CC BY
120
ии диффе-ренцировки ММСК в гепатоциты факторов роста, определяющих первичную дифференцировку эпителиальных клеток передней кишки в гепатоциты в ходе пренатального онтогенеза млекопитающих. Наиболее значимыми среди них являются фактор роста фибробластов 4 (FGF-4), необходимый на начальном этапе дифференцировки для формирования зачатка печени in vivo [20—23] и фактор роста гепатоцитов (HGF), имеющий важное значение на средних этапах дифференцировки и поддерживающий фетальные гепатоциты [23—25].
Применение данных факторов и их комбинаций уже позволило получить ряд важных результатов. Так, ММСК из разных источников (костного мозга крысы, пуповинной крови человека) при определённых условиях культивирования с использованием дексаметазона, эпидермального фактора роста (EGF), HGF, FGF-1, FGF-4 и онкостатина М в течение трёх недель приобретали морфологию и фенотип ге-патоцитов и начинали выполнять ряд специфических для них функций, таких, как синтез мочевины, секреция альбумина, индукция цитохрома р450 [26—31]. При этом важным оказалось применение при культи-
вировании комбинации FGF-4 и HGF [32—35] — в этом случае отмечены более высокие уровни экспрессии а-фетопротеина (а-ФП), альбумина и цитокератина 18 культивируемыми клетками. Большой интерес вызывает также работа Снайкерса с коллегами [36], в которой было установлено, что добавление FGF-4 и HGF в последовательности, характерной для нормального развития печени, вызывает более быструю и эффективную дифференцировку ММСК в гепатоциты, чем применение обоих факторов одновременно [23].
Полученные данные привели к закономерному вопросу: если гепатоцитарная дифференцировка ММСК наилучшим образом происходит в условиях, имитирующих эмбриональное развитие печени, то не будет ли ещё более оптимальным помещение культивируемых клеток в среду, воспроизводящую их естественное микроокружение в процессе прена-тального развития? Известно, что микроокружение клеток формируется главным образом благодаря непосредственным межклеточным контактам с популяцией стромальных клеток и секретируемым ими факторам роста [37]. Какие же клетки могут играть роль такого микроокружения?
По нашему мнению, таким клеточным типом являются звёздчатые клетки печени (ЗКП). Именно они создают микроокружение как для фетального печёночного гемопоэза, так и для дифференцировки гепатоцитов и холангиоцитов в ходе пренатального развития [38—41]. Более того, именно эти клетки являются важнейшим участником восстановления массы клеток паренхимы в ходе регенерации печени, как за счёт вырабатываемых ими макромолекул межклеточного матрикса и его ремоделирования [42], так и за счёт продукции факторов роста [43]. ЗКП продуцируют значительное число морфогенных цитокинов — фактор роста гепатоцитов [44, 45], эпи-дермальный фактор роста [46—48], мезенхималь-ный морфогенный протеин эпиморфин [49], плейо-трофин [50], эритропоэтин [51, 52], нейротрофин [53], оказывающих влияние на дифференцировку как эпителиальных клеток печени, так и кроветворных стволовых клеток [43]. Они также экспрессиру-ют потенциальный хемоаттрактант для кроветворных стволовых клеток стромальный фактор SDF-1a, стимулирующий их миграцию к месту гемопоэза [54], и Homebox protein Hlx [55], в случае дефекта которого нарушается как развитие самой печени, так и печёночный гемопоэз [56]. Ретиноиды, накапливаемые ЗКП, также являются важным фактором морфогенеза для кроветворных клеток [57] и эпителиев [58].
Исходя из этого, нами была выдвинута гипотеза, что звёздчатые клетки печени могут служить клеточным компонентом микроокружения, необходимым и детерминирующим дифференцировку ММСК в гепа-тоциты. При этом важно установить, какие именно факторы со стороны ЗКП — растворимые и (или) контактные — оказывают наибольшее влияние на такую дифференцировку. В связи с этим ММСК костного мозга крысы мы культивировали в различных режимах: 1) в свободной от ростовых факторов среде; 2) в среде с последовательным добавлением FGF-4, HGF и инсулин-трансферин-селенит натрия (ITS) и дексаметазона, которые запускают окончательные этапы дифференцировки клеток по гепатоцитарному пути [13, 36]; 3) в культуральной среде, кондиционированной ЗКП; 4) совместно с ЗКП, отделёнными от ММСК полупроницаемой мембраной (boyden cham-
bers) 5) в смешанной культуре ММСК+ЗКП (между ко-культивируемыми клетками осуществляются как химические, так и контактные межклеточные взаимодействия).
Материал и методы
Эксперименты были проведены на культурах клеток, выделенных из белых беспородных лабораторных крыс рода Вистар весом 250—300 г, находившихся на стандартном рационе вивария и имевших свободный доступ к воде. Содержание и использование лабораторных животных соответствовало правилам и требованиям, принятым в учреждении, рекомендациям локального этического комитета и национальным законам. При проведении экспериментов животные были наркотизированы 6,4% раствором хлоралгидрата из расчёта 860 мкл на 100 г массы животного. Объектом исследования были культуры ЗКП и ММСК костного мозга крысы.
