкмоль специфiчних праймерiв. Продукти амплiфiкацiï гену галектину-10 iдентифiкували за допомогою флу-орисцентноТ реeстрацiï накопичення ДНК за каналами флюоресценцп.
Фенотип лiмфоцитiв аналiзували за допомогою визначення рiвнiв експресiï поверхневих антигенiв к^тин CD4, CD25 та внутрiшньокпiтинного бтка Foxp3+ методом проточно!' цитофлюориметрiï («EPICS XL-MCL»(«Beckman Coulter»,США) за стандартною методикою, використовуючи вщповщш моно-кпональш антитiла (виробництво «Сорбент», Росiя; «eBioscience», США).
З метою визначення стану гуморальноТ ланки iму-нiтету хворих на АР визначали рiвень загального IgE в сироватц кровi визначали за принципом двосайто-вого (сендвiч) iмуноферментного аналiзу за допомогою тест-системи 1ФА для кiлькiсного визначення загального IgE (ТОВ «Укрмед-Дон», Украша). Ктькюне визначення iнтерлейкiну-4 та iнтерлейкiну - 10 у хворих на АР проводили за допомогою тест-системи 1ФА для ктькюного визначення Ытерлейкшу - 4 та штер-лейкшу - 10 ТОВ «Укрмед-Дон» (Украша) згiдно н струкцiй до наборiв. Оптичну густину дослiджуваних зразкiв визначали на iмуноферментному аналiзаторi "Stat-Fax 2100" (USA) при довжин хвилi 450 нм.
Статистичну обробку отриманих результат провели за допомогою статистичного пакету STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc., USA) згщно з рекоменда^ями. Порь вняння частот генотипiв мiж дослщжуваними групами проводили шляхом аналiзу таблиць спряженостi за допомогою точного тесту Фшера. Для порiвняння частот алелей використовували критерм х2. Для оцЫки достовiрностi вiдмiнностей мiж групами використовували точний двостороншй критерм Фiшера (для ма-лих груп). Для уах видiв аналiзу статистично значу-щими вважали вiдмiнностi при р < 0,05.
Результати та ix обговорення.
Вивчення обстежуваних 45 хворих на АР вком вщ 19 до 65 роюв (серед яких жЫки склали 49%, а чоловь ки 51%) показало, що в залежност вiд перiодичностi впливу алергену, характеру переб^у та частоти симп-томiв у 27% (12 хворих) виявлений цiлорiчний (або персистуючий) АР та у 73% (33 хворих) сезонний (або Ытерм^уючий) АР. Стутнь тяжкостi захворювання оцiнювався на основi загальноприйнятих критерiíв дь агностики ARIA (2008) [Brozek J.L. et al., 2008] з ура-хуванням анамнестичних показниюв, тяжкостi кпУч-них проявiв, íх впливу на загальний стан та якють життя (працездатнють, навчання, вiдпочинок, денну активнiсть, сон та Ы.), частоти застосування лкарсь-ких засобiв та íх ефективносп. На основi цього вста-новили легкий переб^ - у 11 (25%), середньо-важкий - у 32 (71%), важкий - у 2 (4%) обстежених хворих на АР. Ускладнений АР виявлений у 32% обстежених хворих. Серед них найбтьш поширеними виявились: риносинусит полипозний-18%, середшй отит-9%, ди-сфункцiя eвстахieвих труб та ларинпт - 6%.
Анамнестично встановлено, що розвиток захворювання пов'язаний iз впливом алергеыв на оргашзм переважно в дитячому вiцi - 56% (25 хворих), а також в пщлпжовому та молодому вщповщно - 32% (14 хворих) та 12% (6 хворих), що зумовлено особливостями iмунноí системи в дитячому вiцi [ Дранник Г.Н., 2010]. Наявнють алерпчних захворювань у родичiв 1-11 сту-пеню спорiдненостi з боку матерi виявлена в 35%, з боку батька - у 30%, з боку обох батьюв-у 11% уах обстежених хворих на АР, що узгоджуеться з науко-вими даними щодо переважного зв'язку з алерпчними захворюваннями з боку матерi [Охотникова Е.Н.,2008].
