CC BY
94
Таким образом, при соматотипировании по схеме Ь. Яеев-Н.Х Е1вепк, получены следующие результаты: наибольшее количество остеонов в поле зрения наблюдается у лиц нормостенического соматотипа 21,0 [19,0;23,0], что достоверно больше в сравнении с мужчинами астенического и пикнического типов телосложения.
По количеству молодых остеонов достоверных различий не получено, однако имеется тенденция к более высокому содержанию молодых остеонов у представителей пикнического типа телосложения (р=0,0649).
Максимальное количество промежуточных остеонов в поле зрения имеют представители нормостенического соматотипа. Это количество достоверно больше, чем у представителей астенического и пикнического типов телосложения (р=0,0409 и р=0,0349 соответственно). Минимальное количество остеонов средней степени зрелости у представителей пикнического соматотипа. Мужчины астенического соматотипа занимают промежуточное положение по этому признаку.
Количество старых остеонов (высокоминерализованных) максимально у мужчин нормостенического типа телосложения. Минимальное количество данных остеонов имеют представители пикнического соматотипа, это значение достоверно меньше, чем у лиц астенического и нормостенического соматотипов (р=0,0292 и р=0,0188 соответственно) . Мужчины астенического соматоти-па занимают промежуточное положение по этому признаку. Полученные данные свидетельствуют о том, что пластинчатая костная ткань диафизов плечевых костей мужчин пикнического сома-тотипа имеет более низкий уровень минерализации в сравнении с плечевыми костями мужчин других соматотипов. Самая высокоминерализованная пластинчатая костная ткань у мужчин нормостенического соматотипа, однако это различие статистически не значимо по сравнению с мужчинами астенического типа телосложения.
Выводы:
1. Распределение мужчин по методу В. В. Бунака-В.П. Чте-цова (1979) произошло следующим образом: представителей брюшного соматотипа - 27%, мускульного - 26%, грудного -29% и 18% представителей неопределенного соматотипа. По методике Ь. Яеев-Н.1. Е1вепк (1945) - 53% составляют мужчины астенического, 38% нормостенического и 9% пикнического типов телосложения.
2. Костная ткань диафизов плечевых костей мужчин грудного соматотипа характеризуется наименьшими размерами и самой высокой степенью минерализации остеонных структур, у них максимальное количество старых (высокоминерализованных) остеонов. Наименьшая степень минерализации остеонных структур наблюдается у представителей мускульного типа телосложения. Представители брюшного и неопределенного сомато-типов имеют промежуточные значения по данному параметру, однако их степень минерализации достоверно меньше, чем у лиц грудного соматотипа.
3. Костная ткань плечевых костей мужчин нормостенического типа телосложения характеризуется наличием мелких осте-онных структур и за счет большего количества старых (высокоминерализованных) остеонов является высокоминерализованной. Костная ткань мужчин пикнического типа телосложения характеризуется наименьшей степенью минерализации, которая компенсируется наличием крупных остеонных структур, наиболее прочных в биомеханическом отношении. Мужчины астенического соматотипа занимают по изучаемым признакам промежуточное положение.
4. Полученные данные по минерализации остеонных структур костной ткани плечевых костей мужчин представлены с использованием двух схем соматотипирования [2,7], что может быть использовано для сравнительного анализа в дальнейших научных исследованиях.
Литература
1. Аверченко, И.В. Конституциональные особенности строения длинных трубчатых костей верхней конечности: автореф. дис. канд. мед. наук./ И. В. Аверченко.- Красноярск, 2009.- 21 с.
2. Бунак, В.В. Антропометрия // В.В. Бунак.- М.: Нарком-прос РСФСР, 1941.- 368 с.
3.Козловская, М.В. Этнография, антропология и смежные дисциплины; соотношение предмета и методов (сб.статей АН СССР) / М.В. Козловская.- М, 1989.- С. 148-156.
4Медведева, Н.Н. Закономерности изменчивости физического статуса и посткраниального скелета населения города Красноярска: автореф. дис. д-ра мед. наук / Н.Н. Медведева.-Красноярск, 2004.- 31 с.
5. Накоскин, А.Н. Возрастные изменения и половые разли-
чия биохимического состава костной ткани человека: автореф. дис......канд. мед. наук./ А.Н. Накоскин.- Тюмень, 2004.- 18 с.
6. Бабичев, В.И. Пат. RU 2113701 C1. Российская Федерация. Способ приготовления препаратов для исследования микроскопической структуры костной ткани / В.И. Бабичев, В.Г. Донцов.- 20.06.1998. Бюл. №14.
7. Чтецов В.П. Вопр. Антропологии / В.П. Чтецов, Н.Ю. Лутовникова, М. И. Уткина.- 1979.- Вып. 58.- С. 3-22.
8. Rees, Z. J. Nental.Sci /Z. Rees, H. Eisenc.- 1945.- V. 91.-№386.- Р. 8-21.
LEVEL OF SALINITY STRUCTURE OF BONE TISSUE OSTEONS LONG TUBULAR BONES IN MEN FROM SOMATOTYPE
P.A. LEMKE, N.N.MEDVEDEVA
Krasnoyarsk State Medical University named in honour of professorV.F. Voyno-Yasenetskiy
The study of the level of mineralization of bone tissue shoulder bones in men of different somatotypes is carried out. The study found that the classification of V.P. Bunak-
V.V. Chtetsov (1979), the highest level of bone mineralization in those infants somatotype, the lowest - the representatives of the muscular body type. Under the scheme L.Rees-H.J. Eisenk (1945), the most highly mineralized bone humerusnormosthenic somatotype in men, the lowest - in patients pyknicbody type.
