CC BY
99
Захарова Ю.В.
Кемеровская государственная медицинская академия,
г. Кемерово
Цель - изучение биологических свойств бифидофлоры для установления механизмов нарушения колонизационной резистентности слизистой кишечника у ВИЧ-инфицированных детей.
Выделено и идентифицировано 57 штаммов бифидобактерий от ВИЧ-позитивных и 48 штаммов от ВИЧ-негативных детей. Изучены факторы специфической и неспецифической адгезии, колонизационный потенциал, факторы антагонизма, бифидофлоры.
Результаты. Установлено, что у ВИЧ-инфицированных детей нарушаются механизмы неспецифической адгезии, обусловленные преобладанием низкогидрофобных штаммов. Исследования показали снижение количественного содержания бифидобактерий в микробиоценозе ВИЧ-инфицированных детей. При этом бифидофлора отличалась низкой лизоцимпродуцирующей активностью.
Ключевые слова: бифидобактерии; биологические свойства; микробиоценоз.
Zakharova J.V.
Kemerovo State Medical Academy, Kemerovo
BIFIDOBACTERIA PROPERTIES IN HIV-INFECTED PEOPLE
Aim - To study biological properties of bifidobacteria for estimation of intestinal colonization resistance disturbance mechanism in HIV-infected children.
57 strains from HIV-infection children and 48 strains from non-HIV-infected children were isolated and identified. Factors of non-specific (docking) and specific (anchoring) adhesion ability, factors of colonization and antagonism of bifidobacteria were determined. Results. In HIV-infected children disturbance of non-specific (docking) adhesion ability mechanism is due to low level of surface hydrophobicity domination. Our results indicated decrease of bifidobacteria number in microbiocenosis of HIV-infected children. Bifidoflora is characterized by low lysozyme activity level.
Key words: bifidobacteria; biological properties; microbiocenosis.
Довольно часто оппортунистические инфекции цита (СПИД) у ВИЧ-инфицированных [1-3]. Тра-
являются признаком клинической манифес- диционно их возникновение связывают с несостоя-
тации синдрома приобретенного иммунодефи- тельностью иммунных факторов защиты [4]. Одна-
Medicine
ко совсем недавно была выдвинута новая теория развития оппортунистических инфекций у ВИЧ-инфицированных людей — «гипотеза нарушенной микрофлоры», согласно которой основным фактором, запускающим развитие таких инфекций, является нарушение нормальной микрофлоры — естественной защиты против микробов-оппортунистов [5].
При этом микроэкологические нарушения кишечника вне зависимости от причины, которые вызвали их, имеют сходный характер. Обычно отмечают снижение числа доминантных микросимбионтов и увеличение интенсивности колонизации слизистой условно-патогенными бактериями и грибами. Однако также известно, что в процессе формирования ассоциативных сожительств микроорганизмов меняются их биологические свойства [6]. При этом чаще всего исследования касаются условно-патогенных микросимбионтов, а данные по функциональным характеристикам у доминантной микрофлоры немногочисленны, особенно в отношении микробиоты у ВИЧ-инфицированных пациентов. У них остается не изученной видовая структура доминантных микросим-биотов, их способность к адгезии, колонизации в условиях иммунодефицита, антагонистические свойства по отношению к условно-патогенным микроорганизмам, что затрудняет определение патогенетических звеньев в развитии микроэкологических нарушений и оппортунистических инфекций при ВИЧ-инфекции. Также знание биологических свойств доминантной микрофлоры необходимо для определения конкретных точек приложения для средств и методов коррекции у ВИЧ-позитивных пациентов.
Цель исследования — изучение биологических свойств бифидофлоры для установления механизмов нарушения колонизационной резистентности слизистой кишечника у ВИЧ-инфицированных детей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование было построено по типу «случай-контроль». В опытную группу вошли 63 ребенка с ВИЧ-инфекцией (П-Ш степени, П-Ш иммунной категории), средний возраст которых составил 2,3 ± 0,2 года. Диагноз ВИЧ-инфекция был выставлен на основании данных эпидемиологического анамнеза (перинатальный контакт) и подтвержден результатами ИФА, ПЦР, иммуноблотинга. Группа сравнения включала 50 ВИЧ-негативных относительно здоровых детей. Группы были сопоставимы по возрасту и полу.