При алергологiчному обстеженнi хворих на АР у 89% пацieнтiв були виявлен позитивнi шкiрнi проби на пилков^ грибковi, побутовi, епiдермальнi та харчовi алергени, при чому у 7% мала мюце сенсибiлiзацiя до одше'1' групи алергену, у 29%-до двох груп, у 36%-до трьох груп, у 13%-до чотирьох груп, а в 4%-до всiх п'яти груп алергеыв.
Концепцiя наслiдування АР, що реалiзуeться дис-функцieю iмунноí системи, доведена клiнiчними спо-стереженнями та в наш час не викликае сумнiвiв [Охотникова Е.Н.. 2008]. У патогенезi АР зазвичай провщними розглядають IgE-опосередкованi iмуннi реакцií [Дранник Г.Н., 2010]. Результати численних дослщжень спонукали учених до пошуку нових конце-пцiй iмунопатогенезу АР. Вщкриття Т-регуляторних (Treg) клiтин визначае шлях до розумшня механiзмiв периферичноí толерантности та iндукцií Тх1-та Тх2 -опосередкованих iмунних реакцiй, дисбаланс яких су-проводжуе розвиток АР. Вщомо, що важливим е не сттьки спiввiдношення Тх1> <Тх2, скiльки актива^я вiдповiдних Т-регуляторiв iмунноí вiдповiдi [Титова
Н.Д., 2009]. Кр1м того, вважаеться доведеним, що лише на раншх стад1ях формування АР дом1нуе Тх1 вплив, а п1зн1ше дисбаланс Тх1/Тх2 визначаеться на користь Тх2. Сл1д зазначити, що в бтьшосл випадк1в чхання, сверб1ж у нос1, ринорея, закладенн1сть носа були сильнше виражен1 саме в п1зню фазу алерпчноТ реакци 1 типу, де провщну роль в1д1грають Тх2 [шууакоуа 1_.!. а1., 2001].
Однак у 15% пац^нтв виявлена еозиноф^я 3Í збiльшенням абсолютно! та вщносноТ кiлькостi еози-нофiлiв При визначенн рiвня загального IgE у 76% па^етчв вiдзначаeться достовiрне пiдвищення показ-никiв, рiвень загального IgE становив 198,2 ± 11,42 МО/мл, що пщтверджуе провiдну роль IgE-опосередкованих iмунних реакцiй при атопiТ [Johansson S.G.O et al., 2001; Kaidashev I.P., 2009].
Слщ зазначити зростання вщносноТ ктькост Ой4+Ой25+Рохр3+Трег клiтин у порiвняннi з показни-ками практично здорових людей, що узгоджуеться з результатами сучасних дослщжень [Rellinghausen I. et. al., 2003; Schmidt-Weber O.B. et. al., 2005]. Отрима-нi данi пщтверджують концепцiю, що iмунна вiдповiдь на алергени у здорових оаб та хворих на алерпю е результатом стввщношення мiж алергенспецифiчни-ми Трег штинами та Th2 клiтинами [Rellinghausen I. et. al., 2003; Takahashi Т. et al., 2000].
Виявлен порушення цитошновоТ регуляцiТ у об-стеженних хворих на АР, а саме пщвищення вмiсту IL-4 (84%)-що пiдсилюе виживання еозинофiлiв. В сере-дньому показник складав 50,34 ± 3,58 пг/мл, що в 2,5 рази перевищуе значення показнигав здорових оаб.
Важливими складовими штинноТ iмунноТ вiдповiдi е Трег кштини, що регулюють функцiю Т-хелперiв та Т-цитотоксичних штин, забезпечуючи спрямованiсть Th1/Th2 типiв iмунноТ вiдповiдi. Дослiдження останшх рокiв вказують на iснування Ыдуцибельних IL-10-продукуючих Трег клiтин [Фрейдлин И.С., 2005; Бережная Н.М., 2013]. За нашими даними рiвень супресо-рного цитокiна IL-10 у хворих на АР у середньому склав 0,35 ± 0,016 пг/мл.
Згщно з сучасними дослiдженями, гени атопи та пов'язаних з нею сташв сконцентровано в основному у 10 дтянках геному людини [Carroll W., 2005]. 1сну-ють вщомосл щодо асоцiацiТ алергiчного ринiту iз по-лiморфiзмом гену TIM-1 [Mou Z. et al., 2010], CD14 [ Han D et al., 2010],TLR 2-4 [Kang I.. et al., 2010], RNAse 3[Kang I. et al, 2010].