Key wodrs: somatotype, lamellar bone, humerus, osteons structure, level of mineralization.
УДК 577.152.53:616.155.32:57.086:[616.36-002-099-092.9:615.272’476.4]
ВЫЯВЛЕНИЕ ЦИТО-БИОХИМИЧЕСКИМ МЕТОДОМ НОРМАЛИЗАЦИИ АКТИВНОСТИ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В ЛИМФОЦИТАХ КРОВИ ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ У КРЫС ПОД ВЛИЯНИЕМ РЕГУЛЯТОРА ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА «ЯНТАРЬ-АНТИТОКС»
А.В.ЧЕРНИКОВ*, В.А.ХАЗАНОВ**, Д.И.КУЗЬМЕНКО*, В. Ю. СЕРЕБРОВ *
С помощью нового цито-биохимического метода изучали возможность коррекции активности сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов крови крыс с ССЦ-гепатитом путем курсового введения лекарственного препарата «Янтарь-антитокс». Показано, что препарат способствовал выраженной нормализации активности
cукцинатдегидрогеназы и уровня восстановления нитросинего тет-разолия на эндогенных субстратах. Эти результаты хорошо согласовывались с данными традиционной биохимической оценки состояния печени животных (печеночные пробы). Цито-биохимический метод позволил детально охарактеризовать различные состояния cукцинатдегидрогеназы в организме животных не только в норме, но и в условиях её изменений при различных степенях тяжести патологического процесса. Обсуждаются вероятные механизмы нормализующего действия янтарной кислоты, поступающей в организм в составе препарата «Янтарь-антитокс», в основе которых могут лежать: во-первых, стимуляция самого мощного пути энергопродукции в митохондриях благодаря преимущественному окислению янтарной кислоты, во-вторых, способность субстрата в результате окисления усиливать обеспечение восстановительными эквивалентами процессов детоксикации ксенобиотиков в микросомах (защитное действие «Янтарь-антитокс» при токсическом повреждении печени) и, в третьих, вовлечение адренэргической регуляции, по-видимому, усиленное рецепторами клеточной поверхности к янатр-ной кислоте (сигнальное действие).
Ключевые слова: сукцинатдегидрогеназа, янтарная кислота, митохондрии, лимфоциты, цитохимия, токсический гепатит.
Митохондриальные дисфункции, индуцируемые различными патогенными факторами, являются основой развития рака, диабета, сердечно-сосудистых и нейро-дегенеративных заболеваний [14,19]. Это диктует необходимость совершенствования методов исследования митохондрий (МХ), которые позволяли бы
* ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. ул. Московский тракт, 2, 634050, г. Томск, тел.: 8 (3822) 42-09-61.
ООО Инновационные фармакологические разработки ИФАРАкадемиче-ский пр., 8/8, 634055, г. Томск, тел.: 8(3822) 24-87-77.
не только обеспечивать сохранность естественной структурной организации МХ сети, через которую осуществляется физиологическая регуляция, но и удовлетворять запросы лабораторной диагностики - надежно регистрировать дисфункции МХ на доклинической стадии развития патологии.
Многолетний опыт изучения активности дегидрогеназ дыхательной цепи МХ лимфоцитов крови на основе регистрации суммарной площади зерен формазана, образующихся в результате восстановления нитросинего тетразолия (НСТ), показал высокую информативность такого методического приема для характеристики состояния биоэнергетики [5]. Вместе с тем, традиционный цитохимический подход не позволял регистрировать регуляторное действие экзогенной янтарной кислоты (ЯНТ), а также выявлять способность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) к динамической перестройке активности - формированию быстрого метаболического кластера в матриксе органелл, который обеспечивает преимущественное окисление ЯНТ и синтез дополнительного количества АТФ [6,11,12]. В настоящее время установлено, что ЯНТ и кетоглютаровая кислоты способны выполнять функции регуляторов энергетического метаболизма [3,7,15,16]. Показано, что внеклеточная ЯНТ реализует регуляторный эффект посредством сопряженного с G-белком орфан-рецептора GPR91 [13]. Это позволило обосновать применение некоторых метаболитов цикла Кребса (в первую очередь ЯНТ) для коррекции дисфункций МХ. Фармакологи объединили их в группу препаратов - регуляторов энергетического обмена (РЭО) [11,12].
Цель исследования — изучить изменения активности СДГ лимфоцитов крыс с экспериментальной патологией и оценить эффективность коррекции состояния дегидрогеназы лекарственным препаратом «Янтарь-антитокс» из группы препаратов РЭО с помощью нового цито-биохимического метода [8,9,17]. Принципиальное преимущество метода состоит в том, что он позволяет избежать разрушения клеток и сети МХ в них, что существенно для высокой чувствительности метода к физиологической регуляции состояния СДГ.