Выделение ЗКП проводили методом последовательной перфузии печени следующими растворами [59]: 80 мл GBSS, скорость перфузии 10 мл/мин; 80 мл GBSS в комбинации с 0,264 г проназы (Pronase E, Sigma), скорость перфузии 10 мл/мин; 100 мл GBSS в комбинации с 0,08 г проназы и 0,16 г коллагеназы (Collagenase Type I, Sigma), скорость перфузии 3,33 мл/мин. Далее печень была извлечена, измельчена и инкубирована в растворе GBSS в комбинации с 0,04 г проназы Е, 0,048 г коллагеназы I и 0,08 г ДНК-азы в течение 30 мин. Полученная суспензия непаренхиматозных клеток была разделена в градиенте плотности гистоденза (Histodenz, Sigma), ЗКП локализовались в верхнем слое. После промывки от гистоденза клетки были вы-
сеяны на культуральные чашки (125 тыс. кл/мл).
Одновременно из костного мозга крыс путём селективной адгезии к пластику выделяли аутогенные стромальные ММСК. Для этого были выделены бедренные кости, срезаны эпифизы и костный мозг был вымыт из диафизов фосфатно-солевым раствором Дальбекко (DPBS без ионов Ca2+ и Mg2 + , ПанЭко). После однократной промывки клеточная суспензия была высеяна на культуральную чашку. Замену питательной среды проводили через каждые 2 сут.
Все работы с культурами клеток проводились в асептических условиях в ламинарном шкафу второго уровня защиты с соблюдением общепринятых правил работы. Культивирование ММСК и ЗКП было проведено в питательной среде DMEM (Sigma, США) с 10% содержанием фетальной бычьей сыворотки (Sigma, США) и 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma) в инкубаторе при 37°C и содержании 5% СО2 во влажной атмосфере.
Для проверки нашей гипотезы мы провели культивирование ММСК в 5 различных режимах:
1) культивирование ММСК в среде, свободной от ростовых факторов — отрицательный контроль;
2) культивирование ММСК в питательной среде с последовательным добавлением факторов роста по схеме [36]: 1 сут. - FGF-4, 10 нг/мкл; 3 сут. - HGF, 20 нг/мкл, далее через каждые 3 сут. была проведена замена питательной среды с добавлением смеси HGF (20 нг/мкл), ITS и дексаметазон (20 нг/л);
3) культивирование ММСК в кондиционированной среде ЗКП;
4) культивирование ММСК совместно с ЗКП на внутрилуночковых вставках (boyden chambers — полупроницаемые мембраны, отделяющие культуры
Антитела, использованные в работе
Антиген Клон,разведение Фирма-производитель
Виментин - белок промежуточных филаментов цитоскелета мезодермальных клеток 3В4, 1:75 Dako
Десмин - белок промежуточных филаментов цитоскелета мышечных клеток, маркёр звёздчатых клеток печени D33, 1:30 Dako
а-ГМА - альфа-гладкомышечный актин, маркёр миофибробластов, гладкомышечных клеток 1A4, 1:50 Dako
PCNA - ядерный антиген пролиферирующих клеток PC10, 1:50 Dako
C-kit (CD117) - рецептор к фактору стволовых клеток, маркёр стволовых и прогениторных клеток T595, 1:400 Novocastra
ESA - эпителиальный специфический антиген VU-1D9, 1:10 Novocastra
EMA - эпителиальный мембранный антиген GF1.4, 1:100 Novocastra
C-met - рецептор к фактору роста гепатоцитов, рассеивающий фактор 8F11, 1:15 Novocastra
Цитокератин 18 - белок промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток (гепатоциты, холангиоциты) DC10, 1:20 Dako
Цитокератин 19 - белок промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток (холангиоциты, гепатобласты, овальные клетки) BA17, 1:20 Dako
Bcl-2 - антиапоптотический протеин, маркёр стволовых и прогениторных клеток 124, 1:30 Dako
А-фетопротеин - секреторный протеин гепатобластов С3, 1:200 Novocastra
HSA - специфический антиген гепатоцитов OCH1E5, 1:30 Novocastra
клеток друг от друга и обеспечивающие циркуляцию питательной среды между ними);
5) культивирование ММСК и ЗКП в контактной ко-культуре (соотношение ММСК:ЗКП = 1:1). Для дифференциации двух клеточных популяций было проведено витальное мечение клеток флуоресцентными красителями: зелёным PKH67 (Sigma) для ЗКП и красным PKH26 (Sigma, США) для ММСК согласно методике фирмы-производителя (трипсинизиро-ванная культура клеток была отмыта от сыворотки в бессывороточной питательной среде, ресуспендиро-вана в специализированном буфере Diluent C (Sigma, США), инкубирована с красителем (5 мкл красителя на 2,5 млн клеток) в течение двух минут, после чего действие красителя было прекращено путём добавления сыворотки, окрашенная культура была рассеяна на чашку).