З метою визначення ролi полiморфiзму окремих геыв, якi контролюють структурнi та регуляторы еле-менти неспецифiчноТ резистентностi оргашзму, в роз-витку алергiчного риыту, визначена розповсюдженiсть полiморфiзму гену TLR2 (rs5743708), гену TLR 4 (rs4986790) та гену 0LC-10 (rs420297) в групi спосте-реження i в груп популяцiйного контролю, проведено аналiз iмунологiчних показникiв та клiнiчних проявiв у
Дослiдженi показники периферично'1' KpoBi та пока-зники iMyHHoro статусу хворих на АР в стадп peMiciï (piBeHb лейкоцитiв, вiдносна ктьшсть лiмфоцитiв, вщ-носна кiлькiсть еозиноф^в) в цiломy вiдповiдали но-рмальним показникам практично здорових оаб (табл.1) [ Литвинов А.В., 2007].
Таблиця 1
lмунологiчнi показники обстежених хворих на АР
хворих з полiморфними BapiaHTaMM дослщжуваних гешв. Шляхом молекулярно-генетичного дослщження серед хворих на АР було видтено носiïв полiморфних алелей та проведено аналiз розподiлу генотитв за дослiджуваними полiморфiзмами.
В оаб, що входили до групи контролю, частота генотипу TLR2 GG становила 97,8%; частота гетерозиготного генотипу GA - 2,2%, полiморфний генотип АА не був виявлений. У груш хворих на Ар вщповщш результата були такими: GG - 93,3%, GA - 6,6% та АА також не був виявлений. Не виявлено достовiрного зв'язку мiж частотою появи полiморфноï алeлi А в груш контролю та хворих на АР (х2 = 0,74; р = 0,34). Отриман результати вщсутносл асо^аци полiморфi-зму 2258G/A гену TLR2 з АР узгоджуються з шшими науковими даними [ Modrzynski M., 2007].
При дослщжеш полiморфiзму гену rs4986790 TLR4 в групi контролю частота полiморфного генотипу АА становила 95,6%, гетерозиготного генотипу AG -4,5%, полiморфний генотип GG не виявлений. У хворих на АР вщповщно: АА - 92,3%, AG - 7,7% та GG -не виявлений. Достг^рно значно вищою виявилася рiзниця мiж частотами генотитв у групах контролю та хворих на АР (р = 0,03). Частота полiморфноï алeлi G в груп хворих на АР склала 7,7% (х2 = 3,58; р = 0,06) у порiвняннi з групою контролю, виявлена рiзниця на рiвнi статистичноТ тeндeнцiï [Davila I. et al., 2009].
Функцюнальний полiморфiзм гена TLR4 полягае в зам^ аспарагiновоï кислоти на глiцинову Asp299Gly1187 (rs4986790) [ Montes A.H. et al., 2006]. У рeзультатi знижуеться здатнiсть TLR4 до розтзна-вання вщповщних лiгандiв або до проведення внутрь шньоклiтинних сигналiв, що призводить до менш ви-раженоТ активацп клiтин iмунноï системи пiсля зустрiчi з патогеном. [Schnare M. et al., 2006; Байракова О.Л. и др., 2008].Функцюнальний полiморфiзм TLR4 порушуе рeгуляцiю вродженоТ iмунноï вiдповiдi, що е основним чинником дисбалансу Т1/Т2-хeлпeрiв [Симбирцев А.С., 2005]. Подiбний мехашзм вiдiграе вирiшальну роль у формуванн хронiчного запального процесу та привертае увагу як потенцшний чинник ризику розвит-ку атопiчноï патологiï, зокрема АР [Kang I. et al., 2010].
При дослщжеш полiморфiзму rs420297 C/T гену CLC-10 у груп контролю частота генотипу CC становила 75,56%, гетерозиготного генотипу CT - 22,22%, генотип TT - 2,22%. У хворих на АР вщповщно: CC -57,78%, CT - 24,44% та TT - 17,78%.