Материалы и методы исследования. Исследования проведены на самцах крыс Вистар массой 140-160 г, полученных из вивария Сибирского государственного медицинского университета. Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями правил проведения работ с использованием экспериментальных животных (приложение к приказу Министерства высшего и среднего специального образования СССР № 742 от 13.11.1984). Методом случайной выборки крысы были распределены на группы: группа 1: контроль (n=18); группа 2: животные без гепатита, получавшие ежедневно 1,0 мл абрикосового масла per os (через зонд) в течении 10 дней (n=17); группа 3: животные без гепатита, получавшие курс введения «Янтарь-антитокс» (регистрационный номер ЛС-002722, компания «Томская фармацевтическая фабрика») в дозе 50 мг/кг per os ежедневно в течении 10 дней. Крыс обследовали после 5 (n=10) и 10 (n=10) дней введения препарата; группа 4: животные с токсическим гепатитом, который вызывали путем однократного введения per os тетрахлорметана (ССЦ) в дозе 235 мг/кг на абрикосовом масле в объеме 1 мл. Крыс обследовали через 1, 3, 5 и 10 суток после введения ССЦ На каждом из сроков было использовано по 10 животных (всего n=40); группа 5: животные с токсическим СС]Ц гепатитом, получавшие курс введения per os «Янтарь-антитокс» в дозе 50мг/кг ежедневно в течении 10 дней, начиная с 3 суток после интоксикации. Крыс обследовали после 5 и 10 дней введения «Янтарь-антитокс». На каждом из сроков было использовано по 10 животных (всего n=20).
Об изменениях активности СДГ лимфоцитов крови животных судили с помощью цито-биохимического метода [8,9,17]. Для приготовления мазков на предметном стекле, каплю крови брали из хвостовой вены крыс. Мазки высушивали на воздухе и фиксировали в течении 30 секунд в смеси ацетон: вода (3:2). Метод позволяет зарегистрировать не единственный показатель активности СДГ, как при традиционном цитохимическом варианте, а комплекс показателей, на основе которых возможно корректно рассчитать активность СДГ, с учетом особенностей регуляции её активности in vivo. С этой целью от каждого животного готовили 4 мазка крови и инкубировали в средах различного состава в течении 1 часа при температуре 37 Со. Такой прием позволяет получить индивидуальную характеристику состояний СДГ каждого животного и представить её в форме комплекса цито-биохимических показателей - специфических паттернов (узоров). Метод позволяет выявлять следующие состояния активности СДГ: «покой», «активация», «гиперактивация» и «гиперактивация с ингибированием» [8]. В физиологических условиях (норма) активность СДГ характеризуется, в основном, состояниями «покой» и «активация». В условиях реализации компенсаторно-адаптивных реакций организма активность СДГ характеризуется состоянием «гиперактивации». Срыв адаптационного потенциала организма - состоянием «гиперактивация с ингиби-
рованием». Для выявления этих состояний в среду инкубации мазков включали изолимонную кислоту (ИЗЛ). Установлено, что изолимонная кислота (ИЗЛ) активирует ингибированную СДГ и снижает активность гиперактивной СДГ [9]. Типичные паттерны и состав сред инкубации мазков крови для выявления упомянутых состояний активности СДГ представлены на Рис. 1. После инкубации мазка в среде соответствующего состава, в ходе его микроскопирования, в нём находили 30 лимфоцитов, в каждом из которых измеряли общую площадь гранул формазана (8, мкм2) с помощью микроскопа «Ахю8соре А1» (CarlZeiss) и программы обработки цифровых изображений 1ша§е1 [10]. Активности восстановления НСТ лимфоцитами после инкубации мазков в
4 средах разного состава (мкм2/лимфоцит), а также два вычисляемых на их основе показателя: истинная активность СДГ (СДГист.) и эффект изолимонной кислоты (эфф.ИЗЛ), использовали для составления индивидуального паттерна, характеризующего состояние активности СДГ у конкретного животного.
В сыворотке крови крыс определяли содержание общего билирубина (ОБР) и его фракций (Билирубин-ново, ЗАО «Вектор Бест», г. Новосибирск); активность аминотрансфераз (Трансами-наза-АЛТ-АСТ-ново, ЗАО «Вектор Бест», г. Новосибирск). Тимоловую пробу проводили с помощью тест-системы «Био-тест, ЬасЬеша» (Чешская Республика). Содержание диеновых конъюгатов (ДК) и концентрацию продуктов, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБКРП) оценивали методами, описанными в работе [2], концентрацию общих липидов (ОЛ) - по цветной реакции с сульфофосфованилиновым реактивом.
Рис. 1. Типичные паттерны, характеризующие градации активности СДГ лимфоцитов крови, и состав сред инкубации мазков для их выявления
Состав сред инкубации:
ЭС - эндогенные субстраты. Активность восстановления НСТ на эндогенных субстратах: КС1 - 125 мМ, HEPES — 10 мМ (рН 7,2), нитросиний тетразолий (НСТ) — 1мг/мл. Далее этот состав будет обозначен, как основная среда инкубации (ОСИ). Проба позволяет оценить суммарную активность дегидрогеназ (ДГ), обусловленную наличием в клетке пула эндогенных НАД- и ФАД-зависимых субстратов.
МАЛ — проба для оценки активности восстановления НСТ, обусловленной суммарной активностью НАДН-зависимых ДГ: ОСИ + МАЛ — 5мМ. Малоновая кислота (МАЛ) является ингибитором СДГ. С помощью данной пробы можно оценить «вклад» СДГ в суммарную активность ДГ митохондрий.
ЯНТ (СДГ общ) — проба для оценки общей активности СДГ в присутствии субстратной концентрации экзогенной ЯНТ: ОСИ + ЯНТ, 5 мМ.
ИЗЛ+ЯНТ — проба с изолимонной кислотой: ОСИ + ЯНТ,
5 мМ + изолимонная кислота (ИЗЛ), 5 мМ. Добавка ИЗЛ позволяет выявить скрытое ингибирование СДГ.
