CC BY
55
ISSN 2304-9081
Учредители: Уральское отделение РАН Оренбургский научный центр УрО РАН
Бюллетень Оренбургского научного центра
УрО РАН
2015 * № 3
Электронный журнал On-line версия журнала на сайте http://www.elmag.uran.ru
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2015, № 3 © Ю.В. Захарова, А.С. Сухих, 2015 УДК 577:615.31
Ю.В. Захарова, А.С. Сухих
ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК БИФИДОБАКТЕРИЙ С РАЗНОЙ ГИДРОФОБНОСТЬЮ
Кемеровская государственная медицинская академия, Кемерово, Россия
Цель. Изучить состав жирных кислот бифидобактерий с разной гидрофобностью для установления механизмов нарушений адгезивной активности микроорганизмов.
Материалы и методы. Использовали культуры Bifidobacterium bifidum. Гидрофоб-ность бифидобактерий оценивали по Rosenberg et al. с модификациями L-Q. Wang et al. [1]. Липидная фракция выделена из бульонной культуры бифидобактерий экстракцией смесью хлороформ : н-гексан (1:1). Полученный экстракт подвергали метилированию. Метилированные пробы анализировали на хроматомасс-спектрометре Agilent 7000B.
Результаты. У высокогидрофобных бифидобактерий обнаружили разветвленные жирные кислоты - изопентадекановую (isoC15:0) и метил-тетрадекановую (13Me-C14:0) кислоты. При средней гидрофобности установлено высокое содержание изопальмитино-вой (isoC16:0) и стеариновой (С18:0) кислот. Низкогидрофобные штаммы B. bifidum характеризовались низким содержанием мононенасыщенных жирных кислот.
Заключение. Гидрофобность бифидобактерий определялась различным содержанием у них ненасыщенных и разветвленных жирных кислот.
Ключевые слова: бифидобактерии, ГХ-МС, жирные кислоты, гидрофобность.
J.V. Zakharova, A.S. Sukhikh
FATTY ACID BIFIDOBACTERIUM WITH DIFFERENT HYDROPHOBICITY
Kemerovo State Medical Academy, Kemerovo, Russia.
Objective. To study the composition of fatty acids of the membranes of bifidobacteria with different hydrophobicity to establishing mechanisms of the adhesive activity of microorganisms.
Materials and methods. The study used culture Bifidobacterium bifidum. The hydrophobicity of bifidobacteria was studed by Rosenberg et all. with modifications L-Q Wang et all. The lipid fraction extracted from the broth culture of bifidobacteria by extraction with a mixture of chloroform : n-hexane (1:1). The resulting extract was subjected to methylation. Methylated samples were analyzed on gas chromatography / mass spectrometer Agilent 7000B.
Results. Only high hydrophobicity bifidobacteria found isopentanol (isoC15:0) and me-thyl-tetradecanoyl (13Me-C14:0) acids. With the medium hydrophobicity of a high content isopalmitic (isoC16:0) and stearic (C18:0) acids is established. Low hydrophobicity strains B. bifidum are characterized by little content of monounsaturated fatty acids.
Conclusions. The hydrophobicity of bifidobacterium is determined by the different contents unsaturated and branched fatty acids.
Keywords: bifidobacterium, GC-MS, fatty acid, hydrophobicity.
Введение
Жирные кислоты у микроорганизмов являются не только структурным компонентом клеточной стенки, но они также определяют физико-химические свойства клетки, такие как текучесть, устойчивость к температурам, гидрофобность [1, 2]. Ферменты синтеза жирных кислот локализованы у бактерий между цитоплазмой и внутренней стороной плазматической мембраны. Их активность определяется внешними факторами, что обусловливает различие в путях синтеза жирных кислот [2], и из-за чего меняется относительное содержание различных жирных кислот, длина их цепей, насыщенность. Известно, что у анаэробных бактерий предшественником ненасыщенных жирных кислот (С 16:1, С18:1) служит Сю-ацилпереносящий белок (Сю-АПБ), а стимулируют их образование понижение температуры и уменьшение содержания кислорода (анаэробный путь синтеза). Кроме этого существует аэробный путь синтеза ненасыщенных жирных кислот из насыщенных. Он характерен для аэробных грамположительных бактерий. У некоторых грам-положительных бактерий помимо неразветвленных насыщенных жирных кислот присутствуют изо-, антеизо- и ю-алициклические жирные кислоты, которые придают текучесть мембране. Их синтез отличается от синтеза жирных кислот с неразветвленной цепью только использованием различных ацил-АПБ в качестве затравки для удлинения цепи и специфичностью ферментов, катализирующих конденсацию молекул. Предшественниками таких модифицированных затравок служат разветвленные 2-оксикислоты, экзогенные разветвленные короткоцепочечные карбоновые кислоты [2]. В связи с этим нельзя исключить, что любые изменения в микросимбиоценозе будут обусловливать различия в путях синтеза жирных кислот у бактерий и приводить к изменению поверхностных свойств микроорганизмов. Вариативность физико-химических свойств клеточных стенок микроорганизмов ведет, в свою очередь, к изменению способности бактерий колонизировать какой-либо биотоп и сорбировать на своей поверхности белки [3].