Общую оценку состояния кишечного микробиоценоза проводили с помощью количественного бактериологического метода. Объектом исследования были 54 штамма бифидобактерий, выделенных из со-
держимого толстой кишки детей с ВИЧ-инфекцией и 42 штамма от детей группы сравнения. Выделение бифидобактерий проводили на Бифидум-среде. Количественный уровень выражали в КОЕ/г. Для создания анаэробных условий применяли анаэрос-таты и газогенерирующие пакеты. Идентификацию бактерий осуществляли на основании морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств. Последние изучали с использованием коммерческих тест-систем ANAERO-TEST 23. Проведено 480 опытов по изучению биологических свойств бифидобактерий. Изучены распространенность и количественные характеристики факторов неспецифической и специфической адгезии, распространенность и направленность антагонистических взаимоотношений бифидофлоры, уровень кислотообразования и титры продуцируемого лизоцима.
Неспецифическую адгезию бифидобактерий оценивали по величине гидрофобности клеточной поверхности по Rosenberg et al. с модификациями Wang L.-Q. et al. [7]. Аффинитет к углеводородам рассчитывали как процент гидрофобности (Н%) по формуле Н% = [(А0 - А) / А0)] х 100, где Ао и А — оптическая плотность до и после обработки бактериальной суспензии додеканом. Штаммы считали высокогидрофобными при Н = 60 % и >, среднегидрофобными при Н = 40-59 %, низкогидрофобными при Н < 39 %.
Специфическую адгезию микроорганизмов изучали согласно методике В.И. Брилиса [8]. Оценку результатов опыта вели по индексу адгезивности микроорганизма (ИАМ), который характеризует среднее количество микробных клеток на одном участвующем в адгезивном процессе эритроците. Микроорганизмы считали неадгезивными при ИАМ < 1,75; низкоадгезивными — от 1,76 до 2,5; среднеадгезивными — от 2,51 до 4,0 и высокоадгезивными — при ИАМ > 4,0.
Активность кислотообразования бифидобактерий определяли титрометрическим методом. Окончательный результат выражали в градусах Тернера: Т° = А х К х 10, где А — количество 0,1 н щелочи, пошедшее на титрование 10 мл исследуемой жидкости, К — поправка к титру, определяемая при титровании 0,1 н раствора щелочи 0,1 н соляной кислотой (в опыте составило 1,02), Т° — величина, выражающая количество мл 0,1 н щелочи, пошедшей на титрование 10 мл исследуемого образца. Штаммами с низкой кислотообразующей активностью считали при Т° = до 50 со средним кислотообразованием Т° = 51100, с высоким кислотообразованием Т° = 101 и выше.
Антагонистическую активность микроорганизмов определяли методом отсроченного антагонизма на плотной питательной среде. На чашку с плотной питательной средой петлей 2 мм наносили полоску культуры бактерий и инкубировали 24-48 часов с учетом типа дыхания. Далее к выросшей культуре подсевали участников ассоциаций, предварительно выращенных на скошенном мясо-пептонном агаре в течение 18 часов. Посев производили петлей диаметром 1 мм
Корреспонденцию адресовать:
ЗАХАРОВА Юлия Викторовна,
650029, г. Кемерово, ул. Ворошилова, 22а, ГБОУ ВПО КемГМА Минздрава России. Тел.: 8 (3842) 73-28-71.
E-mail: [email protected]
32 T. 12 № 3 2013 MedicLn^ OMSurnia
inKuzbass вК^бага
в направлении от зоны роста изучаемых бактерий, не касаясь ее и перпендикулярно ей. Чашки инкубировали при температуре 37°С 24 часа. Учет результатов вели по величине зоны отсутствия роста микроба-ассоцианта в мм.
Титр продуцируемого бифидобактериями лизоци-ма определяли полуколичественным методом. Культуру выращивали в анаэробных условиях на плотной среде Блаурокк, с последующим пересевом единичной колонии каждой культуры в 2 мл жидкой среды Блаурокк. Через 24 часа после культивирования при 37°С осуществляли центрифугирование при 8000 gm для разделения бактериальной массы и культуральной жидкости. Полученную культуральную жидкость титровали от 1 : 1 до 1 : 32. В каждую пробирку вносили по 1 мл стандартизированной взвеси Micrococcus lysodeiticus и помещали в термостат на 3 часа. Результат оценивали по наличию лизиса индикаторной культуры. В качестве контролей использовали стандартизированную взвесь микрококка без лизо-цима (отрицательный) и с добавлением лизоцима (положительный).