Вычисляемые показатели:
СДГ ист. — характеризует истинную активность СДГ. Вычисление: если ЭС>МАЛ, то СДГобщ. минус МАЛ; если ЭС<МАЛ, то СДГобщ. минус ЭС.
Эффект ИЗЛ. Вычисление: если ЭС>МАЛ, то ИЗЛ минус МАЛ; если ЭС<МАЛ, то ИЗЛ минус ЭС.
Статистический анализ данных для групп животных проводили с помощью критерия Вилкоксона. Точный тест Фишера использовали для выявления отличий в пропорциях состояний активности СДГ между группами. Критический уровень значимости (р) при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0,05. Результаты представлены в формате M ± m , где М — выборочное среднее, т (SEM) — ошибка среднего. Расчеты вели с помощью программы SPSS 11.0.
Результаты и их обсуждение. Типичные паттерны, характеризующие состояния активности СДГ представлены на рис. 1. Состояние «покой» характеризуется тем, что СДГист. (первый из вычисляемых показателей) близка или равна нулю, а эфф.ИЗЛ
(второй из вычисляемых показателей) - незначительно выше, чем СДГист. При состоянии «активация» СДГист. в большей степени, чем в состоянии «покой», превышает эффект ИЗЛ. Для состояния «гиперактивация» характерным является то, что эфф.ИЗЛ в 1,5-2 раза превышает СДГист. Состояние «гиперактивация с ингибированием» характеризуется тем, что эфф.ИЗЛ превышает СДГист. более, чем в 2 раза. Кроме этого, по мере нарастания ингибирования СДГ (переход состояний «гиперактивация» ^ «гиперактивация с ингибированием»), активности восстановления НСТ в пробах с окислением ЭС становятся ниже, чем в контроле («покой»). Описанные состояния активности СДГ лимфоцитов (в каждом случае индивидуально) в различных пропорциях представлены внутри каждой из групп крыс, находящихся в разных состояниях. Иными словами, для интерпретации состояния СДГ в исследуемых группах крыс информативным показателем развития патологии и её нормализации является именно доля индивидуальных состояний активности СДГ (паттернов), а не степень выраженности изменений. Доли состояний активности СДГ, выявленные цито-биохимическим методом в лимфоцитах крови крыс, которые находились в различных состояниях, представлены на рис. 2. Из представленных результатов следует, что пропорции состояний активности СДГ лимфоцитов у крыс групп 1 (контроль), 2 и 3 были хорошо сопоставимы. Так, доля животных с паттернами «покой» составляла 10-20%, с паттернами «активация» - 60-70%, с паттернами «гиперактивация» - 16-30% и с паттеранами «гиперактивация с ингибированием» - 5-10%.
Далее, оказалось, что у крыс группы 4 на всех сроках наблюдения отсутствовали животные с паттернами «покой». При этом преобладали крысы с паттернами «гиперактивация», и «гиперактивация с ингибированием». Доля этих паттернов была статистически значимо больше, по сравнению с группами 1, 2 и 3 (р<0,05). В наибольшей степени в группе 4 это было характерно для 3 суток - преобладающим паттерном был «гиперактивация с ингибированием», доля животных с этим паттерном составила 50% (против 5,6, 5,9 и 10% в группах 1, 2 и 3 соответственно). Вплоть до 10 суток наблюдения не было выявлено признаков нормализации активности СДГ лимфоцитов - тенденции к спектру паттернов, характерному для животных групп
1, а также 2 и 3. Таким образом, по мере развертывания патологического процесса происходило нарастание ингибирования активности СДГ.
Динамика биохимических показателей сыворотки крови крыс различных групп (M±m)
животных группы 4. Доля паттернов «покой» в группе 5 составила 10% и 20% после 5 и 10 суток введения препарата соответственно, что по завершении полного курса введения «Янтарь-антитокс» (10 суток) была такой же, как в группе 1 (контроль). В целом, после завершения курса введения препарата, структура состояний активности СДГ животных группы 5, не отличалась от таковой в группах 1, а также 2 и 3. Этот комплекс изменений свидетельствовал о полном исчезновении ингибирования СДГ лимфоцитов крови под влиянием препарата «Янтарь-антитокс».
