Влияние трансплантации фетальных клеток на функциональную активность фагоцитов у крыс с экспериментальным циррозом печени Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА

Ж. А. Доскалиев, В. П. Григоревский, С. С. Аманбаев, Б. А. Джусипов

ВЛИЯНИЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ФЕТАЛЬНЫХ КЛЕТОК НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ФАГОЦИТОВ У КРЫС С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ЦИРРОЗОМ ПЕЧЕНИ

Казахская государственная медицинская академия (Астана)

В настоящее время фагоцитирующие клетки рассматривают не только как важнейший инструмент противоинфекционного иммунитета, но и как один из наиболее общих эффекторных механизмов гомеостаза, который проявляет активность при разнообразных нарушениях здоровья. Воспринимая многочисленные сигналы о дестабилизации внутренней среды, фагоциты активируют свои функции, нацеленные на ее восстановление. Это универсальный принцип, который лежит в основе всех фагоцитарных реакций, делая их индикатором нормы и патологии, благополучия или неблагополучия организма в целом [1, 2, 3, 4]. Изучение функциональных показателей системы фагоцитоза может быть использовано для суждения о резервах иммунитета, а также для определения глубины и динамики патологических сдвигов, связанных с различными патологическими процессами [2].

Цель исследования - изучение влияния трансплантации криоконсервированных феталь-ных клеток на функциональную активность фагоцитов периферической крови у крыс с экспериментальным циррозом печени (ЦП).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперимент проведен на 104 половозрелых белых крысах обоего пола массой 150-170 г, ЦП был вызван подкожным введением 50% масляного раствора СС14 в дозе 0,2 мл/100 г массы тела, трижды в неделю на протяжении 3 мес. Клетки фетальной печени и селезенки выделяли из соответствующих органов плодов беременных крыс 17-18-дневного срока гестации комбинированным (механический+ферментативный) способом. Замораживали клетки под защитой 10% диметилсульфоксида (ДМСО) со скоростью -1-20С/мин до -850 С. После хранения в низкотемпературном холодильнике и отогрева на водяной бане при t+400 С жизнеспособность составляла не менее 90,5±0,6%. Трансплантацию клеточных суспензий (0,5 мл на 100 г массы) осуществляли однократно, через сутки после прекращения курсового введения СС14, под эфирным наркозом, чрескожно в паренхиму печени. Животным I опытной группы вводили фетальные гепатоциты, во II опытной группе использовали клетки печени и селезенки (в соотношении 1:1). Животные контрольной группы получали однократную внут-рипеченочную инъекцию 0,5 мл физиологического раствора.

Функционально-метаболическую активность нейтрофильных лейкоцитов и моноцитов периферической крови изучали в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест). НСТ-тест основан на поглощении красителя нитросинего тетразолия форменными элементами крови с дальнейшим восстановлением под влиянием активных форм кислорода внутри клетки и на ее мембране в виде нерастворимого диформа-зана темно-синего цвета. Для оценки использовали световую микроскопию, подсчитывали процент фагоцитов, содержащих диформазан. НСТ-тест ставили в двух вариантах: спонтанном и индуцированном (с пирогеналом), количество выпавшего диформазана служит критерием интенсивности реакции. Спонтанный НСТ-тест отражает степень функционального раздражения фагоцитов in vivo, являясь своеобразным зеркалом гомеостаза. Индуцированный НСТ-тест ха-р а ктеризу ет по т е нц иал ьную с посо бность фагоцитов ответить «респираторным взрывом» на адекватное раздражение.

Определяли индекс стимуляции (ИС) по формуле:

ИС=А-В/А,

где А - показатель стимулированного теста, В -спонтанного [1, 2].

Фагоцитоз оценивали с помощью тест-набора «Реакомплекс» (г.Чита). Рассчитывали фагоцитарную активность (ФА) - процент фагоцитирующих клеток от общего числа, фагоцитарное число (ФЧ) - среднее количество частиц, захваченных одной клеткой.