Показник Показники практично здорових ос1б Показники хворих на АР, n=45
Загальний IgE, МОд/мл 0 - 130 198,2 ± 11,42
CD4+,% 39 ± 5 40,5 ± 1,02
CD4+/CD25+,% 9,4 ± 2,05 16,5 ± 1,9 (0,25)
CD4+CD25+Foxp3+,% 5-10% вщ CD4+ 4,66± 0,38
1Л-10, пг/мл 0-50 пг/мл 0,35 ± 0,016
1Л-4,пг/мл 0-20пг/мл 50,34 ± 3,58
Виявлена достовiрна рiзниця мiж частотами гено-титв у групах контролю та хворих на АР (р = 0,04). Досг^рно значно вищою виявилася рiзниця за частотою полiморфноí алелi Т в групi хворих на АР-30% (X2 = 6,42; р = 0,011), у порiвняннi з групою контролю. У дослiдженнях закордонних учених вивченню асоць ацií алерпчного ринiту iз полiморфiзмом гену галекти-ну-10 (CLC-10) останнiм часом придтяеться особлива увага [Bryborn M. et al., 2010].
Генетичнi маркери можуть визначати схильнють до захворювання або бути асоцмованими з вщповщ-ними патогенетично значущими показниками. Тому в межах пропонованого дослщження було вивчено вплив полiморфiзму гену TLR2 (rs5743708), гену TLR 4 (Asp299Gly) та гену CLC-10 (rs420297) на переб^ та особливостi клiнiчних проявiв АР. Пщ час аналiзу вщ-мЫност за частотою виявлення цiлорiчноí та сезонно'1' форми перебiгу мiж групами хворих на АР залежно вщ генотитв полiморфiзму 2258G/A гену TLR2 та гену TLR 4 (Asp299Gly) не мали статистично' значущостi.
Слщ зазначити наявнiсть вiрогiдних вiдмiнностей мiж групами залежно вiд генотипiв полiморфiзму гену TLR4 Asp 299 Gly за наявнiстю супутнiх алергiчних захворювань. Достовiрно, що частiше у цих хворих на АР виявляли супутню БА (р=0,0003), супутнiй АД (0,0031) та БА у поеднанн з АД (р=0,0005). Вiрогiднi вiдмiнностi мiж групами залежно вiд генотипiв поль морфiзму rs420297 C/T гену галектину-10 були вияв-ленi за клУчними формами АР. Достовiрно, що час-тiше у хворих на АР з полiморфною алеллю галекти-ну-10 виявляли цiлорiчну форму АР (р=0,0001).
Як зазначалося ранiше, порушення рiвноваги Т1\Т2-хелперiв з переважанням Th-2 iмунноí вiдповiдi вiдiграе провiдну роль в розвитку АР. У вщповщь на вплив алергеыв у хворих на АР вщбуваеться вивть-нення ТЬ|2-цитоюшв та iндукуеться активацiя еозино-фов, опасистих клiтин та пiдвищений синтез IgE. 1с-нують вiдомостi, що зазначен реакци вiдбуваються опосередковано через TLR2,4 [Крючко Т.О. та Ы., 2011; Ahmad-Nejad P. et al., 2004]. Вщомо також, що галектин-10 е необхiдним для здiйснення регулятор-но' активностi Treg клiтин [Kubach I. et al., 2007].
З метою виявлення вщмшностей мiж хворими на АР залежно вщ дослщжуваних полiморфiзмiв гену iмунологiчними показниками було проведене порiв-няння вiдповiдних груп з використанням критер^ Манна-Уiтнi.
Виявлена досг^рна рiзниця мiж групами хворих на АР з наявнютю алелi A гену TLR2 та гомозиготни-ми носiями алелi G за показником CD4+ (U(n=42n= 3) = 12,00; p=0,020).
Виявлена достовiрна рiзниця мiж групами хворих на АР з наявнютю полiморфноí алелi Т гену CLC-10 та гомозиготними ноаями алелi С за показником CD4+ (U(n=26;n= 9) = 139,50; p=0,014). Слiд зазначити, що рь вень експреси молекул CD4+ у хворих на АР з алеллю Т гену галектину-10 в середньому мав тенден^ю до збтьшення, а у хворих на АР носив алелi С не вихо-див за межi показниюв практично здорових оаб (табл.2).