В гаттерн "актавция" В таттерен "гигерактавация" йтаттерн "гиnерактиlвация с ингибирован
Таблица
Условия эксперимента Билирубин (мкмоль/л) АлАТ (Е/л) АсАТ (Е/л) Коэффициент де-Ритиса Тимоловая проба ДК ед.опт. пл./г ОЛ ТБКРП нмоль/г ОЛ
общий конъюги- рованный не конъюгированный
Группа 1, п=18 5,29±0,15 1,09±0,02 4,20±0,21 3,9±,015 3,6±0,21 0,9±0,07 6±0,7 0,023±0,001 0,051±0,0012
Группа 2, п=17 4,75±0,16 1,71±0,03 3,04 ±0,15 4,5±0,2 3,8±0,15 0,8±0,06 5±0,5 0,031±0,002 0,04 6±0,0 016
Группа 3 (5 сутки), п=10 5,68±0,31 0,98±0,02 4,70±0,14 7±0,41 4,1±0,17 0,6±0,05 5±0,6 0,025±0,001 0,061±0,002
Группа 3 (10 сутки) , п=10 6,36±0,24 2,06±0,04 4,30±0,14 5,1±0,24 3,2±0,11 0,6±0,06 6±0,7 0,029±0,001 0,041±0,0011
Группа 4 (1 сутки), п=10 9,21±0,43 3,47±0,08 5,74±0,22 15,8±0,8 11,5±0,54 0,7±0,05 14±0,9 0,053±0,002 0,078±0,003
Группа 4 (3 сутки), п=10 20,17±0,39 6,54±0,09 13,63±0,52 26,4±1,2 19,8±0,74 0,75±0,05 15±1 0,059±0,003 0,098±0,003
Группа 4 (5 сутки), п=10 19,16±0,51 5,23±0,11 13,93±0,54 24,1±1, 20,7±0,99 0,85±^04 10±0,8 0,05±0,002 0,099±0,0046
Группа 4 (10 сутки), п=10 10,56±0,28 3,16±0,15 7,40±0,44 12,2±0,78 7,7±0,32 0,6±0,04 6±0,3 0,041±0,001 0,049±0,0017
Группа 5 (5 сутки), п=10 10,79±0,47 # 3,14±0,13 # 7,65±0,36 # 20,3±1,3 19,6±1,0 1,0±0,06 5±0,4# 0,053±0,002 0,089±0,0021
Группа 5 (10 сутки), п=10 5,58±0,31 ## 1,2±0,06 ## 4,38±0,41 ## 7,3±0,32 *,**,## 5,8±0,1 2## 0,8±0,05 5±0,5 0,039±0,002 0,051±0,0032
Примечание: * статистически значимые отличия от гр. 1 (р<0,05); ** статистически значимые отличия от гр. 2 (р<0,05); *** статистически значимые отличия от гр. 3 (р<0,05).
# статистически значимые отличия от гр. 4 (5 сутки) (р<0,05); ## статистически значимые отличия от гр. 4 (10 сутки)
(р<0,05).
Цито-биохимическая оценка активности СДГ в лимфоцитах крови крыс в группе 5 (по сравнению с группой 4) показала, что пропорционально длительности введения «Янтарь-антитокс», нарастала доля крыс с паттернами «активация» при одновременном уменьшении доли с паттернами «гиперактивация» и минимизации доли крыс с паттернами «гиперактивация с ингибированием». Среди животных группы 5, уже после 5 суток введения «Янтарь-антитокс» были выявлены крысы с паттернами «покой», которые полностью отсутствовали на всех сроках наблюдения у
Рис. 2. Соотношебние состояний активности СДГ, выявленные цито-биохимическим методом, в лимфоцитах крови крыс различных групп
Примечение: За 100% принято общее количество животных в каждой группе (п). * - р<0,05 - статистически значимые отличия от гр. 1;
** - р<0,05 - статистически значимые отличия от гр. 2; *** - р<0,05 -статистически значимые отличия от гр. 3. # - р<0,05 - статистически значимые отличия от гр. 4 (5 сутки); ## - р<0,05 - статистически значимые отличия от гр. 4 (10 сутки)
Активность восстановления НСТ на ЭС является высоко-информативным показателем энергетического обмена при продолжительном патогенном воздействии на организм. В отличие от данных на животных при разовом краткосрочном мягком стрессе или введении адреналина [4,9,17], результаты настоящей работы свидетельствовали о том, что при продолжительном воздействии токсического фактора отдельно или в сочетании с препаратом РЭО сильно отличаются активности восстановления НСТ в пробах с окислением ЭС. Эти данные приведены на рис. 3. В качестве примера мы рассмотрели сроки наблюдения за животными группы 4, при которых (согласно результатам оценки биохимических показателей крови, см. Таблицу) патологические сдвиги нарастали - это были 1 и 3 сутки после введения ССІ4. Поскольку на этих сроках преобладали животные с паттернами «гиперактивация», для рис. 3 были выбраны примеры из их числа. В норме (контроль) у крыс выявлялись паттерны с максимальными значениями ЭС, в то время, как в условиях экспериментальной патологии (группа 4) активности восстановления НСТ в пробах с окислением ЭС становились существенно ниже, чем в контроле.
В хорошем соответствии с результатами цито-биохимической оценки состояний активности СДГ лимфоцитов оказались данные биохимического анализа крови животных (таблица). Так, у крыс группы 4 на 3 и 10 сутки наблюдения отмечены значимые повышения активности АлАт и АсАТ, концентраций ОБР и его фракций, концентрации ДК и ТБКРП, положительная тимоловая проба в сыворотке крови а также значимое снижение коэффициента Де-Ритиса по сравнению с контролем (р<0,05). Курс введения препарата «Янтарь-антитокс» (группа 5) существенно нормализовал состояние печени животных: активности АлАТ и АсАТ были значимо ниже, чем
|руппа 3 (5 I руппа 3 (10 1руппа 4 (1 1руппа 4 (3 1руппа 4 (5 1руппа 4 1руппа 5 (5 1руппа 5 (10
суток), п=10 суток), п=10 сутки) , п=10 суток), п=10 суток), п=10 (10 суток), суток), п=10 суток), п=10
у животных группы 4 (р<0,05) и не отличались от таковых в группе контроля. Такая же направленность сдвигов была характерна для концентрации ОБР и его фракций, результатов тимоловой пробы, коэффициента Де-Ритиса и содержания в сыворотке крови ДК и ТБКРП.