Указанные иммунологические параметры изучали у интактных животных, у крыс после формирования ЦП и на 1, 2, 3, 4 и 6 нед. после прекращения введения CCl4. Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием программы STATISTICA 6.0 (Stat. Soft, 2001) с применением критерия Манна-Уитни (U). Для описания распределения признака использовали медиану с нижним и верхним квартилями (25 и 75 процентили). Различия между группами учитывали как статистически значимые при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Формирование экспериментального ЦП приводило к уменьшению спонтанного НСТ-теста на 93,6% (pu=0,002), а стимулированного на 91% (pu=0,002), что свидетельствует об угнетении кислородзависимого метаболизма и уменьшении резервных возможностей внутриклеточных систем фагоцитов периферической крови. Снижение индекса стимуляции в 1,5 раза не было статистически значимым, однако в какой-то степени отражало угнетение функционального резерва фагоцитов и уменьшение их эффектор-ного потенциала. Отмечалось также незначительное уменьшение числа фагоцитирующих клеток (ФА) и их поглотительной способности (ФЧ) (табл. 1).

Медицина и экология, 2008, 1

Таблица 1.

Влияние фетально-клеточной трансплантации на показатели функционально-метаболической активности фагоцитов периферической крови крыс с циррозом печени (медиана, верхний и нижний квартили)

Группа Срок эксперимента (нед.) % фагоц фч НСТсп НСТст ИС

N (п=7) 21,14 (18,0-27,0) 63,43 (60,0-69,0) 4,57 (3,0-7,0) 7,86 (7,0-10,0) 0,44 (0,3-0,6)

крысы с ЦП (п=7) 20,43 (17,0-23,0) 55,43 (45,0-61,0) 0,29* (0,0-1,0) 0,71* (0,0-2,0) 0,29 (0,0-0,5)

Контроль (п=30) 1 25,33 (16,0-39,0) 56,67 (44,0-80,0) 8,33 (5,0-14,0) 14,33 (8,0-18,0) 0,43 (0,3-0,6)

2 29,29* (25,0-31,0) 88,86* (84,0-96,0) 20,86* (14,0-33,0) 29,71* (20,0-42,0) 0,33 (0,2-0,3)

3 38,0* (35,0-40,0) 92,17* (80,0-100,0) 1,5* (0,0-2,0) 3,17* (0,0-7,0) 0,33 (0,0-0,7)

4 26,67 (24,0-29,0) 78,0* (70,0-87,0) 0,17* (0,0-0,0) 0,67* (0,0-1,0) 0,27 (0,0-0,6)

6 23,83 (22,0-27,0) 88,0* (86,0-90,0) 0,17* (0,0-0,0) 0,67* (0,0-1,0) 0,27 (0,0-0,6)

Опытная I (п=30) 1 22,17 (14,0-28,0) 64,5 (53,0-73,0) 6,5 (6,0-8,0) 10,33* (10,0-12,0) 0,36 (0,3-0,4)

2 22,67 (21,0-23,0) 64,0о (60,0-63,0) 3,83о (2,0-6,0) 7,33о (6,0-10,0) 0,48 о (0,4-0,6)

3 24,5о (20,0-30,0) 66,17о (63,0-66,0) 4,83о (3,0-6,0) 8,5о (7,0-10,0) 0,45 (0,38-0,6)

4 25,17 (23,0-28,0) 65,5о (61,0-71,0) 4,67о (3,0-6,0) 7,67о (7,0-10,0) 0,41 (0,3-0,5)

6 21,5 (13,0-27,0) 71,17 (34,0-95,0) 4,83о (3,0-6,0) 8,5о (7,0-10,0) 0,45 (0,38-0,6)

Опытная II (п=30) 1 19,67 (18,0-20,0) 68,17 (55,0-67,0) 5,83 (6,0-6,0) 10,5* (10,0-12,0) 0,43 (0,4-0,5)

2 23,67о (21,0-23,0) 65,17о (60,0-70,0) 5,17о (4,0-6,0) 9,5о (8,0-10,0) 0,44 (0,4-0,5)