Таблиця 2
В1дм1нност1 за ¡мунолог1чними показниками хворих на АР залежно eid генотипе полиморфизму гену галектину-10
Показник Хвор1 на АР з генотипами СТ+ТТ, (n=19) Хвор1 на АР з генотипом СС, (n=26)
CD4+,% 44,14±1,92 37,92±1,37
U, р U(n=26;n= 19) = 139,50; p=0,014
CD4+ CD25+,% 11,09±1,32 21,16±2,96
U, р U(n=26;n= 19) = 136,00; p=0,012
Загальний IgE, МОд/мл 234,86±12,46 171,48±15,74
U, р U(n=26;n= 19) = 138,50; p=0,013
1Л-4, пг/мл 61,61 ±5,30 42,11± 4,22
U, р U(n=26;n= 19) = 123,00; p=0,004
1Л-10, пг/мл 0,303±0,11 0,394±0,024
U, р U(n=26;n= 19) = 136,50; p=0,011
U, р-в1'дм1'нност1' мiж групами за критер'юм Манна-Утнi
Також група хворих на АР з алеллю T гену CLC-10 досг^рно в^знялась за вищим значенням рiвня CD4+CD25+ (U(n=26;n= 9) = 136,00; p=0,012) вщ групи хворих на АР гомозиготних носив алелi C. Отже, гале-ктин-10 е необхщним для здшснення регуляторноí ак-TИBHOCTi Тгед клiтин.
При порiвняннi показникiв загального IgE у груп хворих залежно вщ генотитв полiморфiзму гену CLC-10 достовiрно були встановленi вищi значення рiвню IgE у хворих на АР з алеллю T гену CLC-10 (U(n=26;n= 9) =138,50; р=0,013) який становив 234,86±12,46 МО/мл.
Виявлен порушення цитокiновоí регуляци з досто-вiрним пiдвищенням показникiв 1Л-4, що пiдсилюе ви-живання еозиноф^в. Мiж групами хворих залежно вщ полiморфiзму гену CLC-10 встановленi досг^рно вищi значення показникiв 1Л-4 у хворих на АР з алеллю T гену CLC-10 (U(n=26;n= 9) =123,00; р=0,004), рiвень якого становив 61,61±5,30 пг/мл.
Рiвень супресорного цитоюна 1Л-10 у хворих на АР у середньому склав 0,35 ± 0,016 пг/мл. Це може бути пов'язаним з рiзними формами АР, коли у хворих з
хрошчною формою процесу рiвень концентраци 1Л-10 може значно знижуватись порiвняно з показниками гостроí стадií захворювання (може пояснюватися збь льшенням концентраци у сироващ цитокiнiв Тх-1 профтю) або залишатися пiдвищеним вiдповiдно до показниш норми [Дранник Г.Н., 2010]. Мiж групами хворих залежно вщ полiморфiзму гену галектину-10 була виявлена рiзниця за показниками рiвню IL10; вищi значення якого достовiрно були встановлеш у хворих на АР гомозиготних носив алелi C (U(n=26;n= 9) =136,50; р=0,038) та склали 0,394±0,024 пг/мл.
Виявлена достовiрна рiзниця мiж групами хворих на АР гомозиготними ноаями алелi Т гену CLC-10 та гомозиготними ноаями алелi С за показником CD4+ (U(n=26;n= 19) = 37,00; p=0,006). Також група хворих на АР гомозиготних носив алеллi Т гену CLC-10 достовь рно вiдрiзнялась за вищим значенням рiвня CD4+CD25+Foxp3+% (U(n=26;n=8) = 52,50; p=0,037) вiд групи хворих на АР гомозиготних носив алелi гену CLC-10 (табл. 3).
Таблиця 3
BidMiHHoemi за ¡мунолог1чними показниками хворих на АР залежно eid генотипе полиморфизму гену галектину-10
гомозиготних носП'в
Показник Хворi на АР з генотипом TT гену галектину-10, (n=8) Хворi на АР з генотипом СС гену галектину-10, (n=26)
CD4+,% 46,96±2,30 37,91 ± 1,37
U, р U(n=8;n= 26) = 37,00; p=0,006
CD4+CD25+Foxp3+,% (тис/мкл) 6,61 ± 1,54 4,08± 0,35
U, р U(n=8;n= 26) = 52,50; p=0,037
U, ре'дм'нност'! мiж групами за критер'юм Манна-У'1тн'1.
Отримаж результати пщтверджують, що, незва-жаючи на значну внутр^тинну експресю галектину-10 в CD25+ Treg клiтинах, вiн безпосередньо не бере участ в пригшченш функцiï CD25+ Treg клiтин, однак специфiчна блокада галектину-10 вiдновлюe проль феративну здатнiсть CD25+ Treg кгмтин та пiдсилюe ïx супресивнi функци. Отже, галектин-10 е необxiдним для здмснення регуляторноï активностi Treg клп"ин [Kubach I. et al., 2007].