Рис.3. Влияние тяжести патологического процесса на активность
восстановления НСТ лимфоцитами крови крыс в пробах на ЭС
В настоящей работе прослежено состояние активности СДГ у животных, находящихся под продолжительным воздействием: токсического агента, то есть на стадии адаптации по классической терминологии стресса. Ранее были описаны выраженные изменения активности СДГ на стадии краткосрочного стресса -реакции тревоги на первичное воздействие в течение 30 мин [4,9,15]. Согласно полученным нами данным, уменьшению проявления возбуждения при продолжительном воздействии соответствует значительное снижение активации СДГ.
Несомненно, нормализующее действие «Янтарь-антитокс», препарата из группы РЭО, содержащего ЯНТ, основано на стимуляции самого мощного пути энергообеспечения в митохондриях - окисления этого субстрата, о чем свидетельствует нормализация активности СДГ. Важно иметь в виду, что гиперактивация не обеспечивает повышения эффективности энергообеспечения, но напротив, увеличивает риск ингибирования. Эти тонкие стадии модуляции активности СДГ отчетливо выявляются цит-биохимическим методом. Современные данные о наличии рецептора на клеточной мембране к ЯНТ позволяют понять высокую эффективность ее низких используемых доз, недостаточных для обеспечения всех МХ в организме субстратом. Действие ЯНТ в организме включает вовлечение адренэргической регуляции, повидимому, усиленное рецепторами [1,20]. Очень важным следствием усиления потока восстановительных эквивалентов (электронов, НАДН и НАДФН) в результате окисления ЯНТ в дыхательной цепи, является обеспечение ими процессов микросо-мального окисления, осуществляющих детоксикацию ксенобиотиков [18]. Возможно, именно эта сторона действия ЯНТ является существенной для защитного действия препарата «Янтарь-антитокс» при токсическом повреждении печени.
Выводы:
1. Новый цито-биохимический метод определения активности СДГ лимфоцитов крови, в отличие от традиционных цитохимических методов оценки активности дегидрогеназ, позволяет детально охарактеризовать различные состояния СДГ в организме животных не только в норме, но, что особенно важно, в условиях её изменений при различных степенях тяжести патологического процесса, а также прослеживать процесс восстановления биоэнергетических функций под влиянием нормализующих воздействий.
2. Курсовое введение «Янтарь-антитокс» из группы препаратов - РЭО животным с токсическим гепатитом способствовало выраженной нормализации активности СДГ и уровня восстановления НСТ на ЭС при токсическом воздействии.
Авторы выражают искреннюю благодарность Заслуженному деятелю науки РФ, доктору биологических наук, профессору Марии Николаевне Кондрашовой и кандидату биологических наук Наталье Васильевне Хундеряковой (Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино Московской области) за помощь в освоении метода и важные замечания, высказанные при обсуждении результатов и подготовке статьи.
Литература
1. Артериальная гипертония и адренореактивность: особенности у больных с ожирением / С.С.Бунова [и др.] //Бюлл. СО РАМН.- 2008.- Т.129.- № 1.-С. 77-81.
2. Буров, П.Г. Компоненты сфингомиелинового цикла и активность нейтральной сфингомиелиназы печени крыс на раз-
личных фазах голодания / П. Г. Буров, Д.И.Кузьменко, В.Ю.Серебров // Вестник новых медицинских технологий.-2011.- Т.18.- № 3.- С. 20-22.
3. Реципрокное сукцинату и катехоламинам действие введенных альфа-кетоглутарата и ацетилхолина на окисление субстратов в митохондриях сердца и нейрогуморальный статус организма / Н.М. Долиба [и др.] // В сб. Митохондрии в патологии.- Пущино : ОНТИ, 2001.- С. 21-27.
4. Захарченко, М.В. Важность сохранения биофизической организации выделенных митохондрий для выявления физиологической регуляции их функций / М.В. Захарченко, Н.В. Хунде-рякова, М.Н. Кондрашова //Биофизика.- 2011.- Т. 56.- №. 5.-С. 840-847.
5. Комиссарова, И. А. Информативность ферментного статуса лимфоцитов крови в оценке состояния организма в норме и патологии у детей / И.А. Комиссарова: Автореф. дис... д-ра мед. наук.- М.,1983.- 34 с.
6. Кондрашова, М.Н. Взаимодействие процессов пере-аминирования и окисления карбоновых кислот при разных функциональных состояниях ткани / М.Н. Кондрашова // Биохимия.-1991.- Т.56.- вып. 3.- C. 388-404.
7. Субстратно-гормональная система регуляции физиологического состояния. Условия ее выявления. Использование в практике / М.Н. Кондрашова [и др.] // В сб. Горизонты биофизики.- Пущино : ОНТИ; НЦБИ, 2003.- С. 147-154.
8. Кондрашова, М.Н. Оригинальный цито-биохимический метод выявления индивидуальных различий физиологического состояния организма по комплексной характеристике (паттерну) активности сукцинатдегидрогеназы / М.Н. Кондрашова, Н.В. Хундерякова, М.В. Захарченко // Биомедицинский журнал.- 2009.- Т. 10.- С. 27-43.
9. Цитобиохимический способ определения активности сукцинатдегидрогеназы, окисления эндогенной янтарной кислоты, сигнального действия микромолярных концентраций янтарной кислоты, его применение для количественной оценки уровня адренергической регуляции в организме, среда и набор для осуществления способа: пат. 2364868 Рос. Федерация: МПК51 G01N33/50 G01N33/68 / М.Н.Кондрашова, М.В.Захарченко, Н.В.Хундерякова, Е.И. Маевский; заявитель и патентообладатель ИТЭБ РАН, Кондрашова М. Н., ОАО "ДИОД"; № 2007143021/15; заявл. 20.11.2007; опубл. 20.08.09, Бюл. № 23.^ с.