Известно более двухсот пятидесяти бактериальных жирных кислот, тогда как у человека их в 10 раз меньше. С помощью газовой хроматографии изучен состав жирных кислот большинства микроорганизмов, определены маркеры отдельных родов и видов бактерий, то есть исследование жирно-кислотного состава бактериальных липидов осуществляют с целью идентификации и таксономии микроорганизмов, а также для диагностики инфекций
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2015, № 3 и дисбиотических нарушений непосредственно по клиническому материалу [4]. При этом недостаточно изучены вопросы влияния структуры и состава жирных кислот на биологические свойства микроорганизмов, от которых зависит стабильность микросимбиоценоза, а также длительность и глубина микроэкологических нарушений. Поэтому актуальным является исследование жирнокислотного состава клеточных стенок бактерий при различной гидрофобности, что позволит уточнить некоторые механизмы колонизации слизистых оболочек доминантными микросимбионтами и генез микроэкологических нарушений.
Цель исследования - изучить состав жирных кислот бифидобактерий с разной гидрофобностью для установления механизмов нарушений адгезивной активности микроорганизмов.
Материалы и методы
Объектом исследования были культуры Bifidobacterium bifidum, выделенные из кишечника здоровых детей. Выделение бифидобактерий проводили рутинным бактериологическим методом. Для создания анаэробных условий применяли анаэростат (BBL, США) и газогенерирующие пакеты (НПО «Новое дело», Санкт-Петербург). Идентификацию бактерий осуществляли на основании морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств. Последние изучали с использованием коммерческих тест-систем ANAERO-TEST 23 (Lachema, Чехия). Гидрофобность бифидобактерий оценивали по Rosenberg et al. с модификациями L-Q Wang et al. [1]. Для этого бифидобатерии выращивали 24 часа на жидкой Бифидум-среде (г. Оболенск), а затем центрифугировали при 8 000 g в течение 10 мин. Бактериальную массу дважды отмывали фосфатным буфером и ресуспендировали в том же растворе. Определяли оптическую плотность (А) раствора при длине волны 600 нм. Затем к 3 мл бактериальной суспензии добавляли 1 мл додека-на. Фазы перемешивали на Vortex в течение 2 минут и оставляли на 1 час при температуре 37ОС для их разделения. Определяли оптическую плотность (А) водной фазы при 600 nm. Аффинитет к углеводородам рассчитывали как процент гидрофобности (Н%) по формуле Н%=[(Ао-А)/Ао)]Х 100, где А0 и А - оптическая плотность до и после обработки бактериальной суспензии доде-каном. Штаммы считали высокогидрофобными при Н=60% и более, средне-гидрофобными при Н=40-59%, низкогидрофобными при Н<39%.
Высокоэффективную хроматографию (ВЭЖХ) осуществляли на хроматографе Цвет Яуза-04 с амперометрическим детектором (НПО «Химавтома-тика»); материал рабочего электрода - стеклоуглерод; колонка Gemini C18 (5 мкм, 4,6 x 250 мм (Phenomenex, США). Предколонка Analitical Guard (KJO -4282) Gemini С18 (Phenomenex, США). Объем петли 20 мкл. Скорость потока 1, давление 57+ 1 bar. Управление прибором и обработка полученных данных осуществлялась с использованием программного обеспечения МультиХром, версия 3.1.1550.