Отже, виявлен в результатi дослщження змЫи i взаемозв'язки клiнiко-iмунологiчниx показнигав у хворих на АР носив полiморфниx алелей генiв TLR2, TLR 4, CLC-10 дозволяють припустити важливе значення зазначених полiморфiзмiв у визначенн перебiгу АР, наявностi супутньо'1' патологи, полiвалентноï алерги у хворих на АР та реалiзацiï iмунниx меxанiзмiв у пато-генезi захворювання.
Висновки
1. В обстежених хворих АР у 76% випадгав мае спадкову природу переважно з боку матерi (36%), розпочинаеться переважно в дитячому i пщлпжовому вiцi (88%) i в 44% супроводжуеться Ышою алерпчною патологiею. Визначенi клiнiчнi форми АР-у 27% цто-рiчний та у 73% сезонний, за ступенем тяжкост ви-явили: легкий - у 32%, середньотяжкий -у 62%, тяжкий - у 6% переб^ захворювання. При алерголопчно-му обстеженн у 89% хворих на АР виявили позитивы шфш проби на побутов^ епщермальш, пилковi, хар-човi та грибковi алергени. У 82% хворих виявлена по-лiвалентна сенсибiлiзацiя до двох i бтьше груп алер-генiв.
2. При дослщжены iмунного статусу хворих АР у 15% хворих спостер^али еозинофтю, пiдвищення середнього рiвня загального iмуноглобулiну Е, зрос-тання вiдносноï ктькосл CD4+CD25+Foxp3+ Трег Hini-тин iз зниженням вмiсту IL-10 та пщвищенням IL-4.
3. У групi хворих на АР встановлена розповсю-дженнють полiморфiзму гену TLR2 (rs5743708): генотип GG становив 93,3%, генотип GA - 6,6%, генотип АА не зустрiчався. Виявлена достовiрна рiзниця мiж групами хворих на АР з наявнютю полiморфноï алелi гену TLR2 та гомозиготними ноаями алелю G за по-казником CD4+ (U(n=42;n= 3) = 12,00; p=0,020).
4. У групi хворих на АР встановлена розповсю-дженнiсть полiморфiзму гену TLR 4 (Asp299Gly): генотип АА становив 92,3%, генотип AG - 7,7%, генотип GG не зуст^чався. Виявлена достг^рна рiзниця мiж частотами генотипiв у групах контролю та хворих на АР (р = 0,03). У хворих на АР носив алелю G за поль морфiзмом 896A/G гену TLR4 виявлена атотчна па-толопя: супутня БА (р=0,0003), супутнiй АД (0,0031) та БА у поеднанн з АД (р=0,0005).
5. Розповсюдженiсть полiморфiзму rs420297 гену галектину-10 серед оаб, що проживають в Полтавсь-
к1й областi скпадае СС-76%; СТ-22%; ТТ-2%. Виявлена достовiрна рiзниця мiж частотами генотипiв у групах контролю та хворих на АР (р = 0,04), полiморфiзм rs420297 гену CLC-10 достовiрно частше зуст^чаеть-ся в групi хворих на АР. Виявлена достг^рна рiзниця за частотою апепю Т CLC-10 в груш хворих на аР-30%, у порiвняннi з групою контропю-13% (х2 = 6,42; р = 0,011). Розвиток та переб^ алерпчного ринiту асоць йований з полiморфiзмом rs420297 гену CLC-10 (до-стовiрно частiше у хворих на АР з мутантною апеппю CLC-10 виявпяпи цiлорiчну форму АР (р=0,0001)).
6. Виявлена достовiрна асо^а^я мiж наявнiстю попiморфноí апепi гену CLC-10 та рiвнями CD4 + (p=0,014), CD4+ CD25+ (p=0,012), в груш гомозиготних носив полiморфноí алелi Т та апепi С гену CLC-10, встановлена достовiрна асоцiацiя мiж наявнiстю по-пiморфноí апепi гену CLC-10 та рiвнями CD4+CD25+Foxp3+ (p=0,037), CD4+ (p=0,014). Вста-новлено, що особи яга несуть полiморфну алель гену CLC-10 мають достовiрно вищi рiвнi IgE (р=0,013) та 1Л-4 (р=0,004) та нижчий рiвень IL10 (р=0,038).
