CC BY
20
Ж. А. Доскалиев, В. П. Григоревский, С. С. Аманбаев, А. В. Цой
БИОХИМИЧЕСКИЕ И ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ КРЫС С ЦИРРОЗОМ ПЕЧЕНИ ПОСЛЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ ФЕТАЛЬНЫХ КЛЕТОК
Кафедра хирургии ФДМО Казахской государственной медицинской академии (Астана)
В последнее время одним из перспективных методов коррекции хронических диффузных поражений печени является трансплантация фе-тальных гепатоцитов. Терапевтический эффект при этом связывают с поступлением в организм реципиента эмбриоспецифических ростовых факторов, цитокинов и ряда сигнальных молекул, способных активировать регенерацию и выживание клеток реципиента [3, 4, 6, 7]. Появились сообщения исследователей о том, что для воссоздания более мощной регуляции восстановительных процессов в поврежденный печени можно использовать и селезеночную ткань, которой присуща не только иммуногенетическая, но и морфогенетическая функция [1, 2, 5].
Целью исследования явилось изучение изменений некоторых биохимических и гематологических показателей крови крыс с циррозом печени после аллотрансплантации криоконсерви-рованных клеток фетальной печени и селезенки.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперимент проведен на 100 половозрелых белых крысах обоего пола массой 150-170 г, цирроз печени был вызван подкожным введением 50% масляного раствора СС14 в дозе 0,2 мл/100 г массы тела, трижды в неделю на протяжении 3 мес.
Клетки фетальной печени и селезенки выделяли из соответствующих органов плодов беременных крыс 17-18-дневного срока гестации комбинированным (механический+ферментатив-ный) способом. Клетки замораживали под защитой 10% диметилсульфоксида (ДМСО) со скоростью - 1-20С/мин до -850 С. После хранения в низкотемпературном холодильнике и отогрева на водяной бане при t +400С жизнеспособность составляла не менее 90,5±0,6%. Трансплантацию клеточных суспензий (0,5 мл на 100 г массы) осуществляли однократно, через сутки после прекращения курсового введения СС14, под эфирным наркозом, чрескожно в паренхиму печени. Животным I опытной группы вводили фетальные гепатоциты, во II опытной группе использовали клетки печени и селезенки (в соотношении 1:1). Животные контрольной группы (КГ) получали однократную внутрипеченочную инъекцию 0,5 мл физиологического раствора. Изменения биохимических (активность аминотрансфераз, альбумин) и гематологических показателей (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, уровень гемоглоби-
на) оценивали через 1, 2, 3, 4 и 6 нед. после выполнения трансплантации фетальных клеток. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы STATISTICA 6.0, с использованием критерия Манна-Уитни (U). Для описания распределения признака использовали медиану с нижним и верхним квартилями (25 и 75 процентили). Различия между группами учитывали как статистически значимые при p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Формирование токсического цирроза печени приводило к увеличению количества эритроцитов в венозной крови до 7,0 (6,9-7,2)х1012/л (Ри=0,007) и снижению уровня гемоглобина на 18,4% от нормы (pu=0,002). В сравнении с показателями здоровых животных количество лейкоцитов увеличивалось более чем в 3 раза, тромбоцитов - в 2,5 раза (pu=0,002) (табл. 1). Также происходило значительное изменение биохимического профиля сыворотки крови: так, активность АЛТ и АСТ превышала норму в 5,7 и в 3,5 раза соответственно, содержание альбумина снизилось на 41% по сравнению с интактными животными (табл. 2).