Морфологические признаки клеток оценивали методами фазово-контрастной, флуоресцентной и световой микроскопии. Для исследования влияния факторов ЗКП на фенотип ММСК и возможность дифференцировки ММСК в гепатоциты было выполнено иммуноцитохимическое окрашивание опытных и контрольных культур на разных сроках культивирования. В работе были использованы коммерческие моноклональные антитела фирм DAKO (Denmark) и Novocastra (UK) к различным мезен-химальным, эпителиальным, в том числе гепатоци-тарным маркёрам, а также к маркёрам стволовых и прогениторных клеток (табл.). Иммуноцитохи-мическое окрашивание было выполнено методом меченых полимеров и стрептавидин-биотиновым методом в различных модификациях с использованием коммерческих визуализационных систем тех же производителей.
Результаты и обсуждение
Культура ММСК (группа 1]
В контрольной культуре ММСК на ранних сроках все клетки экспрессировали виментин. Рецептор к фактору стволовых клеток C-kit присутствовал в большинстве клеток в первые недели культивирования, и в динамике его экспрессия незначительно уменьшалась. Экспрессия десмина на начальных сроках культивирования была выявлена лишь в единичных клетках, к 21-му дню культивирования число позитивных клеток возрастало — практически все ММСК становились десмин-позитивными (рис. 1А). Позднее число десмин-позитивных клеток снижалось. Экспрессия а-ГМА имела похожую динамику, на поздних сроках культивирования число позитивных клеток несколько снижалось (рис. 1Б).
Что касается эпителиальных маркёров, то первые признаки экспрессии цитокератинов (СК) 18 и 19 можно видеть в начале третьей недели эксперимента (16 сут.). Интенсивность экспрессии цитокератинов далее нарастала, позитивные клетки располагались в основном в небольших группах плотноупакован-ных мелких клеток, и именно в них экспрессия была максимальна (рис. 1В). К 28-м сут. эксперимента практически все клетки экспрессировали СК19 и, несколько слабее, СК18. В эти же сроки единичные клетки позитивно окрашивались с антителами к специфическому эпителиальному антигену ESA. Экспрессия специфических гепатоцитарных маркёров а-ФП и HSA не была выявлена ни на одном сроке эксперимента.
Результаты этой серии экспериментов позволили нам впервые показать возможность спонтанной эпителиальной дифференцировки ММСК костного мозга крысы, о чём свидетельствовало появление в них цитокератинов и ESA. Однако данные белки не являются специфичными только для эпителиальных клеток печени, поэтому в данном случае говорить о дифференцировке ММСК именно в клетки гепатоци-тарного ряда нельзя, хотя её можно предполагать.
Рис. 1. Монокультура ММСК (группа 1): А - экспрессия десмина, 21-е сут. культивирования; Б - экспрессия а-ГМА, 14 сут.; В - экспрессия СК18,22 сут. Ув.: А, Б х20; В х10
Культура ММСК с последовательным добавлением факторов роста (группа 2)
В данной группе отмечено более раннее формирование монослоя по сравнению с контролем (8-й день эксперимента, 5-й день после добавления ИЭР). Интересно, что часть клеток монослоя имела два ядра, что является одним из характерных признаков гепатоцитов [60].
Первую неделю культивирования под действием РЭР-4 лишь очень немногие клетки экспрессирова-ли десмин и а-ГМА. После добавления ИЭР число десмин-позитивных ММСК возрастало, и при культивировании в смеси ИЗР-ИБ-йех они группировались в островки (11-й день эксперимента). Также были видны и отдельно лежащие десмин-позитивные клетки (рис. 2А). После добавления ИЭР экспрессия а-ГМА также несколько нарастала, а затем снижалась при культивировании в смеси ИЗР-ИБ-йех (так же, как это происходило и в контроле). При этом единичные а-ГМА-позитивные клетки располагались на периферии описанных клеточных островков.
Добавление факторов роста к культуре ММСК приводило к более раннему началу экспрессии эпителиальных маркёров — уже через 5 дней культивирования в единичных клетках появлялся СК19. Более того, в эти же сроки в клетках можно было видеть
и а-ФП (рис. 2Б). Экспрессия эпителиальных маркёров нарастала после добавления ИЭР: СК19 присутствовал почти во всех клетках, экспрессия была более выражена в мелких отростчатых и округлых клетках (рис. 2В), начиналась экспрессия СК18, дающая паттерн окрашивания, подобный СК19, но менее интенсивный. Также нарастала экспрессия а-ФП. Во время культивирования в смеси ИЗР-ИБ-йех число мелких округлых клеток с наиболее выраженной экспрессией цитокератинов возрастало, и они были сгруппированы в островки (рис. 2Г). На третьей неделе экспрессия а-ФП начинала снижаться, а к концу эксперимента снижалась и экспрессия цито-кератинов.
Паттерн экспрессии маркёров стволовых клеток мало чем отличался от контроля — ММСК экспресси-ровали только С-кЛ с тенденцией к снижению по мере дифференцировки клеток в ходе эксперимента.