Лiтература.
1. Van Cauwenberge P.B., Ciprandi G., Vermeiren J.S.J. Epidemiology of Allergic Rhinitis. - The UCB Institute of al-legy, 2001. - 27p
2. Методи клшнних та експериментальних дослщжень в медицин / [Беркало Л.В., Бобович О.В., Боброва Н.О. та ¡н.]; пщ ред. проф. Кайдашева 1.П. - Полтава : Пол1мет, 2003. - 320 с.
3. 1змайлова О.В. Зв'язок полiморфiзмiв гежв TLR2 та TLR4 зi схильнютю до окремих урогенiтальних Ыфек-цш./ О.В. 1змайлова, О.А. Шликова, Н.О. Боброва [та ¡н.].// Цитология и генетика - 2011. - № 4. - P. 29-35.
4. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA / О.Ю.Реброва - М.: МедиаСфера, 2002.312 с.
5. Brozek J.L., Baena-Cagnani C.E, Bonini S. et al. Methodology for development the Allergic Rhinitis and its Impact of Asthma Guideline 2008 update // Allergy. - 2008.-Vol.63(1).- Р.38-46
6. Дранник Г.Н. Клиническая иммунология и аллероголо-гия / Георгий Николаевч Дранник. - К.: ООО «Полиграф плюс», 2010. - 552 с.
7. Охотникова Е.Н. Аллергический «марш»: связь поколений и эскалация аллергии у детей (лекция) // Совре-мен. педиатрия. - 2008. - №4(21). - С.190-197
8. Титова Н.Д. Значение врождённой системы иммунитета в возникновении аллергических заболеваний.// Иммунология, алергология, инфектология.-2009-(3).- Р.32-39.
9. Lityvakova L.I., Baraniuk J.N. Nasal provocation testing: a reviw. Ann. Allergy Asthma Immunol. - 2001. - Vol. 86. -P. 355-364.
10. Норма в медицинской практике: Справочное пособие / Составит. А.В. Литвинов. - М.: МЕДпресс-информ, 2007. - 144 с.
11. Kaidashev I.P. The allergen-specific IgE reactivity pattern of Ukrainian allergic patients // Проблеми екологи та медицини. -2009.- №2-3.- С.8-14
12. [Sellinghausen I., Klostermann B., Knop J., Saloga J. Hu-manCD4+CD25+ T cells derived from the majority of atopic donors are able to suppress Thl and Th2 cytokine production // J. Allergy Clin. Immunol. - 2003. - Vol. 111. - P. 862-868
13. Фрейдин М.Б., Брагина Е.Ю., Огородова Л.М., Пу-зырев В.П. Полиморфизм генов глутатионтрансфераз ql и ml (GSTT1 и GSTM1) у больных атопнческой бронхиальной астмой в Западно-Сибирском регионе // Молекулярная биология. - 2002. - Т.36. - № 4. - С.630-634.
14. Han D., She W., Zhang L. Association of the CD 14 gene polymorphism C-159 T with allergic rhinitis// Am I Phinol Allergy. - 2010. - 24 (1). - P.1-3
15. Куценко, Н. Л. Полиморфизм Toll-подобного рецептора 2Arg753Gln связан с повышенным уровнем синтеза специфических иммуноглобулинов Е у больных аллергическими заболеваниями / Н.Л. Куценко, О. В. Из-
майлова, Л. Э. Веснина // Аллергология и иммунология. - 2011. -Т.12, №3. - С. 233 - 236.
16. I Davila, J Mullol, M Ferrer, J Bartra, A del Cuvillo, J Mon-toro, I Jauregui, J Sastre, A Valero; Genetic Aspects of Allergic Rhinitis // J Investig Allergol Clin Immunol. - 2009. -Vol. 19., Suppl. 1. - P. 25-31
17. Presymptomatic differences in Toll-like receptor function in infants who have allergy / S.L. Prescott, P. Noakes, B.W.Y. Chow [et al.] // J. Allergy Clin. Immunol. - 2008. -V. 122, № 2. - P. 391-399
18. Human CD4+ CD25+ regulatory T cells: proteome analysis identifies galectin -10 as a novel marker essential for their anergi and suppressive function//Kubach I.,Lutter P., Bopp T. [et al.] //Blood.- 2007.-Vol.110(5).-P.1550-1558
ENGLISH VERSION: FEATURES OF THE IMMUNE STATUS OF PATIENTS WITH ALLERGIC RHINITIS, DEPENDING ON TLR 2,4 AND 10 «GALECTIN» GENE POLYMORPHISM
Sakevych V. D., Shlykova O.A., Kaidashev I. P.