Процесс спонтанной регенерации патологического процесса в КГ сопровождался следующей динамикой показателей гемограммы. Так, на 7 сут после прекращения введения CCI4 наблюдалось значимое снижение уровня эритроцитов до 5,9 (5,7-6,1)х1012/л. Этот процесс продолжался на протяжении последующих 3 нед. наблюдения, когда количество эритроцитов достигло своего наименьшего показателя - 4,5 (3,7-5,2)х1012/ л. К 6 нед. содержание эритроцитов в крови крыс КГ повысилось до 5,5 (5,4-5,7)х1012/л, однако не достигло при этом показателей интактных животных. Существенных изменений уровня гемоглобина на протяжении всего периода наблюдения отмечено не было, на последнем сроке исследования его уровень достиг 124,8 (120,0-129,0) г/л. В ходе естественного регресса цирроза печени наблюдалось постепенное уменьшение лейкоцитоза (на 4 нед. до 8,9 (7,9-9,4)х109/л), однако к концу наблюдения количество лейкоцитов вновь увеличилось до 13,3 (10,2-14,9)х109/л. Несколько иной была динамика содержания тромбоцитов, снижение количества кровяных пластинок на 14 сут до 759,6 (640,0-887,0)х109/л на 21 сут сменилось незначительным подъемом (848,3 (710,0-1024,0)х109/л), после чего на 4 нед. зафиксирована тромбопения до 273,3 (235,0-285,0)х109/л и незначительный подъем к концу наблюдения до 343,0 (285,0-378,0)х109/л.
При изучении гемограммы опытных крыс, которым выполнялась фетально-клеточная трансплантация, динамика анализируемых показателей отличалась от результатов контрольной группы. Так, в I группе наблюдалось снижение содержания эритроцитов на 7 сут до 5,3 (5,1-5,7) х1012/л по сравнению с исходными показателями, с последующим постепенным увеличением и нормализацией количества красных кровяных телец
на 6 нед. наблюдения. Отмечалось плавное нарастание уровня гемоглобина, достигшего к концу исследования 138,2 (129,0-148,0) г/л, что не отличалось достоверно от соответствующего показателя здоровых крыс, и превышавшего аналогичный показатель в КГ в тот же срок наблюдения (ри=0,04).
Динамическое изучение содержания лейкоцитов у животных I группы показало постепенное снижение их количества по сравнению с 1 нед. наблюдения, причем с 14 сут исследуемые показатели были статистически значимо меньше уровня лейкоцитов контрольных крыс в соответствующие сроки эксперимента (ри<0,05). С 4 нед. уровень лейкоцитов возвратился к нормальным значениям. Трансплантация фетальных гепатоцитов приводила к снижению количества тромбоцитов в 1,5 раза через 7 сут после проведения клеточной терапии (ри=0,04) с нормализацией их количества на 4 нед. исследования. Причем уровень тромбоцитов крови стал достоверно ниже по сравнению с КГ на 3 и 4 нед. наблюдения (Ри<0,05).
Изучение общеклинического анализа крови крыс, перенесших введение фетальных клеток печени и селезенки, показало, что на протяжении всего срока эксперимента количество эритроцитов существенно не отличалось от нормальных значений, с 1 по 4 нед. превышая аналогичный показатель в КГ (ри<0,05), а на 1 и 3 нед. в I группе (ри<0,05). Уровень гемоглобина повысился до 137,3 (130,0-147,0) г/л и не отличался от показателей интактных животных уже на 14 сут,
с 4 по 6 нед. был выше соответствующих значений в контрольной, а со 2 по 4 нед. - во II группе (pU<0,05). Изменение уровня тромбоцитов было аналогично показателям I группы, за исключением более ранней (на 3 нед.) нормализации количества кровяных пластинок.
