Влияние растворимых факторов, вырабатываемых перисинусоидальными клетками печени, на мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга крысы Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

Целью исследования было подобрать криопротектор и режим, при котором после размораживания сохраняется морфологическая структура ткани и жизнеспособность клеток. Показателем жизнеспособности служила пролиферация МСК при культивировании, а ткань исследовали на гистологических срезах.

Плаценту размораживали в водяной бане + 40°С до 0°С, постепенно добавляли раствор Хэнкса, снижая концентрацию криопротектора в 3 раза, переносили в 0,1% раствор коллагеназы и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Клетки выделяли на фи-колле (1,077 г/л), отмывали в PBS, и сажали 1 х108/см2 в среду ДМЕМ + 10% FBS на культуральный пластик, смену среды проводили каждые 3 сут.

При гистологическом исследовании особых нарушений структуры размороженной ткани не обнаружено, только при использовании пропандиола отмечена повышенная дегидратация ядер. В дальнейшем для криоконсервирования применяли программу с 0,7 М ДМСО.

При культивировании на 5—8 сут. появлялись колонии фибробластоподобных клеток, которые на протяжении 10—15 сут. образовывали монослой. При достижении 80% конфлюэнтного состояния клетки снимали раствором 0,25% трипсина с ЗДТА и проводили фе-нотипирование. Клетки имели фенотип МСК: CD105 + , CD90+, CD73 + , CD34-, CD45-, CD14-. Культуру вели в течение 6 пассажей и замораживали.

Таким образом, метод криоконсервирования под защитой 0,7 М ДМСО позволяет сохранить ворсинчатую ткань плаценты и выделить из нее МСК. Возможность использования их в клинической практике требует более детального изучения.

А.К. Шафигуллина, А. А. Трондин, А.Р. Шайхутдинова, М.С. Калигин, И.М. Газизов, А.А. Гумерова,

А.П. Киясов

Влияние растворимых факторов, вырабатываемых перисинусоидальными клетками печени, на мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга крысы

ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», Казань, Россия [email protected]

А.К. Shafigullina, А.А. Trondin, A.R. Shaihutdinova,

M.S. Kaligin, I.M. Gazizov, A.A. Gumerova, A.P. Kiyasov Study of the influence of Hepatic Perisinusoidal Cells paracrine secretion on culture of Bone Marrow-derived mesenchymal stem cells

Перисинусоидальные клетки печени (ПКП) — популяция клеток, обладающая различными свойствами — накапливать витамин А, трансформироваться под воздействием неблагоприятных факторов в миофиброб-ласты и продуцировать коллаген, являясь при этом источником соединительной ткани при фиброгенезе печени. В то же время, было высказано предположение, что ПКП, благодаря секреции факторов роста и прямых межклеточных контактов, создают микроокружение, необходимое для дифференцировки прогени-торных клеток в гепатоциты.

Цель исследования: изучить влияние растворимых факторов, вырабатываемых перисинусоидальными клетками печени на мезенхимальные стволовые клетки костного мозга крысы в условиях in vitro.

Материал и методы: перисинусоидальные клетки печени были выделены методом коллагеназно-про-назной перфузии печени крысы с последующим разделением клеток в градиенте плотности гистоденза. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) костного мозга крысы были выделены путем селективной адгезии к пластику. Далее было проведено культивирование ММСК клеток на среде ПКП. В качестве контроля ММСК культивировали в питательной среде ДМЕМ (Б!дта, США) с 10% содержанием бычьей сыворотки и 100 Ед/мл пенициллина — 100 мкг/мл стрептомицина. Морфологические признаки клеток оценивали методами фазово-контрастной и флуоресцентной микроскопии. Фенотипические признаки выделенных клеток изучали методами им-муноцитохимического анализа и ПЦР в реальном времени.

Результаты. Из первичной культуры ММСК и ПКП была выделена мРНК для последующего анализа экспрессии генов СК19 и У-САМ. Согласно данным РТ-ПЦР экспрессия мРНК СК19 отсутствовала в культуре ММСК и была отмечена в культуре ПКП. По данным ПЦР в реальном времени экспрессия мРНК У-САМ в культуре ПКП была в 100 раз выше, чем культуре ММСК.

На 2-е сут. культивирования ММСК в среде ПКП было отмечено изменение их морфологии — уменьшение размеров клеток и укорочение их отростков, в то время как в контроле они были вытянутой веретенообразной формы. На 5-е сут. культивирования ММСК в среде клеток ПКП было отмечено повышение пролиферативной активности ММСК по сравнению с контролем. Изменений со стороны экспрессии маркеров мезенхимальных клеток (виментин, десмин, —-ГМА) и С-кШ не было.

На 21 -е сутки культивирования ММСК в среде ПКП было отмечено появление экспрессии эпителиальных маркеров СК18, СК19. На 28-е сут. экспрессия СК18 и СК19 была и в контрольной группе клеток, что свидетельствует о спонтанной эпителиальной диффе-ренцировке клеток. В опытной культуре клеток на 28-е сут. было выявлено наличие экспрессии ЕБА, Вс1-2 и С-теЬ и экспрессия маркеров гепатобластов/ гепатоцитов НБА и —-ЕР, что свидетельствует о возможности гепатоцитарной дифференцировки ММСК. В контрольной группе экспрессии данных маркеров не было.

Выводы. В ходе экспериментов по изучению пара-кринных влияний со стороны ПКП на ММСК были выявлены повышение уровня их пролиферации, изменения морфологии и фенотипа ММСК. Появление экспрессии эпителиальных маркеров ЕБА, СК18 и СК19

—

ет о способности ММСК к гепатоцитарной дифферен-цировке при паракринной регуляции со стороны ПКП. Полученные данные подтверждают гипотезу о роли ПКП в создании микроокружения для прогениторных клеток и их влиянии на дифференцировку данных клеток в гепатоциты.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 3, 2010