Состав бактериальных липидов определяли с помощью газожидкостной хроматографии. Липидная фракция выделена из отмытой изотоническим раствором NaCI бульонной культуры бифидобактерий. Избирательную со-любилизацию гидрофобных поверхностных слоев клеточной стенки B. bifi-dum осуществляли смесью хлороформ : гексан (1:1). Полученный экстракт подвергали метилированию. Образец объёмом 1 мл помещали в виалу объемом 1,5 мл, растворитель отдували азотом досуха. К сухому остатку добавляли 500 мкл 3% раствора H2SO4 в MeOH. К полученому раствору добавляли внутренний стандарт (10 мкг ундеценовой кислоты). Затем образец нагревали при 900С в течение часа. Далее проводили экстракцию 700 мкл гексана. Объем отобранной гексановой фракции концентрировали отдувкой растворителя до объема 200 мкл. Полученные пробы, содержащие жирные кислоты в виде метиловых эфиров, использовали для анализа. Метилированные пробы анализировали на хроматомасс-спектрометре Agilent 7000B; объем пробы 2 мкл, ввод без деления потока. Колонка: ZB-WAX, 30м*0.25мм*0.25мкм, Условия хроматографирования: Oven Program 50°C for 0 min then 8°С/мин to 260°С-5мин, Б^^^Ыл/мин.
Для статистического анализа использовали пакет прикладных программ Statistica (версия 6.1 лицензионное соглашение BXXR 006ВО92218 FAN 11). Статистическая обработка информации строилась с учетом характера распределения данных, которое определяли с помощью построения гистограмм. Если закон распределения исследуемых числовых показателей отличался от нормального, достоверность различий в парных независимых совокупностях определяли с помощью критерия Манна-Уитни. В случае совпадения распределения показателей с нормальным достоверность различий определяли с помощью критерия Стъюдента. Различия считали значимыми при p<0,05.
Результаты и обсуждение
Относительно недавно у Bifidobacterium bifidum был обнаружен поверхностный липопротеин Bop A, который является видоспецифичным и участвует в адгезии на эпителиальных клетках кишечника [5, 6]. Для его выделения была использована высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Следует отметить, что метод ВЭЖХ следует рассматривать как хроматографический метод, позволяющий эффективно разделять сорбаты в нативном состоянии. Данное свойство особенно актуально при разделении и анализе веществ биологического происхождения. Используемый в нашем исследовании обращённо-фазовый вариант ВЭЖХ с амперометрическим детектированием, позволяет селективно определять молекулы веществ, которые проявляют свойства восстановителей. Существенным достоинством данного
детектора является высокая чувствительность, что позволяет визуализиро-
12
вать вещества в концентрации менее 0,5 пмоль (10- ) [7, 8]. Использование изократического режима элюирования на обращенно-фазовом сорбенте позволяет осуществить разделение липидов одного класса, отличающихся числом атомов углерода в жирной цепи.
Липопротеиновый комплекс, выходящий из колонки около 5,15 мин, определяется у всех анализируемых штаммов бифидобактерий. Липиды характеризуются преобладанием жирных кислот с максимальной степенью насыщенности алкильных остатков.
При этом наибольшее число липидов, содержащих насыщенные жирные кислоты, обнаружено у среднегидрофобного штамма бактерий (рис. 1).
Рис. 1. Хроматограмма липопротеинов среднегидрофобного штамма бифидобактерий в ОФ ВЭЖХ-АД.
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2015, № 3 Их количество обозначено суммарным откликом детектора 239,3 нА*сек, тогда как у высокогидрофобных бифидобактерий данный показатель соответствует 25,7 нА*сек.
Высокая гидрофобность последних связана с компонентом, время удерживания которого составляет 13,38 мин, а отклик детектора - 31,05 нА*сек (рис. 2).
Рис. 2. Хроматограмма липопротеинов высокогидрофобного штамма бифидобактерий в ОФ ВЭЖХ-АД.
Данный компонент не фиксируется у низкогидрофобного штамма. Более того, низкогидрофобный штамм В. характеризуется низкой селективностью разделяемых компонентов (рис. 3), что, видимо, связано с низким содержанием в структуре мембраны у данного штамма гидрофобных компонентов, в первую очередь омыляемых жиров и их производных.
Рис. 3. Хроматограмма липопротеинов низкогидрофобного штамма бифидобактерий в ОФ ВЭЖХ-АД.
Особенности структуры и компонентного состава липидов поверхностного липопротеина бифидобактерий изучали с помощью газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектором. В результате проведенных исследований установлено, что масса жирных кислот на 0,01 г сухого остатка у штаммов бактерий с высокой и средней гидрофобностью статистически не отличалась и составляла 30,4 и 33,6 мкг соответственно ф=0,2). Тогда как у бифидобактерий с низкой гидрофобностью масса жирных кислот была снижена в 2 раза (до 14,5 мг, p=0,03).