Для статистического анализа использовали пакет прикладных программ Statistica (версия 6.1 лицензионное соглашение BXXR 006ВО92218 FAN 11). Количественные признаки представлены в виде M ± m, где М — среднее значение, m — стандартная ошибка среднего. Статистическая обработка информации строилась с учетом характера распределения данных, которое определяли с помощью построения гистограмм. Если закон распределения исследуемых числовых показателей отличался от нормального, достоверность различий в парных независимых совокупностях определяли с помощью критерия Манна-Уитни. В случае совпадения распределения показателей с нормальным достоверность различий определяли с помощью критерия Стъюдента. Сравнение качественных признаков в контрольных и опытных группах проводили с помощью критерия х2. Различия считали значимыми при p < 0,05. Для анализа связей между колонизационным уровнем бактерий и их адгезивной активностью применяли коэффициент корреляции Спирмена.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Взаимодействие между микрофлорой и слизистой кишечника начинается с адгезии, которая делится на неспецифическую и специфическую. Неспецифическая адгезия (docking) обратима и обусловлена физико-химическими особенностями молекул, в том числе и гидрофобностью [7]. Гидрофобность является
проявлением сил Ван-дер-Ваальса и в настоящее время исследуется как свойство, позволяющее бактериям не только взаимодействовать с углеродсодержащими материалами, но и со слизистой кишечника.
При изучении гидрофобности бифидобактерий, выделенных от ВИЧ-позитивных и ВИЧ-негативных детей, установлены статистически значимые различия в структуре гидрофобности бифидофлоры (х2 = 13,83; p = 0,00). Так, среди бифидобактерий, изолированных от детей с ВИЧ-инфекцией, преобладали штаммы со средней (53,7 %) и низкой (44,44 %) гидрофобностью, тогда как к высокогидрофобным культурам были отнесены только 1,85 % штаммов. От детей группы сравнения в большинстве случаев выделяли высокогидрофобные штаммы (42,86 %), 35,71 % штаммов были отнесены к среднегидрофобным, а к низкогидрофобным — только 21,43 % штаммов.
Специфическая адгезия (anchoring) бифидофло-ры обусловлена наличием пилеподобных структур, идентичных по строению с пилями других грампо-ложительных бактерий, длиной от 100 нм. Продукция этих факторов адгезии зависит от присутствия специфических гликанов в окружающей среде и является видовым признаком [9]. Пилеподобные структуры бифидофлоры отличаются высокой степенью комплементарности к гликопротеиновым рецепторам слизистой кишечника, которые по строению соответствуют гликопротеинам эритроцитов 0(I) группы крови [9]. Поэтому специфическая адгезия бактерий носит необратимый характер. В большинстве случаев бифидобактерии, полученные из кишечника детей с ВИЧ-инфекцией, были отнесены к средне- (46,3 %) и низкоадгезиным (35,2 %) культурам. Высокими адгезивными характеристиками обладали только 18,5 % штаммов. Бифидобактерии от ВИЧ-негативных детей в 57,1 % случаев проявляли среднюю адгезивную способность, тогда как 35,71 % штаммов были высокоадгезивными. К низкоадгезивным культурам были отнесены только 7,14 % штаммов, полученных от детей данной группы. Различия в структуре би-фидофлоры по показателям специфической адгезии были статистически значимы (х2 = 15,16; p = 0,01).
Установлено наличие прямой корреляционной связи между показателем специфической адгезии и количественным содержанием бифидобактерий в кишечнике (г = 0,52; p = 0,00). Иначе говоря, чем выше показатель специфической адгезии, тем более высокого количественного уровня достигает бифидофло-ра. Так как бифидобактерии у детей с ВИЧ-инфекций были отнесены к средне- и низкоадгезивным культурам, это обуславливает снижение количества данных микросимбионтов в кишечном микробиоценозе.