Research Institute for Genetic and Immunological Bases of Pathology and Pharmacogenetics of Higher State Education Establishment of Ukraine " Ukrainian Medical Stomatological Academy, Poltava
The study presented theoretical generalization and a new resolve of scientific task in Immunology and Allergology concerning the definition of genetic determinism in allergic rhinitis by examining the role of Toll-ike receptors of innate immunity by polymorphisms TLR2 (rs5743708), TLR 4 (rs4986790) and CLC-10 (rs420297). In examined patients in 76% of cases, AR is predominantly hereditary nature of the mother (36°%), mostly begin in childhood and adolescence (88%) and 44%o is accompanied by other allergic diseases. In the study of the immune status of patients with AR in 15°% of patients one observed moderate and high eosinophilia, increase the average level of total immunogiobuin E, which is significantly higher values have been established in patients with moderate and severe forms of motion (p = 0.0008) increase in the relative number of CD4 CD25 MPER Foxp3 cells with reducing the amount of IL-10 and IL-4 increase. Significant differences between the frequencies of genotypes in the control group and patients with AR gene polymorphism by TLR 4 (Asp299Giy) were found. For the first time the population-based prevalence of polymorphism rs420297 gene «Galectin»u-10 among persons living in Poltava region (SS-76%, ST-22%, TT-2%) revealed significant differences between the frequencies of genotypes in the control group and patients with AR (p = 0.04), rs420297 polymorphism of the gene CLC-10 was significantly more common in patients wtth RA. Significant association between the presence of polymorphic alleles of the gene CLC-10 levels and CD4+, CD4+ CD25+, in the group of homozygous carriers of polymorphic alleles T and C alleles of the gene CLC-10 were revealed. The authentic association between the presence of polymorphic alleles of the gene CLC-10 levels and CD4+CD25+Foxp3+, CD4+was found.
Keywords: allergic rhinitis, cellular and humoral immunity polymorphism, Toll-like receptors, «Galectin»-10.
Allergic diseases, including asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis every year become more urgent and serious problem. Allergic rhinitis (AR) is a disease characterized by IgE-mediated immunological inflammation that is caused by penetration of allergens on the nasal mucosa [1].
Currently recognized point of view, according to which AR is a multifactorial disease (MFZ). Now prevalent concept is an imitation of allergic diseases and identified quite a number of genes that mediate their demonstration. However, the results of numerous studies are controversial molecular genetic basis of disease formation yet insufficiently studied. This turns the AR into a serious medical and social problem and necessitates the study of the causes and im-munological mechanisms of this disease to develop adequate therapeutic and preventive measures, taking into account ethnicity, immunological reactivity and genetic characteristics of patients.
The aim of the study was to determine the role of polymorphisms of genes that control the structural and regulatory elements of nonspecific resistance of the organism (Toll-like receptors: 2258G /A gene TLR2 (rs5743708), 896A / G gene TLR4 (rs4986790) and «Galectin»u-10 gene (rs420297 C / T)) in the pathogenesis of RA, to further the understanding of the immunological mechanisms of this disease.
Materials and methods.
To solve the nominated tasks examined 45 patients aged 19 to 65 patients with AR at the stage of clinical remission who were dispensary in outpatient department of the Fourth City Hospital and Allergic department of Poltava Regional Hospital im.Sklifosovskoho. Comparison group consisted of 95 healthy persons from DNA of-bank Research-Research Institute for Genetic and im-munological bases of pathology and pharmacogenetics State Higher School of Ukraine "Ukrainian Medical
To cite this English version: Sakevych V. D., Shlykova O.A., Kaidashev I. P. Features of the immune status of patients with allergic rhinitis, depending on the gene polymorphism TLR 2,4 and 10 halektynu/ /Problemy ekologii ta medytsyny. - 2014. - Vol 18, № 3-4. - P. 39 -43.