Не зависимо от гидрофобности в составе клеточной стенки бифидобактерий преобладали насыщенные жирные кислоты. У высоко и низкогидрофобных штаммов на долю насыщенных жирных кислот приходилось 64,2 и 71,3% соответственно, тогда как при средней гидрофобности бактерий доля этих кислот была наибольшей и составляла 91,1%.
Среди насыщенных жирных кислот у бифидобактерий были обнаружены следующие: лауриновая (С12:0), миристиновая (С14:0), пентадекановая (С15:0), пальмитиновая (С16:0), гептадекановая (С17:0), стеариновая (С18:0), арахиновая (эйкозановая) (С20:0) кислоты. Также среди них присутствовали метилированные кислоты или кислоты с разветвленной цепочкой: 12-метил-тетрадекановая (12Ме-С14:0), 13-метил-тетрадекановая (13Ме-С14:0), изо-пентадекановая (/^оС15:0), изопальмитиновая (/^оС16:0). Разветвленные или алициклические жирные кислоты, благодаря особенностям химического строения, у грамположительных бактерий выполняют адаптивную функцию, придавая текучесть и пластичность мембране [4]. Такая же функция присуща и ненасыщенным жирным кислотам, наибольшая доля которых обнаружена у бифидобактерий с высокогидрофобными свойствами (35,8%), несколько меньше у штаммов с низкой гидрофобностью (28,7%). Самое низкое содержание ненасыщенных жирных кислот регистрировали при средней гидро-фобности, их доля в общей структуре жирных кислот не превышала 8,9%.
Среди мононенасыщенных жирных кислот у бифидобактерий присутствовали миристоолеиновая (С14:1), пентадеценовая (С15:1), пальмитолеи-новая (С16:1), н-гептадеценовая (С17:1), олеиновая (С18:1). Также были обнаружены полиненасыщенные жирные кислоты: гексадекадиеновая (С16:2) и линолеваевая (С18:2).
Количественный состав некоторых жирных кислот бифидобактерий с разной гидрофобностью не отличался друг от друга. Так, содержание мири-
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2015, № 3 стиновой кислоты (С14:0) у высоко- и низкогидрофобных штаммов составляло 2,7 и 2,9 мкг соответственно, тогда как при средней гидрофобности не превышало 1,6 мкг, однако, разница была статистически не значима (р=0,1). Также у штаммов с разной гидрофобностью не было статистически значимых отличий по содержанию пентадекановой (С15:0) и гептадекановой кислот (С17:0), количество которых составило у высокогидрофобных культур по 0,7 мкг, у среднегидрофобных по 0,9 и 0,5 мкг и низкогидрофобных 1,1 и 0,4 мкг соответственно (р=0,07).
При анализе количества насыщенных жирных кислот у штаммов бифи-добактерий с разной гидрофобностью отмечали статистически значимые различия по содержанию изоформ, метилированных и длинноцепочечных жирных кислот, то есть тех форм, которые определяют жидкокристаллическое состояние мембраны (р=0,00). Установлено, что изопентадекановая кислота (1боС15:0) присутствовала только у высокогидрофобных бифидобактерий: у них же в большом количестве регистрировали 13-метил-тетраде-кановую кислоту (13Ме-С14:0), ее содержание составило 1,3 мкг (рис. 4).
Рис. 4. Интегрированная хроматограмма ГХ-МС жирных кислот высокогидрофобного штамма бифидобактерий.
У культур со средней гидрофобностью такую кислоту не детектировали, а при низкой гидрофобности отмечали небольшое ее содержание - 0,1 мкг. У среднегидрофобных бифидобактерий также отсутствовали 12-метил-тетрадекановая (12Ме-С14:0) и пальмитиновая (С16:0) кислоты, содержание которых у высоко- и низкогидрофобных штаммов колебалось в диапазоне 0,3-0,4 и 11,4-12,5 мкг соответственно. Жидкокристаллическое состояние
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2015, № 3 мембраны у среднегидрофобных бифидобактерий было связано с высоким содержанием изопальмитиновой (/^оС16:0) (20,4 мкг) и стеариновой (С18:0) (23,6мкг) кислот.