10. Смирнова, Н.Б. Экспериментальное обоснование разработки регулятора энергетического обмена с антитоксическими и актопротекторными свойствами / Н.Б. Смирнова, В.А. Хазанов // В сб. Актуальные проблемы экспериментальной и клинической
фармакологии.-Томск: Изд-во Томского ун-та, 2001.-С. 141-144.
11. Хазанов, В.А. Роль системы окисления янтарной кислоты в энергетическом обмене головного мозга / В.А. Хазанов: Автореф. дис. д-ра мед. наук.- Томск, 1993.- 35 с.
12. Citric acid cycle intermediates as ligands for orphan G-protein-coupled receptors / W. He [et al.] // Nature.- 2004. - Vol. 429, N 429 (6988).- P. 188-193.
13. Kargul, J. Mitochondria matter: New concepts of dynamics and roles in pathophysiology / J. Kargul, G.J. Laurent // Int. J. Biochem. Cel.l Biol.-2009.-Vol. 41, N 10.-P. 1747 - 1752.
14. Changes in sympathetic and parasympathetic regulation connected with succinate dehydrogenase and a-ketoglutarate dehydrogenase activity in different physiological states of the organism / N. Khunderyakova [et al.] // EBEC abstract book BBA.- 2010.-Vol. 1797.
15. Kondrashova, M.N. Succinic acid as a physiological signal molecule / M.N. Kondrashova, G.D. Kuznetzova // Signal molecule and behaviour. Eds. W. Winlow et. al. Manchester University Press, Manchester; NewYork, 1991.- Р. 295 -300.
16. Kondrashova, M.N. Preservation of the in vivo state of mitochondrial network for ex vivo physiological study of mitochondria / M.N. Kondrashova, M.V. Zakharchenko, N.V. Khunderyakova //Int. J. Biochem. Cell. Biol.-2009.-Vol. 41.- N 10.-P. 2036-2050.
17. Moldeus, P.W. Hepatic organelle interaction III. Mitochondrial modification of microsomal drug metabolism / P.W. Mol-deus, Y.-N. Cha, D.L. Cinti, J.B. Schenkman // J. Biol. Chem.-1973.-Vol. 248, N 24.-P. 8574-3584.
18. Rustin, P. Succinate dehydrogenase and human diseases: new insights into a well-known enzyme / P. Rustin, A. Munnich, A.Rotig // Eur. J. Hum. Genet.-2002.-Vol. 10.-P. 289-291.
19. Stark, R. Mitochondrial function and endocrine diseases / R. Stark, M. Roden // Eur. J. Clin. Invest.-2007.-Vol. 37.-P. 236-248.
DETECTION OF THE NORMALIZATION OF AN ACTIVITY OF
SUCCINATE DEHYDROGENASE IN BLOOD LYMPHOCYTES AT THE TOXIC HEPATITIS RATS UNDER THE INFLUENCE OF ENERGY
METABOLISM REGULATOR "YANTAR-ANTITOKS" BY THE CYTO-BIOCHEMICAL METHOD
A.V.CHERNIKOV, V.A.HAZANOV, D.I.KUZMENKO, V. YU.SEREBROV
The Siberian State Medical University Innovative Pharmacology Research
With the help of a new cyto-biochemical method the study was made to detect the possibility of correcting the activity of succinate dehydrogenase (SDH) activity in blood lymphocytes of rats with CCLt-hepatitis that was made by intragastric administration of the course of the drug "YANTAR-ANTITOKS" that belongs to a group of drugs - the regulators of energy metabolism. It was shown that the administration of the course of "YANTAR-ANTITOKS" to an animals with CC^-hepatitis contributed to the normalization of the expressed activity of SDH and the level of the nitroblue tetrazolium to the endogenous substrates. This cyto-biochemical method allowed get the detailed characterization of the different states of SDH activity in animals not only during the norm condition, but also in terms of its changes at different degrees of severity of the pathological process. The possible mechanisms of of the normalizing action of succinic acid (SA) coming into the body of the drug "YANTAR-ANTITOKS" may be based on: first, stimulation of the most powerful way of energy production in mitochondria due to the preferential oxidation; of SA, secondly, this substrate oxidation led to the increase the providing of the reducing equivalents the processes of detoxification of xenobiotics in microsomes (protective effect of the drug "YANTAR-ANTITOKS" with toxic liver damage); third, the involvement of adrenergic regulation, apparently, increased by the cell surface receptors. to the SA (signaling effect).
Key words: succinate dehydrogenase, succinic acid,
mitochondria, lymphocytes, cytochemistry, toxic hepatitis.
УДК 615. 281 [6:539] - 022.532
РЕГЕНЕРАЦИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ РАНЫ ПОД ВЛИЯНИЕМ НАНОЧАСТИЦ ЦИНКА
И.В.БАБУШКИНА, Е.В.ГЛАДКОВА, И.А.МАМОНОВА, С.В.БЕЛОВА,
Е. В .КАРЯКИНА*
Целью исследования было сравнительное изучение влияния на скорость регенерации полнослойной кожной раны у экспериментальных животных наночастиц цинка в виде суспезии и в комплексном соединении с биополимером хитозаном. На 40 белых крысах-самцах была моделирована полнослойная рана. Для оценки течения раневого процесса использовали методы планиметрического и бактериологического исследования ран, проводили общий анализ крови с подсчетом лейкоцитарной формулы на 3, 5, 7, 10 и 14 сутки. Использование суспензий наночастиц цинка в изотоническом растворе хлорида натрия оказывается эффективным при местном лечении неинфици-рованных ран. Наиболее выраженное регенеративное действие отмечается у комплексного препарата наночастиц цинка на основе хи-тозана.