Таким образом, добавление факторов роста в культуральную среду по предложенной схеме [36] действительно ускоряет и стимулирует дифферен-цировку ММСК не только в эпителиальные клетки, как это было в контроле, но и в гепатобласты, на что указывает появление в клетках а-ФП — секреторного белка, характерного для низкодифференцированных клеток ткани печени (гепатобластов).
Рис. 2. Культура ММСК с последовательным добавлением факторов роста (группа 2):
А - экспрессия десмина в клеточных островках и отдельных клетках, 11 сут. культивирования; Б - экспрессия а-ФП, 5 сут.; В - экспрессия СК19, более выраженная в мелких отростчатых и округлых клетках, 5 сут., Г - нарастание числа СК19-позитивных клеток после добавления к культуре смеси НБР-ИБ-Дексаметазон, 11 сут. Ув.: А, В х10; Б, Г х20
Культура ММСК-КМ в кондиционированной
среде ЗКП (группа 3)
Результаты исследования паракринных влияний со стороны ЗПК на ММСК костного мозга крысы показали, что при культивировании ММСК в кондиционированной ЗПК среде происходит изменение морфологии ММСК уже на второй день культивирования — клетки уменьшались в размерах, приобретали округлую форму, отростки их укорачивались (рис. 3А). К пятым суткам культивирования можно было наблюдать значительное возрастание числа ММСК по сравнению с контролем (группа 1).
Изучение фенотипа клеток позволило выявить, что растворимые факторы роста, выделяемые ЗКП, стимулируют ММСК к интенсивной экспрессии маркёров стволовых клеток — C-kit во всех клетках на всех сроках культивирования (рис. 3Б), на поздних сроках (28 дней) — рецептора к фактору роста гепатоцитов C-met и Bcl-2 в единичных клетках. Интересно, что при культивировании ММСК со средой ЗКП поздних пассажей Bcl-2 появляется в этих клетках раньше (в середине 3-й нед.) и в значительно большем числе клеток.
С другой стороны, экспрессия десмина и а-ГМА была существенно подавлена — на первой неделе экспрессия этих протеинов была выявлена в единичных клетках, далее постепенно их число росло, и наибольшее количество позитивных клеток было отмечено на 14-е сут. (рис. 3В, Г).
Самым же важным является то, что в процессе культивирования (на 3—4 неделях) в ММСК не только начинается экспрессия ESA и цитокератинов, которая по сравнению с контролем была более выражена, особенно в мелких клетках, число которых росло по ходу эксперимента (рис. 3Д, Е), но и практически во всех клетках появлялся а-ФП (рис. 3Ж), а в единичных клетках на 28-й день культивирования — специфический антиген гепатоцитов HSA (рис. 33).
Результаты проведенного эксперимента позволяют сделать вывод о возможности дифференцировки ММСК в гепатобласты и гепатоциты, и этот путь диф-ференцировки не запускается спонтанно, а становится возможным под воздействием паракринных факторов со стороны ЗКП. Очень важно, что в данном случае абсолютно исключена возможность слияния клеток двух популяций, что свидетельствует о возможности прямой дифференцировки ММСК в клетки гепатоцитарного ряда. При этом правомочно говорить о фенотипе не только гепатобластов, экспрессирующих а-ФП, но и гепатоцитов, поскольку в конце эксперимента отдельные культивируемые клетки начинали экспрессировать маркёр зрелых гепатоцитов — специфический маркёр гепатоцитов HSA. Таким образом, вырабатываемые ЗКП в культуральную среду факторы роста и цитокины несомненно оказывают выраженное воздействие на ММСК, повышая их потенции стволовых/прогенитор-ных клеток и стимулируя их дифференцировку в гепа-тобласты и гепатоциты. При этом важно отметить, что по мере культивирования и пассирования самих ЗКП очевидно меняется не только их фенотип, но и композиция вырабатываемых ими факторов, на что указывает изменение паттерна экспрессии Bcl-2 ММСК, культивируемых в среде ЗПК поздних пассажей.
Сравнение же результатов данного эксперимента с результатами, полученными при культивировании ММСК с добавлением факторов роста (группа 2), позволят сказать, что они имеют ряд серьёзных отличий. Во-первых, добавление факторов роста не
позволило получить клетки, стойко сохраняющие экспрессию эпителиальных маркёров и а-ФП — к концу эксперимента она существенно снижалась. Во-вторых, в этой группе не удалось получить даже единичных клеток, экспрессирующих маркер зрелых гепатоцитов HSA, тогда как такие клетки были выявлены в культуре ММСК при культивировании в среде, переработанной ЗКП.
Ко-культура ММСК+ЗКП, разделённых полупроницаемой мембраной (группа 4) Ко-культивирование ММСК с ЗКП на внутрилу-ночковых вставках (Boyden chambers) показало, что в этом случае с морфологией клеток происходят изменения, подобные описанным для ММСК, культивируемым в кондиционированной среде ЗКП. При этом, однако, выявлены определённые отличия между клетками данных серий экспериментов. Так, в группе 4 экспрессия десмина была достаточно выраженная и сохранялась на всех сроках эксперимента, позитивные клетки располагались вокруг островов.