Изучение изменений биохимических показателей показало (табл. 2), что на 7 сут исследования в обеих опытных группах отмечалось снижение активности АЛТ по сравнению с контролем, однако более выраженным оно было у животных после трансплантации фетальных клеток печени и селезенки - до 2,3 (1,6-3,2) мккат/л (ри<0,01), при этом достоверно не отличаясь от соответствующего значения интактных животных. Нормализация уровня АЛТ в I группе зарегистрирована на 3 нед. Уже через 7 сут фетально-клеточная трансплантация привела к достоверному по сравнению с контролем уменьшению активности АСТ в I группе в 1,5 раза (ри<0,05) и в 1,7 раза (ри<0,01) во II группе. Эта тенденция сохранялась и спустя 2 нед., причем уровень АСТ в II группе на 14 сут. наблюдения уже достоверно не отличался от показателя здоровых крыс. К 21 сут в I группе анализируемый показатель существенно не изменился и достиг нормальных значений только на 4 нед эксперимента. В процессе естественного регресса цирроза печени у животных контрольной группы наблюдалось постепенное снижение уровня аминотрансфераз с возвращением к нормальным значениям к 6 нед. наблюдения.
Таблица 1.
Влияние фетально-клеточной трансплантации на показатели гемограммы крыс с токсическим циррозом
печени (медиана, верхний и нижний квартили)
Показатель Срок Эритроциты (1012/л) Гемоглобин (г/л) Лейкоциты (109/л) Тромбоциты (109/л)
Интактные животные (n=7) 6,1 (5,7-6,5) 147,4 (144,0-150,0) 5,2 (4,9-5,5) 427,1 (380,0-470,0)
Животные с ЦП (n=8) 7,0 (6,9-7,2) 120,0 (119-121) 16,3 (11,2-20,0) 1105,1 (880,0-1288,0)
КГ (n=32) 1 2 3 4 6 5,9 (5,7-6,1) 5,2 о (5,0-5,4) 5,0 о (4,9-5,1) 4,5 о (3,7-5,2) 5,5 о (5,4-5,7) 120,1 о (115,0-124,0) 119,9 о (109,0-134,0) 120,3 о (117,0-125,0) 115.7 о (106,0-126,0) 124.8 о (120,0-129,0) 15,8о (13,7-19,0) 14,3о (10,6-14,3) 10,7 о (9,4-12,5) 8,9о (7,9-9,4) 13,3 о (10,2-14,9) 808,3о (576,0-984,0) 759,6о (640,0-887,0) 848,3о (710,0-1024,0) 273,3о (235,0-285,0) 343,0 о (285,0-378,0)
I группа (n=30) 1 2 3 4 6 5,3 * (5,1-5,7) 5,3 о (4,7-6,0) 5,5 о (5,1-6,0) 5,7 * (5,2-6,0) 5,9 (5,6-6,3) 119,2 (117,0-123,0) 122,8 (117,0-125,0) 125,0 о (122,0-129,0) 127,5 о (120,0-135,0) 138,2 * (129,0-148,0) 14,3 о (13,4-15,4) 10,1 о * (8,3-12,4) 8,0 о * (6,8-9,4) 5,9 * (4,7-7,5) 4,5 * (4,0-5,0) 720,8о (576,0-850,0) 724,2о (600,0-824,0) 600,3о * (458,0-700,0) 437,0 * (384,0-495,0) 447,8 (392,0-525,0)
II группа (n=30) 1 2 3 4 6 6,8 * • (6,5-7,5) 6.2 * (5,5-7,2) 6,4 * • (6,0-6,7) 6.3 * (5,6-6,8) 5,7 * (4,5-6,7) 122,8 о (119,0-126,0) 137,3 * • (130,0-147,0) 140,5 * • (130,0-154,0) 142,5 * • (130,0-156,0) 144,0 * (130,0-160,0) 11,8 * • (10,5-12,7) 7,2 о * • (6,1-9,1) 7,6 о * (6,8-8,0) 6,3 о * (5,7-6,8) 5,7 * (5,0-6,8) 795,0 о (760,0-850,0) 679,5 о (547,0-775,0) 513,3 * (410,0-554,0) 426,5 * (360,0-512,0) 403,7 (348,0-443,0)
* ри<0,05 значимые различия по критерию Манна-Уитни по сравнению с контрольной группой; • ри<0,05 по сравнению с I группой; о ри<0,05 по сравнению с интактными животными
Медицина и экология, 2007, 4
Таблица 2.