3 22,33о (20,0-22,0) 62,17о (60,0-63,0) 5,83о (4,0-7,0) 9,83о (8,0-12,0) 0,45 (0,42-0,5)

4 22,5 (21,0-25,0) 62,67о (60,0-63,0) 4,5о (3,0-6,0) 9,0о (7,0-12,0) 0,5 (0,5-0,6)

6 22,0 (13,0-25,0) 74,67 (34,0-95,0) 4,67о (4,0-6,0) 9,0о (7,0-12,0) 0,47 (0,4-0,5)

* ри<0,05 - значимые различия по критерию Манна-' о ри<0,05 - по сравнению с контролем

В ходе естественного регресса патологического процесса в контрольной группе наблюдалась следующая динамика изучаемых показателей. Фагоцитарная активность в первой половине наблюдения имела тенденцию к увеличению по сравнению с исходным ЦП на 14 сут в 1,4 раза (р^0,03), а на 21 сут - в 1,9 раза (р^0,03). После чего на 4 нед. способность клеток к поглощению частиц латекса значительно снижалась до 26,67 (24,0-29,0) (р^0,03), возвращаясь к нормальным значениям, оставаясь на этом уровне и на 6 нед. Что касается фагоцитар-

и по сравнению с интактными животными;

ного индекса, то через 7 сут он существенно не изменился, однако уже на 14 и 21 сут его значение возросло в 1,6 раза (р«=0,03), в течение последующих 2 нед. индекс несколько снизился, оставаясь при этом на 38% (ри=0,01) выше аналогичного показателя интактных животных.

Динамика показателей кислородзависимой цитотоксичности фагоцитов периферической крови была однотипной: отмечалось увеличение как спонтанного, так и стимулированного НСТ-теста на 7 сут (р^0,05) по сравнению с предыдущим значением, причем более значительным

оно было в отношении спонтанного теста (в 28,7 раза). На 2 нед. оба показателя достигли своих максимальных значений - 20,86 (14,0-33,0) и 29,71 (20,-42,0), превышая норму в 4,6 и 3,8 раза соответственно. Но на 21 сут отмечено резкое угнетение спонтанной и активированной кисло-родзависимой цитотоксичности (р^0,05), после чего показатели находились приблизительно на одном уровне до конца наблюдения, составляя 3,7% и 8,5% от нормальных значений соответственно. Что касается индекса стимуляции, то, хотя его колебания не были статистически значимыми как в группе, так и по отношению норме, они претерпевали следующие изменения: на 1 нед. отмечено увеличение в 1,5 раза по сравнению с исходным циррозом (р«>0,05) с последующим снижением к концу эксперимента в 1,6 раза (ри>0,05) относительно значений здоровых животных.

Динамика количества фагоцитирующих клеток у животных, которым осуществлялась фетально-клеточная терапия, не претерпевала существенных изменений на протяжении всего периода наблюдения, не отличаясь при этом от показателей интактных животных. Причем фагоцитарная активность в I и II опытных группах на 14 сут была в 1,3 и 1,2 раза, а на 14 сут в 1,5 и 1,7 раза меньше по сравнению с контролем в те же сроки (ри<0,05). Трансплантация фетальных клеток не приводила к изменению уровня поглотительной способности фагоцитов, который в течение всего эксперимента находился в пределах нормальных значений. В обеих группах на 2 и 3 нед. этот параметр был меньше аналогичного показателя контрольной группы в 1,4 раза (ри<0,01), на 4 нед. - в 1,2 раза (ри<0,05).