Экспрессия цитокератинов была выявлена на 3—4-й нед. эксперимента и нарастала в динамике по интенсивности и числу окрашенных клеток. Позитивные клетки преимущественно располагались внутри островков. В эти же сроки отмечена экспрессия а-ФП, однако этот белок присутствовал лишь в единичных клетках. HSA-позитивных клеток не было выявлено ни на одном из сроков эксперимента.
По всей вероятности, обнаруженные отличия между группами 3 и 4 объясняются тормозящими па-ракринными влияниями со стороны ММСК на звёздчатые клетки печени, что приводит к недостаточному функционированию последних в качестве фактора микроокружения, необходимого для гепатоцитарной дифференцировки ММСК, и процесс этой дифферен-цировки останавливается на стадии гепатобластов.
Контактная ко-культура ММСК+ЗКП (группа 5) Результаты флуоресцентной и фазово-контраст-ной микроскопии показали отсутствие слияния клеток двух ко-культивируемых культур (рис. 4 А—В).
Совместное культивирование ММСК и ЗКП позволило установить, что все клетки смешанной культуры в начале эксперимента экспрессировали виментин, но по ходу эксперимента экспрессия виментина снижалась. Большинство клеток первые две недели также активно экспрессировало десмин и а-ГМА, далее число позитивных клеток уменьшалось, и десмин-позитивные клетки были расположены вокруг десмин-негативных клеточных островков (рис. 4Г).
Как и в других вариантах культивирования, наиболее стабильной была экспрессия C-kit, на ранних сроках весьма интенсивная и далее постепенно снижающаяся к 3-4-й нед. В смешанной культуре также была отмечена экспрессия и других маркёров стволовых клеток: на 3-й неделе все клетки слабо экспрессировали C-met и Bcl-2, и далее экспрессия последнего, в отличие от C-kit и C-met, нарастала.
Первые эпителиальные маркеры появлялись к концу третьей недели — почти все клетки с разной интенсивностью экспрессировали ESA, СК18, СК19 (рис. 4Д). Экспрессия цитокератинов далее нарастала и была более яркой у СК18. В эти же сроки практически у всех клеток выявлена строгая экспрессия а-ФП (рис. 4Е), однако клеток, экспрессирующих HSA, выявить не удалось.
61 . ■у ■ р ■ х ¡ШИШ
Sfc
■л,- -Щ,.
, , -ч. • • «У?®5' "X'
■1 ¿»як^-Яв^в vi^v v^
Рис. 3. Культура ММСК в кодиционированной среде ЗКП (группа 3): А - изменение морфологии клеток, 2 сут. культивирования; Б - экспрессия C-kit, 14 сут.; В - экспрессия десмина, 14 сут.; Г - экспрессия а-ГМА, 14 сут.; Д - экспрессия ESA, 25 сут.; Е - экспрессия СК19,21 сут.; Ж - экспрессия а-ФП, 28 сут.; З - экспрессия HSA, 28 сут. Ув.: А-Д х10; Е-З х40
Рис. 4. Контактная ко-культура ЗКП+ММСК (группа 5): А - ММСК красного цвета; Б - ЗКП зелёного цвета;
В - наложение рис. А и Б; Г - экспрессия десмина, десмин-позитивные клетки располагаются вокруг десмин-негативных клеточных островков, 28 сут. культивирования; Д - экспрессия СК19,28 сут.; Е - экспрессия а-ФП, 28 сут. Ув.: А-Г х10; Д, Е х20
Результаты данной серии позволят сделать вывод, что непосредственные межклеточные контакты несомненно являются важным фактором для диффе-ренцировки обеих популяций клеток. Если сравнивать данный эксперимент с культивированием ММСК в среде ЗКП (группа 3), то в целом закономерности изменений фенотипа клеток похожи, однако обращает на себя внимание более яркий и массовый паттерн экспрессии гепатоцитарных маркёров. Вполне вероятно, что в данном случае в гепатобласты дифференцируются не только ММСК, но и сами ЗКП (возможность такой дифференцировки ЗКП в монокультуре была показана нами ранее [61]). Однако маркёр зрелых ге-патоцитов в клетках при этом не появлялся, что, возможно, связано с конкуренцией клеток в смешанной культуре. С другой стороны, в данном случае в среде присутствовали растворимые факторы, вырабатываемые не только ЗКП, но и ММСК, которые, так же, как и в группе 4, могли препятствовать завершающим этапам гепатоцитарной дифференцировки. Интересно, что экспрессия маркёров стволовых/прогенитор-ных клеток в этом эксперименте оказалась сходной с таковой для ММСК, культивированных в среде ЗКП (группа 3).