Влияние фетально-клеточной трансплантации на биохимические показатели функции печени (медиана,
верхний и нижний квартили)
Показатель Срок АЛТ (мккат/л) АСТ (мккат/л) Альбумин (г/л)
Интактные животные (п=7) 1,2 (1,0-1,4) 2,4 (1,9-2,8) 30 (28,5-30,7)
Животные с ЦП (п=8) 6,8 (1,7-10,3) 9,8 (5,1-13,9) 17,7 (15,8-20,1)
КГ (п=32) 1 5,4 о (4,6-6,8) 7,9 о (6,7-9,1) 18,9 о (17,2-20,6)
2 3,9 о (2,7-4,8) 7,2 о (5,8-8,4) 20,5 о (18,9-22,7)
3 3,5 о (1,8-5,2) 5,7 о (4,8-6,7) 21,9 о (20,0-23,5)
4 3,0 о(,2-3,9) 4,2 о(3,5-5,3) 22,6 о (22,5-24,4)
6 1,9(0,8-3,7) 2,6 (2,4-3,1) 25,2 о (23,3-26,3)
I группа (п=30) 1 3,3 о * (1,9-4,6) 5,4 о* (4,1-6,9) 20,5 о (19,2-22,3)
2 3,0 о (2,3-3,6) 4,9 о* (3,8-5,9) 24,1 о* (22,3-25,9)
3 1,6(1,0-2,1) 4,0 о(2,5-5,5) 23,8 о (19,4-27,0)
4 1,3 *(0,8-1,7) 3,0 (2,4-3,8) 26,2 * (24,5-29,0)
6 1,2(0,8-1,5) 2,0 (1,5-2,4) 27,1 (24,5-30,3)
II группа (п=30) 1 2,3 о* (1,6-3,2) 4,8 о* (4,3-5,4) 20,9 о (19,3-22,7)
2 1,8 •* (1,5-2,2) 3,4 * (2,1-4,3) 25,5 * (22,5-28,7)
3 1,9 (1,0-2,1) 2,6 * (2,4-3,0) 29,3 •* (28,8-30,5)
4 1,5 * (1,0-2,1) 2,5 * (2,3-3,0) 29,1 * (27,8-30,4)
6 1,0 (0,5-1,3) 2,3 (1,6-3,0) 28,3 (25,3-32,5)
о ри<0,05 по сравнению с показателем интактных крыс, * ри<0,05 по сравнению с контрольной группой, • Ри<0,05 по сравнению с I группой
Оба метода клеточной терапии вызвали увеличение концентрации альбумина по сравнению с контролем уже на 1 нед. после трансплантации, однако статистически достоверным (ри=0,03) этот процесс был на 2 и 4 нед. в I группе и на 2, 3 и 4 нед. во II группе. Нужно отметить, что восстановление белково-синтетической функции печени активнее происходило во II группе - уже на 14 сут наблюдения уровень альбумина статистически значимо не отличался от значений здоровых животных (нормализация аналогичного показателя в I группе произошла на 3 нед.).
Максимальная концентрация альбумина (28,8-30,5 г/л) была отмечена во II группе через 14 сут, достоверно отличаясь от аналогичных показателей в контроле (ри=0,006) и в I группе (ри=0,04) в те же сроки наблюдения. Постепенное увеличение содержания альбумина наблюдалось и у животных КГ. Однако даже к концу срока наблюдения полного восстановления белково-синтетической функции печени не произошло.
Таким образом, в ходе спонтанной регенерации патологического процесса в печени не происходило нормализации изучаемых показателей гемограммы и уровня сывороточного альбумина. Фетально-клеточная терапия в целом оказала сходные эффекты, заключавшиеся в коррекции нарушенных биохимических и гематологических показателей крови крыс с токсическим циррозом печени. Однако трансплантация феталь-ных гепатоцитов в сочетании с клетками феталь-ной селезенки оказала более выраженное корригирующее влияние на гемограмму, эффективнее восстановила белково-синтетическую функцию печени и купировала цитолитический синдром.