Анализ спонтанной кислородзависимой цитотоксичности показал, что к 7 сут в обеих опытных группах она повышалась по сравнению с исходным циррозом в I группе до 6,5 (6,0-8,0), во II - до 5,83 (6,0-6,0), не отличаясь достоверно от нормы и не претерпевая в ходе дальнейшего наблюдения существенных изменений. Что касается стимулированного НСТ-теста, то его динамика в группах животных, получивших оба вида клеточной терапии, также была однотипной. На 7 сут после трансплантации в обеих группах зарегистрировано повышение показателя в 14 раз (р«<0,05), который при этом достоверно превышал норму на 31% (ри<0,05). На 2 нед. кислоро-дзависимая цитотоксичность фагоцитов снизилась в I опытной группе в 4 раза, во II - в 3 раза по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы (ри<0,05), статистически значи-

мо не отличаясь от значений стимулированного НСТ-теста интактных крыс. После чего до конца эксперимента количество формазан-положитель-ных клеток в периферической крови существенно не изменялось, причем их было достоверно больше, чем контроле (ри<0,05). Необходимо отметить, что индекс стимуляции в обеих опытных группах на протяжении всего срока наблюдения не претерпевал значительных изменений и не отличался достоверно от аналогичного значения здоровых животных.

Таким образом, формирование токсического ЦП сопровождается угнетением спонтанного и стимулированного НСТ-теста и не влияет достоверно на показатели фагоцитоза. В начале спонтанного регресса патологического процесса происходит активация фагоцитарной способности и НСТ-теста, что, по всей вероятности, отражает адаптационные сдвиги в организме, направленные на мобилизацию неспецифических защитных механизмов. В последующем отмечается нормализация числа фагоцитирующих клеток при сохраняющейся повышенной поглотительной способности. Патологический процесс приводит к истощению защитных механизмов и угнетению функционально-метаболической активности фагоцитов. В свою очередь недостаточная реализация функций микро- и макрофагов может способствовать затяжному течению воспалительного процесса и проявляться усилением пролифера-тивных реакций. Оба вида фетально-клеточной трансплантации оказывают положительное влияние на показатели фагоцитоза и кислородзависи-мого метаболизма нейтрофилов и моноцитов периферической крови, что свидетельствует о прекращении стимулирующих воздействий на них, стихании воспалительного процесса и восстановлении гомеостаза.

ЛИТЕРАТУРА

1. Адо А. Д. Современное состояние учения о фагоцитозе /А. Д. Адо, А. Н. Маянский //Иммунология. - 1983. - №1. - С. 20 - 26.

2. Маянский А. Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге /А. Н. Маянский, Д. Н. Маянский. -Новосибирск, 1989. - 341 с.

3. Тотолян А. А. Клетки иммунной системы / А. А. Тотолян, И. С. Фрейдлин. - СПб: Наука, 2000. - 231 с.

4. Хаитов Р. М. Основные задачи клинической иммунологии по изучению функционирующих клеток /Р. М. Хаитов, Б. В. Пинегин //Иммунология. - 1995. - №3. - С. 6 - 11.

Поступила 14.02.08

Медицина и экология, 2008, 1

Zh. A. Doskaliev, V. P. Grigorevskiy, S. S. Amanbayev, B. A. Dzhusipov

TRANSPLANTATION INFLUENCE OF FETAL CELLS ON THE FUNCTIONAL ACTIVITY OF PHAGOCYTES AT RATS WITH EXPERIMENTAL CIRRHOSIS

Intrahepatic transplantation of allogenic fetal cells was carried out in rats with experimental cirrhosis. Fetal cells of liver and spleen were administrated to animals of experimental group 2, only fetal hepatocytes - to experimental group 1. Dynamics of indicators of phagocytosis and oxygen dependent cytotoxicity was estimated. It is shown, that both types of fetal-cellular transplantation make positive impact on indicators of phagocytosis and oxygen dependent metabolism of neutrophils and monocytes, that indicates about the termination of stimulating influences on them, decrease of inflammatory process and homeostasis restoration.