В 2008 г. была опубликована статья, в которой было показано, что ЗКП, активированные клетками Купфера, стимулируют ММСК костного мозга к дифференцировке в гепатоциты при контактном ко-культивировании [62]. Однако результаты нашего исследования показали, что не только активированные, но и покоящиеся ЗКП обладают такой способностью. Более того, такая дифференцировка осуществляется при культивировании ММСК не только совместно с ЗКП, но и просто в среде, переработанной этими клетками, что свидетельствует о важности именно паракринных влияний со стороны ЗКП на ММСК для реализации ими программы гепатоцитарной диффе-ренцировки.
Нельзя не отметить, что сама вероятность прямой дифференцировки ММСК в гепатобласты/гепатоци-ты до сих пор вызывает споры. В настоящее время опубликованы работы, как подтверждающие [19, 28, 36], так и отрицающие [63] такую возможность. Результаты нашей работы указывают на реализацию
ЛИТЕРАТУРА:
1. Hu D.J., Bower W.A., Ward J.W. Viral hepatitis. In: Morse S, Moreland AA, Holmes KK, eds. Atlas of sexually transmitted diseases and AIDS. London, England. Elsevier; 2010: 203-29.
2. Wilson J.W., Leduc E.H. Role of cholangioles in restoration of the liver of the mouse after dietary injury. J. Pathol. Bacteriol. 1958; 76: 441-49.
3. Dabeva M.D., Shafritz D.A. Activation, proliferation, and differentiation of progenitor cells into hepatocytes in the D-galactosamine model of liverregeneration. Am. J. Pathol. 1993; 143(6): 1606-20.
4. Урываева И.В. Модель репопуляции печени, поврежденной дипином. Бюлл. экспер. биол. мед. 1997; 124(10): 364-8.
5. Factor V.M., Radaeva S.A., Thorgeirsson S.S. Origin and fate of oval cells in dipin-induced hepatocarcinogenesis in the mouse. Am. J. Pathol. 1994; 145: 409-22.
6. Braun K.M., Sandgren E.P. Cellular Origin of Regenerating parenchyma in a Mouse Model of Severe Hepatic Injury Am. J. of Pathol. 2000; 157: 561-9.
7. Evarts R.P., Nakatsukasa H., Marsden E.R. et al. Cellular and molecular changes in the early stages of chemical hepatocarcinogenesis in the rat. Cancer Res. 1990; 50: 3439-44.
8. Sarraf C., Lalani E.-N., Golding M. et al. Cell behavior in the acetylaminofluorenetreated regenerating rat liver. Am. J. Pathol. 1994; 145: 1114-26.
9. Sigal S.H., Brill S., Fiorino A.S. et al. The liver as a stem cell and lineage system. Am. J. Physiol. 1992; 263: 139-48.
такой дифференцировки под влиянием как добавленных в среду факторов роста, так и под действием растворимых факторов, вырабатываемых ЗКП.
Также существуют опасения, что трансплантированные мезенхимальные и кроветворные стволовые клетки могут дифференцироваться в миофибробла-сты и таким образом способствовать фиброзирова-нию печени [64]. По нашим данным, исключить такую возможность нельзя, но число а-ГМА-позитивных миофиброластов в изученных культурах имеет тенденцию к снижению в процессе эксперимента, в связи с чем вряд ли целесообразно пренебрегать данными клеточными источниками получения гепа-тоцитов.
Еще один вопрос, не дающий покоя исследователям, — это механизм появления гепатоцитов из кроветворных стволовых клеток и ММСК. Происходит ли это в результате слияния клеток, или имеет место прямая дифференцировка? Многие склонны считать, что новые гепатоциты появляются в результате слияния ММСК и кроветворных стволовых клеток с полиплоидными эпителиальными клетками [65], однако нам удалось показать в монокультурах всех изученных клеток возможность прямой дифферен-цировки ММСК в гепатобласты/гепатоциты. Кроме того, факт слияния не был подтвержден и в смешанных культурах клеток при использовании флуоресцентного мечения.
Поводя итог, можно сказать, что результаты проведённого исследования подтверждают гипотезу о роли ЗКП как важнейшего фактора микроокружения, необходимого для поддержания жизнеспособности ММСК и обеспечивающего реализацию их потенций к дифференцировке по гепатоцитарному пути в условиях in vitro, что диктует необходимость продолжения исследований в данном направлении с целью разработки методик получения из ММСК максимального числа функционально активных гепатоцитов и применения полученных клеток в терапии заболеваний печени.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 09-04-97013-р_поволжье_а) и Министерства образования и науки РФ (грант МК-7805.2010.7).
10. Petersen B.E., Bowen W.C., Patrene K.D. et al. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells. Science 1999; 284: 1168—70.
11. Theise N.D., Badve S., Saxena R. et al. Derivation of hepatocytes from bone marrow cells in mice after radiation-induced myeloablation. Hepatology 2000; 31: 235-40.
12. Lagasse E., Connors H., Al-Dhalimy M. et al. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. Nat. Med. 2000; 6(11): 1229-34.
13. Schwartz R.E., Reyes M., Koodie L. et al. Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells. J. Clin. Invest. 2002; 109: 1291-302.