ЛИТЕРАТУРА
1. Апарцин К. А. Хирургическая профилактика и способы коррекции послеоперационного гипо-спленизма: Автореф. дис. ...д-ра мед. наук. -Иркутск, 2001. - 293 с.
2. Базиева Ф. Х. Поддержание функций пораженной печени методом экстракорпоральной гемоперфузии через взвесь криоконсервирован-ных изолированных гепатоцитов и фрагментов селезенки: Автореф дис. ...канд. мед. наук. - М., 1992. - 34 с.
3. Влияние трансплантации фетальных тканей на репаративные процессы при экспериментальном циррозе печени /А. Н. Батанов, Л. Я. Эберт, П. Г. Димов, С. А. Пышкин //Бюл. экспе-рим. биологии и медицины. - 2000. - №8. - С. 216 - 219.
4. Омарова К. П. Патогенетическое обоснование пересадки эмбриональных гепатоцитов при различных формах печеночной недостаточности (экспериментальное исследование): Автореф. дис. .д-ра мед. наук. - Актобе, 2001. - 38 с.
5. Онищенко Н. А. Гемоперфузия через донорские гепатоциты и фрагменты селезенки повышает эффективность лечения хронической печеночной недостаточности традиционными методами /Н. А. Онищенко, Ф. Х. Базиева, И. Г. Оржеховская //Терапевт. арх. - 1995. - №32. -С. 7 - 10.
6. Репин В. С. Медицинская клеточная биология /В. С. Репин, Г. Т. Сухих. - М., 1998. - 200 с.
7. Сухих Г. Т. Трансплантация эмбриональных гепатоцитов: экспериментальное обоснование нового подхода к лечению недостаточности печени /Г. Т. Сухих, А. А. Штиль //Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2002. - №12. - С. 604 -610.
Zh. A. Doskaliyev, V. P. Grigorevskiy, S. S. Amanbayev, A. V. Tsoy
BIOCHEMICAL AND HEMATOLOGICAL PARAMETERS OF BLOOD OF RATS WITH A LIVER CIRRHOSIS AFTER TRANSPLANTATION OF CRYOPRESERVED FETAL CELLS
To rats with experimental liver cirrhosis intrahepatic transplantation of cryopreserved allogenic fetal cells was carried out. To animals of skilled group 2 entered liver and spleen fetal cells, in skilled group 1 -only fetal hepatocytes. Dynamics of such biochemical and hemogram parameters, as AST, ALT, aalbumin, erythrocytes, hemoglobin, trombocytes, leukocytes was estimated.
Ж. А. Досцалиев, В. П. Григоревский, С. С. Аманбаев, А. В. Цой
КРИОКОНСЕРВАЦИЯЛАНРАН ФЕТАЛДЫ ЖАСУШАЛАРДЫ ТРАНСПЛАНТАЦИЯЛАРАННАН КЕЙ1НГ1 БАУЫР ЦИРРОЗЫ БАР ЕГЕУК¥ЙРЫКТАРДЫЦ БИОХИМИЯЛЬЩ ЖЭНЕ ГЕМАТОЛОГИЯЛЫК К0РСЕТК1ШТЕР1
Тэжiрибедегi бауыр циррозi бар егеукуйрыктарра aллогендi криоконсервацияланран феталды жасушалардьщ бауырра трансплантациясы жасалды. Тэжiрибедегi 2 топтары жануаларра феталды бауыр жэке кекбауыр жасушалары енгiзiлдi, 1 топтары жануаларра тек феталды гепатоциттер енгiзiлдi. АСТ, АЛТ, альбумин, эритроциттер, гемоглобин, тромбоциттер, лейкоциттер сиякты биохимиялык жэне гематология-лык керсетюштердщ езгерiстерi бараланды.
Медицина и экология, 2007, 4