Сведения об авторах:
ЗАХАРОВА Юлия Викторовна, канд. мед. наук, доцент, кафедра микробиологии, иммунологии и вирусологии, ГБОУ ВПО КемГМА Минздрава России, г. Кемерово, Россия. E-mail: [email protected]
Information about authors:
ZAKHAROVA Julia Victorovna., candidate of medical sciences, docent, chair of microbiology, immunology and virology, Kemerovo State Medical Academy, Kemerovo, Russia. E-mail: [email protected]
Так, содержание бифидофлоры у детей с ВИЧ-инфекцией составило 7,2 ± 0,4 lg КОЕ/г, у детей из группы сравнения титры были статистически выше — 9,2 ± 0,2 lg КОЕ/г (p < 0,01).
На формирование определенного типа микробиоценоза оказывают влияние не только способность бифидобактерий обеспечивать механическую защиту слизистой от адгезии на ней штаммов условнопатогенных микроорганизмов, но и химические факторы антагонизма [10]. При изучении способности бифидобактерий к продукции кислот, образующихся при ферментации углеводов, у ВИЧ-инфицированных детей установлена низкая кислотообразующая активность бифидофлоры. Титруемая кислотность в среднем составила 74,14 ± 5,8°Т, тогда как в группе сравнения этот показатель достигал 111,21 ± 6,7°Т (р = 0,03). Также отмечали статистически значимую разницу в структуре кислотообразующих штаммов (х2 = 18,3; р = 0,04). Большинство штаммов бифидобактерий от детей с ВИЧ-инфекцией проявляли среднюю (53,7 %) или низкую (31,5 %) способность к кислотообразованию. От ВИЧ-негативных детей штаммы характеризовались средней (59,52 %) и высокой (40, 47 %) кислотообразующей способностью.
Помимо органических кислот, мощным фактором антагонизма бифидобактерий является лизоцим [10]. Более высокие уровни продуцируемого лизоцима установлены у бифидобактерий, выделенных от ВИЧ-негативных детей. Так, среди них встречались культуры, титры лизоцима у которых достигали 1:8 и 1 : 16. Максимальное разведение лизоцима, продуцируемое бифидофлорой от детей с ВИЧ-инфекцией, составило 1 : 4, в основном доминировали штаммы, у которых лизоцим регистрировали только в исходной культуральной жидкости.
Установлено, что, несмотря на более низкий уровень продукции органических кислот и лизоцима бифидобактериями от детей с ВИЧ-инфекцией, распространенность антагонизма в целом не отличалась от аналогичного показателя в группе сравнения и составила 72,7 ± 2,7 против 84,8 ± 3,1 на 100 культур, соответственно (р = 0,3). При этом бифидофлора у детей с ВИЧ-инфекцией чаще проявляла антагонизм не к условно-патогенным бактериям, а к факультативно-анаэробной индигенной микрофлоре — к Escherichia coli lac+ (38,2 %) и Enterococcus faecalis (24,6 %). Антагонистические взаимоотношения с ге-молизинпродуцирующими E. coli, представителями рода Staphylococcus и Klebsiella формировались достаточно редко (в 12,9 %, 22,2 % и в 3,7 % случаев, соответственно). Бифидобактерии от ВИЧ-негатив-ных детей вступали в антагонистические взаимоотношения, прежде всего, с условно-патогенными представителями микробиоценоза — с Klebsiella spp. (42,3 %) и Staphylococcus spp. (36,4 %). Различия в структуре антагонизма бифидофлоры к представителям ки-
ЛИТЕРАТУРА:
шечного микробиоценоза в сравниваемых группах были статистически значимы (х2 = 17,12; р = 0,02).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
До сегодняшнего дня существенно недооценена роль нормальной резидентной микрофлоры организма в развитии многих патологических процессов, в том числе при ВИЧ-инфекции. Развитие оппортунистических инфекций связывают с CD4-лимфоци-топенией, что и определяет клиническую стратегию в предупреждении развития инфекционных осложнений. Однако здесь существует множество противоречий, да и смертность пациентов со СПИД, принимающих антибиотики широкого спектра действия и антиретровирусную терапию, остается высокой [1, 3].