Ключевые слова: наночастицы, цинк, хитозан, полнослойная рана.
Заживление повреждений, вызванных различными механическими, термическими и другими факторами (гнойновоспалительные процессы, дистрофические и др.) остается актуальной научно-практической задачей. Использование местного лечения позволяет существенно повысить эффективность лечения трофических язв, ожогов и ран. В настоящее время в клинической практике используются более 300 видов раневых покрытий, но использование комбинированных покрытий, сочетающих положительные свойства нескольких типов, позволяет решить разнонаправленные задачи, воздействуя на различные звенья патогенетического процесса [4].
Актуальным является поиск новых, альтернативных препаратов, улучшающих репаративную регенерацию. Уникальные свойства наноматериалов и их биологическая активность могут быть использованы для создания нового класса антибактериальных и ранозаживляющих средств. Однако необходима большая
работа для выяснения фундаментальных закономерностей взаимодействия наночастиц металлов с биологическими объектами [3].
Наночастицы металлов проявляют ярко выраженную биологическую активность, в том числе влияние на регенерацию тканей. Учитывая исключительную роль цинка в жизнедеятельности организмов и его необходимость для процессов регенерации тканей, можно предположить, что этот элемент может обладать ранозаживляющими свойствами, ускоряя регенерацию поврежденной кожи. Местное применение пасты из окиси цинка улучшает заживление язв на ногах на 83%. У людей, страдающих такими язвами, концентрация цинка в организме, как правило, ниже нормы. Цинк также является эффективным средством для местного стоматита. Тем не менее, в литературе имеются лишь отдельные данные по влиянию цинка в виде наночастиц на заживление ран [1,2].
Цель исследования — провести сравнительное изучение влияния наночастиц цинка в виде комплексного препарата на основе биополимера хитозана и суспензии наночастиц цинка в изотоническом растворе на репаративную регенерацию полнослойных экспериментальных ран.
Материалы и методы исследования. Использовались наночастицы цинка, полученные плазмохимическим методом при воздействии плазменным потоком с температурой 5000-6000оК.
Экспериментальные исследования по изучению влияния наночастиц металлов на раневой процесс проведены на 40 белых крысах-самцах массой 170±30 г. Все животные содержались в индивидуальных клетках. Режим содержания и питания животных был одинаков во всех группах опытов. Все исследования проводились в соответствии с Хельсинкской декларацией 1975 г. и ее пересмотром в 1983 г.
Модель полнослойной раны была получена следующим образом [5]: после предварительной обработки кожи, в асептических условиях, под наркозом, на выбритом от шерсти участке в межлопаточной области у крыс иссекалась кожа с подкожной клетчаткой в виде квадрата 2x2 см (400 мм2) по контуру, предварительно нанесенным трафаретом.
На раневую поверхность 1 опытной группы однократно накладывают стерильные салфетки, смоченные суспензией наночастиц цинка в изотоническом растворе в концентрации 50 мг/мл. Раневую поверхность 2 опытной группы однократно обрабатывали 1 г комплексного препарата хитозана с наночастицам цинка (наночастицы цинка с дисперсностью 50 нм - 50 мг, 950 мг низкомолекулярного хитозана (качество соответствует ТУ 9289-06700472124-03, произведен ЗАО «БИОПРОГРЕСС»). При взаимодействии с раневым экссудатом препарат образовал слой гидрогеля толщиной 2 мм, полностью покрывающий рану. После подсыхания гидрогеля открытым способом в течение 20-30 мин сформировалась эластичная, плотно прилегающая к поверхности раны пленка толщиной 1 мм. На протяжении всего периода наблюдения осуществляли контрольные исследования, при которых учитывались следующие параметры течения раневого процесса: наличие и характер воспалительной реакции, состояние краев и дна раны, сроки очищения раны от некротических тканей и появления грануляций, сроки начала эпителизации ран. Изменения перечисленных признаков фиксировались и выражались количественно, учитывая сроки лечения, использовали методы планиметрического и бактериологического исследования ран на 3, 5, 7, 10 и 14 сутки. В те же сроки определяли общее количество лейкоцитов в крови и подсчитывали лейкоцитарную формулу.
Статистическую обработку результатов исследования проводили с вычислением средних величин количественных показателей, средних ошибок и коэффициента корреляции. Существенность различий средних величин оценивали по показателям Стьюдента. Распределение животных по группам отражено в табл.1.
Результаты и их обсуждение. Во всех сериях экспериментов на 1 сутки после моделирования гнойной раны средняя площадь ран, по данным планиметрического метода исследования, составила 400 мм2.
Анализ показателей выявил, что в опытных сериях с применением суспензии наночастиц цинка и комплексного препарата на основе хитозана с наночастицами цинка уменьшаются сроки заживления раны.
Динамика течения раневого процесса у экспериментальных животных различных групп представлена в табл. 2.
* ФГБУ «СарНИИТО» Минздравсоцразвития России, 410002, г. Саратов, ул. Чернышевского, 148.