В составе мембраны среднегидрофобных бифидобактерий отсутствовали такие мононенасыщенные жирные кислоты, как миристоолеиновая (С14:1), пентадеценовая (С15:1), пальмитолеиновая (С16:1) и н-гептадеце-новая (С17:1), но была обнаружена только олеиновая (С18:1) кислота в количестве 1,4 мкг (рис. 5).
При высокой и низкой гидрофобности бактерий количество изопальмитиновой (/^оС16:0) кислоты не превышало 0,3 и 0,4 мкг соответственно, а масса стеариновой кислоты (С18:0) составляла 8,0 и 7,2 мкг соответственно.
Рис. 5. Интегрированная хроматограмма ГХ-МС жирных кислот среднегидрофобного штамма бифидобактерий.
При высокой гидрофобности бактерий в мембране регистрировали все вышеуказанные ненасыщенные жирные кислоты (рис. 4). Самое большое количество приходилось на пальмитолеиновую (С16:1) кислоту, ее масса составила 4,6 мкг. Данная кислота в наибольшем количестве из ненасыщенных присутствует в составе мембран бактерий многих таксономических групп, то есть полученные данные согласуются с данными литературы [4]. Также довольно часто у микроорганизмов обнаруживают олеиновую (С18:1) кислоту, содержание которой у высокогидрофобных бифидобактерий составило 3,8 мкг. Несколько меньше в составе мембраны содержалось миристоолеиновой (С14:1) (2,7 мкг) и гептадеценовой (С17:1) (0,5 мкг) кислот, а пентадеценовая кислота (С15:1) у высокогидрофобных штаммов регистрировалась в количе-
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2015, № 3 стве не более 0,1 мкг.
Установлено, что у бифидобактерий с низкой гидрофобностью содержание всех жирных кислот было снижено по сравнению с высокогидрофобными культурами (рис. 6). При этом из мононенасыщенных кислот также в наибольшем количестве содержалась пальмитолеиновая (С16:1) (3,7 мкг) и олеиновая (С18:1) (3,2 мкг) кислоты.
Миристоолеиновая (С14:1) кислота содержалась в количестве 0,6 мкг. Наименьшей была масса пентадеценовой (С15:1) и гептадеценовой (С17:1) кислот, она составила по 0,4 мкг.
Рис. 6. Интегрированная хроматограмма ГХ-МС жирных кислот низкогидрофобного штамма бифидобактерий.
Полиненасыщенная линолевая (С18:2) кислота присутствовала в составе липидов всех изученных штаммов бифидобактерий. Максимальное ее количество регистрировалось при высокой гидрофобности бактерий и составляло 3,6 мкг; в 2 раза меньше ее содержалось у среднегидрофобных культур бифидобактерий (1,8 мкг); минимальное содержание данной кислоты обнаружено у низкогидрофобных штаммов (1,3 мкг).
Заключение
В результате проведенных исследований установлено, что в целом количество жирных кислот было снижено у низкогидрофобных штаммов (р=0,03). Как и у большинства микроорганизмов, у бифидобактерий в мембранах содержались как насыщенные, так и ненасыщенные жирные кислоты с длиной цепи от 14 до 20 атомов углерода.
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2015, № 3 Известно, что присутствие у бактерий ненасыщенных и разветвленных жирных кислот увеличивает текучесть мембраны микроорганизмов и способствует повышению адгезии [1, 4]. Действительно, полученные данные свидетельствуют, что у высокогидрофобных бифидобактерий отмечается повышенное содержание и разнообразие ненасыщенных жирных кислот с одной или двумя двойными связями. Кроме того при высокой гидрофобности у бифидобактерий обнаружены разветвленные жирные кислоты - изопентадека-новая кислота (woC15:0) и 13-метил-тетрадекановая кислота (13Ме-С14:0). У штаммов бактерий со средней гидрофобностью из ненасыщенных присутствовали только олеиновая (С18:1) и линолевая (С18:2) кислоты в небольших количествах. Гидрофобность среднего уровня у штаммов бифидобактерий была связана с изопальмитиновой (woC16:0) кислотой, содержание которой было в 20 раз больше, чем у штаммов с высокой гидрофобностью. При низкой гидрофобности бактерий жидкокристаллическое состояние мембраны определяли ненасыщенные жирные кислоты, содержание которых было снижено, по сравнению с высокогидрофобными культурами. При этом отмечали сходство состава ненасыщенных жирных кислот при низкой и высокой гид-рофобности, однако у штаммов бифидобактерий с низкой гидрофобностью в клеточной стенке отсутствовали метилразветвленные жирные кислоты.