14. Fiegel H.C., Lioznov M.V., Cortes-Dericks L. et al. Liver-specific gene expression in cultured human hematopoietic stem cells. Stem Cells 2003; 1: 98-104.
15. Zhang F.T., Fang J.Z., Yu J. et al. Conversion of mononuclear cells from human umbilical cord blood into hepatocyte-like cells. Junyi Daxue Xuebao. 2006; 21: 358-64.
16. Sato Y., Araki H., Kato J. et al. Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are differentiated into human hepatocytes without fusion. Blood 2005; 106: 756-63.
17. Taléns-Visconti R., Bonora A., Jover R. et al. Hepatogenic differentiation of human mesenchymal stem cells from adipose tissue in comparison with bone marrow mesenchymal stem cells. World J. Gastroenterol. 2006; 12(36): 5834-45.
18. Lange C., Bruns H., Kluth D. et al. Hepatocytic differentiation of mesenchymal stem cells in cocultures with fetal liver cells. World J. Gastroenterol. 2006; 12(15): 2394-7.
19. Sgodda M., Aurich H., Kleist S. et al. Hepatocyte differentiation of mesenchymal stem cells from rat peritoneal adipose tissue in vitro and in vivo. Exp. Cell Res. 2007; 313(13): 2875-86.
20. Jung J., Zheng M., Goldfarb M. et al. Initiation of mammalian liver development from endoderm by fibroblast growth factors. Scienc 1999; 284: 1998-2003.
21. Duncan S.A. Transcriptional regulation of liver development. Dev. Dyn. 2000; 219: 131-42.
22. Wells J.M., Melton D.A. Early mouse endoderm is patterned by soluble factors from adjacent germ layers. Development 2000; 127(8): 1563-72.
23. Schwartz R.E., Reyes M., Koodie L. et al. Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells. J. Clin. Invest. 2002; 109: 1291-302.
24. McLin V.A., Zorn. A.M. Molecular Control of Liver Development. Clin. Liver Dis. 2006; 10: 1-25.
25. Zaret K.S. Regulatory phases of early liver development: paradigms of organogenesis. Nat. Rev. Genet. 2002; 3: 499-512.
26. Jiang Y., Jahagirdar B.N., Reinhardt R.L. et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 2002; 418: 41-9.
27. Lee K.D., Kuo T.K., Whang-Peng J. et al. In vitro hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells. Hepatology 2004; 40: 1275-84.
28. Kang X.Q., Zang W.J., Bao L.J. et al. Fibroblast growth factor-4 and hepatocyte growth factor induce differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into hepatocytes. World J. Gastroenterol. 2005; 11(47): 7461-5.
29. Grompe M. Adult liver stem cells. Essentials of stem cell biology. Elsevier 2009; 34: 285-98.
30. Lee K.-D., Kuo T.K.-C., Whang-Peng J. et al. In vitro hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells. Hepatology 2004; 40(6): 1275-84.
31. Wang P.P., Wang J.H., Yan Z.P. et al. Expression of hepatocyte-like phenotypes in bone marrow stromal cells after HGF induction. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004; 320(3): 712-6.
32. Oh S.H., Miyazaki M., Kouchi H. et al. Hepatocyte growth factor induces differentiation of adult rat bone marrow cells into a hepatocyte lineage in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000; 279: 500-4.
33. Suzuki A., Iwama A., Miyashita H. et al. Role for growth factors and extracellular matrix in controlling differentiation of prospectively isolated hepatic stem cells. Development 2003; 130: 2513-24.
34. Xie J.M., Chen J.F., Gao Y. et al.Hepatocyte growth factor and fibroblast growth factor-4-induced differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells in vitro. Nan. Fang. Yi. Ke. Da. Xue. Xue. Bao. 2006; 26(10): 1439-42.
35. Banas A., Teratani T., Yamamoto Y. et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes. Hepatology 2007; 46: 219-28.
36. Snykers S., Vanhaecke T., Papeleu P. et al. Sequential exposure to cytokines reflecting embryogenesis: The key for in vitro differentiation of adult bone marrow stem cells into functional hepatocyte-like cells. Toxicol. Sci. 2006; 94: 235-9.
37. Zhang J., Niu C., Ye L. et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature 2003; 425: 836-41.
38. Vassy J., Rigaut J.P., Briane D. et al.Confocal microscopy immunofluorescence localization of desmin and other intermediate filament proteins in fetal rat livers. Hepatology 1993; 17: 293-300.
39. Kiassov A.P., van Eyken P., van Pelt J.F. et al. Desmin expressing nonhematopoietic liver cells during rat liver development: an immunohistochemical and morphometric study. Differentiation 1995; 59: 253-8.
40. Киясов А.П., Гумерова А.А., Билалов М.М. Экспрессия ци-токератинов в пре- и постнатальном онтогенезе печени крыс. Онтогенез 1997; 28(5): 389-93.
41. Гумерова А.А., Киясов А.П., Калигин М.С. и др. Участие клеток Ито в гистогенезе и регенерации печени. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2007; 4: 39-46.