В настоящее время появилась «теория нарушенной микрофлоры», где основным фактором, запускающим оппортунистические инфекции у пациентов с ВИЧ-инфекцией и СПИД, является нарушение нормальной микрофлоры — естественной защиты макроорганизма. Следуя этой теории, нормальная микрофлора (не иммунная система, как многие полагают) — это главный фактор предотвращения СПИД-ассоци-ированных и других оппортунистических бактериальных и грибковых инфекций. Нарушение нор-мофлоры, а не дефицит Т-лимфоцитов, способствует высокому риску развития бактериальных и паразитарных оппортунистических инфекций [5].
Комплексная оценка биологических свойств фекальной бифидофлоры позволила определить, что в основе неполноценности механических механизмов защиты кишечного биотопа бифидобактериями от избыточного роста ассоциативных микросимбионтов лежит нарушение способности резидентов к специфической и неспецифической адгезии. Это, в свою очередь, обуславливает низкий количественный уровень бифидофлоры в кишечном микросимбиоцено-зе детей основной группы. Бифидобактерии у ВИЧ-инфицированных детей характеризовались низким уровнем кислотообразования и продукции лизоци-ма, поэтому в антагонистические взаимоотношения они вступали в основном с факультативно-анаэробными резидентами кишечного микросимбиоценоза. Антагонистические взаимоотношения бифидофлоры с условно-патогенными микросимбионтами не только характеризовались низкой распространенностью, но и низкой степенью выраженности признака.
Полученные данные по биологическим характеристикам доминантной микрофлоры раскрывают механизм нарушения колонизационной резистентности у ВИЧ-инфицированных детей и согласуются с «теорией нарушенной микрофлоры». Они могут быть использованы для рационализации принципов коррекции у данной категории детей и профилактики развития у них СПИД-ассоциированных инфекций.
1. Opportunistic and other infections in HIV-infected children in Latin America compared to a similar cohort in the United States /J.O. Alarcon, L. Freima-
nis-Hance, M. Krauss et al. //AIDS Research and Human Retroviruses. - 2012. - V. 28(3). - P. 282-288.
34 T. 12 № 3 2013 MedicLn^ OMSuima
inKuzbass вК^бага
2. Оппортунистические заболевания у ВИЧ-инфицированных пациентов, аттестованных в Светлогорске в 1996 году /Е.И. Козорез, С.В. Жаворонок, Д.С. Падуто и др. //Иммунопатол., аллергол., инфектол. - 2008. - № 3. - С. 44-48.
3. Mortality in Brazilian children with HIV/AIDS related conditions after highly active antiretroviral therapy introduction /A.N. Ramos, L.H. Matida, N. He-arst et al. //AIDS Patient Care and STDs. - 2011. - V. 25(12). - P. 713-718.
4. Особенности поражения органов дыхания у ВИЧ/СПИД больных на разных стадиях иммуносупрессии /О.В. Азовцева, Г.С. Архипов, Е.И. Архипова и др. //ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. - 2011. - № 4. - С. 62-66.
5. Destruction of normal resident microflora as the main cause of AIDS [Электронный ресурс]: Continuum: 1996. - URL: http://www.vi-rusmyth.com/aids/hiv/vkmicro.htm. (20. 10. 2012).
6. Бухарин, О.В. Персистентный потенциал бактерийных патогенов: диагностика и прогнозирование осложнений /О.В. Бухарин //Клин. лаб. диагностика. - 2010. - № 9. - С. 12-13.
7. Influence of cell surface properties on adhesion ability of bifidobacteria /L-Q. Wang, X-Ch. Meng, B-R. Zhang //Word J. of Microbiol. and Biotechnol. -2010. - V. 26. - P. 1999-2007.
8. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов /В.И. Брилис, Т.А. Брилене, Х.Б. Ленцнер //Лаб. дело. - 1986. - № 4. - С. 210-212.
9. Genetic analysis and morphological identification of pilus-like structures in members of the genus Bifidobacterium /E. Foroni, F. Serafini, D. Amidani et al. //Microbial Cell Factories. - 2011. - V. 10(1). - P. 16-29.
10. Видовая характеристика и факторы персистенции бифидофлоры кишечника в норме и при дисбиозах /Е.В. Иванова, Н.Б. Перунова, А.В. Ва-лышев и др. //Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2009. - № 2. - С. 89-93.
Medicine