Таким образом, в основе механизма изменения поверхностных свойств бактериальных клеток лежат вариации путей синтеза ненасыщенных и разветвленных жирных кислот.
ЛИТЕРАТУРА
1. Wang L-Q., Meng X-Ch., Zhang B-R. Influence of cell surface properties on adhesion ability of bifidobacteria. Word Journal of Microbiology and Biotechnology. 2010. 26: 1999-2007.
2. Schneiter R., Toulmay A. The role of lipids in the biogenesis of integral membrane proteins Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. 73: 1224-1232.
3. Бухарин О.В., Сгибнев А.В., Черкасов С.В. Активные формы кислорода как фактор, регулирующий поверхностные свойства бактерий. 2008. 4: 3-6.
4. Будников Г.К. Химический анализ в медицинской диагностике. Москва: Наука, 2010. 504 с.
5. Guglielmetti S, Tamagnini I, Mora D et al. Implication of an outer surface lipoprotein in adhesion of Bifidobacterium bifidum to Caco-2 cells. Applied and Environmental Microbiology. 2008. 15 (74): 4695-4702.
6. Gleinser M, Grimm V, Zhurina D et al. Improved adhesive properties of recombinant bifido-bacteria expressing the Bifidobacterium bifidum-specific lipoprotein Bop A. Microbial Cell Factories. 2012. 11 (80): 1-14.
7. Korytowski W., Girotti A. W. Lipid hydroperoxide analysis by reverse-phase highperformance liquid chromatography with mercury cathode electrochemical detection. Analysis of Free Radicals in Biological Systems. Springer, 1995: 165-183.
8. Yashin Ya. I., Yashin A. Ya. Analytical potentialities of amperometric detection in HPLC.J. Analytical Chemistry. 2003. 58 (7): 649-649.
Поступила 3.09.2015
(Контактная информация: Захарова Юлия Викторовна - к.м.н., доцент кафедры микробиологии иммунологии и вирусологии Кемеровской государственной медицинской академии; адрес: 650056, г. Кемерово, ул. Ворошилова, 22А, кафедра микробиологии, иммунологии и вирусологии; тел. (3842) 73-28-71; E-mail: [email protected]).
LITERATURA
1. Wang L-Q., Meng X-Ch., Zhang B-R. Influence of cell surface properties on adhesion ability of bifidobacteria. Word Journal of Microbiology and Biotechnology. 2010. 26: 1999-2007.
2. Schneiter R., Toulmay A. The role of lipids in the biogenesis of integral membrane proteins Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. 73: 1224-1232.
3. Buharin O.V., Sgibnev A.V., Cherkasov S.V. Aktivnye formy kisloroda kak faktor, reguliru-jushhij poverhnostnye svojstva bakterij. 2008. 4: 3-6.
4. Budnikov G.K. Himicheskij analiz v medicinskoj diagnostike. Moskva: Nauka, 2010. 504 s.
5. Guglielmetti S, Tamagnini I, Mora D et al. Implication of an outer surface lipoprotein in adhesion of Bifidobacterium bifidum to Caco-2 cells. Applied and Environmental Microbiology. 2008. 15 (74): 4695-4702.
6. Gleinser M, Grimm V, Zhurina D et al. Improved adhesive properties of recombinant bifido-bacteria expressing the Bifidobacterium bifidum-specific lipoprotein Bop A. Microbial Cell Factories. 2012. 11 (80): 1-14.
7. Korytowski W., Girotti A. W. Lipid hydroperoxide analysis by reverse-phase highperformance liquid chromatography with mercury cathode electrochemical detection. Analysis of Free Radicals in Biological Systems. Springer, 1995: 165-183.
8. Yashin Ya. I., Yashin A. Ya. Analytical potentialities of amperometric detection in HPLC.J. Analytical Chemistry. 2003. 58 (7): 649-649.
Образец ссылки на статью:
Захарова Ю.В., Сухих А.С. Жирные кислоты клеточных стенок бифидобактерий с разной
гидрофобностью. Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН. 2015. 3: 1-12
[Электронный ресурс] (URL: http://elmag.uran.ru:9673/magazine/Numbers/2015-3/Articles/
ZJV-SAS-2015-3.pdf).