Ж. А. Доскалиев, В. П. Григоревский, С. С. Аманбаев, Б. А. Джусипов

ФЕТАЛДЫ ЖАСУШАЛАР ТРАНСПЛАНТАЦИЯСЫНЫЦ ЭКСПЕРИМЕНТА БАУЫР ЦИРРОЗЫ БАР ЕГЕУК¥ЙРЬЩТАРДЬЩ ФАГОЦИТТЕР1НЩ ФУНКЦИОНАЛДЫ БЕЛСЕНД1Л1Г1НЕ ЭСЕР ЕТУ1

Тэжiрибедеri бауыр циррозi бар егеукуйрыктарра аллогендi феталды жасушалардыч бауырра трансплантациясы жасалды. Тэжiрибедегi 2 топтары жануарларра феталды бауыр жэче кекбауыр жасуша-лары енгiзiлдi, 1 топтары жануарларра тек феталды гепатоциттер енгiзiлдi. Фагоцитоз жэне цитотоксикалык оттегiтэуелдiлiк керсетюштер^щ езгерiстерi бараланды. Феталды жасушалар трансплантациясыныч ею тYрiде фагоцитоз керсеткiштерiне, нейтрофилдердщ оттептэуелдтк метаболизмiне жэне перифериялык канныч моноциттер^е колайлы эсер етедi, ол ез алдына ынталандыру эсерiнiк токтатылрандырын, кабыну процессшщ бэсечдегеын жэне гомеостаздыч калпына келгенiн керсетедi.

Ю. А. Шустеров, Д. С. Карибаева

ПРИМЕНЕНИЕ МОДИФИЦИРОВАННОГО ШОВНОГО МАТЕРИАЛА ПРИ ТРАВМАХ ФИБРОЗНОЙ КАПСУЛЫ ГЛАЗА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Кафедра глазных болезней Карагандинской государственной медицинской академии, МСЧ «Шахтер-Испат-Кармет» (Караганда)

Травмы органа зрения являются одной из основных причин слепоты и слабовидения у лиц трудоспособного возраста. До 30% всех случаев первичной инвалидности по зрению обусловлены травмами органа зрения и их исходами [5]. В Республике Казахстан в структуре причин инвалидности по зрению травмы глаза составляют 12,1% [7]. Самыми распространенными являются проникающие ранения глазного яблока, в 5766% - повреждения роговицы [2]. Больше чем в половине случаев выполняются реконструктивные операции на базе сквозной кератопластики (53,4%) [6]. Величина и локализация проникающего ранения во многом определяют развитие и тяжесть осложнений, влияющих на исход травмы. Решающее значение в профилактике осложнений механических травм принадлежит оказанию квалифицированной ПХО ран глазного яблока, которая не всегда выполняется на должном уровне в зонах, труднодоступных для ушивания (задний полюс глаза, склера под экстраокулярными мышцами). Возникающая после этого необходимость повторной обработки (в 10% случаях) проникающих ран свидетельствует о неполной герметизации повреждений фиброзной капсулы глаза [4, 8].

Качество шовного материала, используемого при герметизации различных ран фиброз-

ной капсулы глаза, является одним из определяющих факторов успешного проведения и конечного результата офтальмологических операций.

В связи с этим продолжается поиск новых и модификация уже имеющихся шовных материалов, изучается их влияние на окружающие ткани. Повышение биосовместимости существующих синтетических шовных материалов продолжает оставаться актуальной проблемой офтальмологии [1]. Одним из перспективных методов модификации является плазмохимический [3].

Целью исследования явилось изучение реакции роговицы и склеры кролика на применение обработанного в газоразрядной плазме синтетического шовного материала.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на взрослых кроликах. Исследовали шовный материал капрон, нейлон, полипропилен 10/0. Разработан способ улучшения биологической совместимости и снижения токсичности синтетических материалов - обработка в низкотемпературной газоразрядной плазме, которая создавалась высокочастотным емкостным разрядом при давлении 0,5 Торр, с использованием генератора частотой 14 МГц.

Используя микрохирургическую технику, животным под наркозом осуществляли линейный разрез роговицы и склеры. Края раны роговицы ушивали непрерывным швом по Пирсу, на склеру накладывали узловые швы, применяя один из материалов, подвергнутых плазмохимической обработке. Контролем служил парный глаз, на котором проводились аналогичные оперативные вмешательства с применением интактного шовного материала. С целью изучения реакции роговицы кроликов на модифицированный шовный материал, а также проведения сравнительной оценки исследуемых и интактных нитей животные были разделены на 3 группы, в каждой из