42. Kim T.H., Mars W.M., Stolz D.B. et al. Extracellular matrix remodeling at the early stages of liver regeneration in the rat. Hepatology 1997; 26(4): 896-904.
43. Friedman S.L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol. Rev. 2008; 88: 125-72.
44. Schirmacher P., Geerts A., Piertrangelo A. et al. Hepatocyte growth factor/hepatopoietin A is expressed in fat-storing cells from rat liver but not myofibroblastlike cells derived from fat-storing cells. Hepatology 1992; 15: 5-11.
45. Maher J.J. Cell-specific expression of hepatocyte growth factor in liver - upregulation in sinusoidal endothelial cells after carbon tetrachloride. J. Clin. Invest. 1993; 91: 2244-52.
46. Meyer D.H., Bachem M.G., Gressner A.M. Modulation of hepatic lipocyte proteoglycan synthesis and proliferation of Kupffer cell-derived transforming growth factor type beta 1 and type alpha. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990; 171: 1122-9.
47. Bachem M.G., Meyer D., Melchior R. et al. Activation of rat liver perisinusoidal lipocytes by transforming growth factors derived from myofibroblastlike cells. A potential mechanism of self perpetuation in liver fibrogenesis. J. Clin. Invest.1992; 89: 19-27.
48. Mullhaupt B., Feren A., Fodor E., Jones A. Liver expression of epidermal growth factor RNA. Rapid increases in immediate-early phase of liver regeneration. J. Biol. Chem.1994; 269: 19667-70.
49. Yoshino R., Miura K., Segawa D. et al. Epimorphin expression and stellate cell status in mouse liver injury. Hepatol. Res. 2006; 34: 238-49.
50. Asahina K., Kawada N., Kristensen D.B. et al. Characterization of human stellate cell activation-associated protein and its expression in human liver. Biochim. Biophys. Acta. 2002; 1577: 471-5.
51. Maxwell P.H., Fergusson D.J.P., Osmond M.K. et al. Expression of homologously recombined erythropoietin SV 40T antigen fusion gene in mouse liver: evidence for erythropoetin production by Ito cells. Blood 1994; 84: 1823-30.
52. Eckardt K.U. Erythropoietin production in liver and kidneys. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 1996; 5(1): 28-34.
53. Passino M.A., Adams R.A., Sikorski S.L. et al. Regulation of hepatic stellate cell differentiation by the neurotrophin receptor p75NTR. Science 2007; 315: 1853-6.
54. Wright D.E., Bowman E.P., Wagers A.J. et al. Hematopoietic stem cells are uniquely selective in their migratory response to chemokines. J. Exp. Med. 2002; 195: 1145-54.
55. Kubota H., Yao H., Reid L.M. Identification and characterization of vitamin-A storing cells in fetal liver: implication of functional importance of hepatic stellate cells in development and hematopoiesis. Stem Cells 2007; 25: 2339-49.
56. Lints T.J., Hartley L., Parsons L.M. et al. Mesoderm-specific expression of the divergent homeobox gene Hlx during murine embryogenesis. Dev. Dyn. 1996; 205: 457-70.
57. Tocci A., Parolini I., Gabbianelli M. et al. Dual action of retinoic acid on human embryonic/fetal hematopoiesis: blockade of primitive progenitor proliferation and shift from multipotent/erythroid/ monocytic to granulocytic differentiation program. Blood 1996; 88(8): 2878-88.
58. Evarts R.P., Hu Z., Omori N. et al. Effect of vitamin A deficiency on the integrity of hepatocytes after partial hepatectomy. Am. J. Pathol. 1995; 147(3): 699-706.
59. Knook D.L., Seffelaar A.M., de Leeuw A.M. Fat-storing cells of the rat liver. Exp. Cell Res. 1982; 132: 468-71.
60. MacSween R.N.M., Scothorne R.F. Developmental anatomy and normal structure. In: MacSween R.N.M., Anthony P.P., Scheuer P.J., Burt A.B., Portmann B.C. editors. Pathology of the liver. 3rd ed. Edinburgh: Churchill Livingstone. 1994: 1-49.
61. Киясов А.П., Гумерова А.А., Титова М.А. Мезенхимально-эпителиальная трансформация клеток Ито in vitro. Клеточные технологии в биологии и медицине 2006; 3: 150-3.
62. Deng X., Chen Y.-X., Zhang X. et al. Hepatic stellate cells modulate the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells. J.Cellular Physiol. 2008; 217: 138-44.
63. Popp F.C., Slowik P., Eggenhofer E. et al. No contribution of multipotent mesenchymal stromal cells to liver regeneration in a rat model of prolonged hepatic injury. Stem Cells 2007; 25: 639-45.
64. Kisseleva T., Brenner D.A. Hepatic stellate cells and the reversal of fibrosis. J. Gastroenterol. Hepatol. 21 Suppl. 2006; 3: 84-7.
65. Terada N., Hamazaki T., Oka M. et al. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion. Nature 2002; 416: 542-5.
Поступила 06.09.2011
