CC BY
55
С.С. Целуйко, Н.П., Красавина, М.М. Горбунов Стволовые клетки трахеи крыс при длительных холодовых воздействиях
ГОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия», Благовещенск, Россия [email protected]
S.S. Tseluyko, N.P. Krasavina, М.М. Gorbunov
Stems cells of the trachea of rats at the long cold
influences
Цель исследования. В доступной нам литературе отсутствуют данные о состоянии стволовых клеток и «нишах», окружающих их в слизистой оболочке трахеи крыс, при холодовом воздействии, на фоне выраженного окислительного стресса, что и определило цель нашего исследования.
Материал и методы исследования. Работа выполнена на беспородных белых крысах. Возраст молодых половозрелых крыс, включенных в исследование, составил 3^4 мес., вес — в пределах 150,0^180,0 г.
Обосновывая выбранный нами температурный режим (-15°С) и экспозицию холодового воздействия (3 ч ежедневно с 8.00 до 11.00) мы исходили из того, что сильный холод вызывает изменения, соответствующие по морфологическим критериям острому и хроническому холодовому стрессу. Общее охлаждение осуществлялось в климатической камере (тип 3101, «Пка», Германия) по 3 ч ежедневно, в течение 10 и 30 сут. Трахеи крыс подвергались морфологическому исследованию на уровне световых и полутонких срезов. Материал экспериментальных исследований исследовали для трансмиссионной микроскопии (электронный микроскоп Tecnai G2 Spirit TWIN, Голландия) по методу Coalson, Winteret et ai. (1986). Для выявления камбиальных клеток воздухоносного отдела легких, претерпевающих эпидермоидную дифференцировку, мы применили антитела на «Cadherin-Е» RB-9214-R, фирмы «Lab Vision» и набор реактивов фирмы «Хема» для иммуногистохимического окрашивания срезов тканей. Для ультрагистохимического выявление щелочной фосфатазы использовали модифицированный метод Гомори.
Результаты. Холодовой стресс изменяет процентное соотношение клеток однослойного многорядного реснитчатого эпителия в различных отделах трахеи при охлаждении организма в различные сроки. В краниальном отделе количество стволовых клеток при охлаждении изменяется незначительно, хотя имеет тенденцию к снижению. Число промежуточных клеток резко уменьшается при длительных сроках охлаждения. При анализе процентного состава элементов эпителия был отмечен более низкий уровень дифференцировки в каудальном отделе трахеи. Здесь число базальных и промежуточных клеток сохраняется на значительно более высоком уровне, чем в краниальном. Важно отметить, что дифференцировка эпителия краниального отдела трахеи в эксперименте направлена в сторону увеличения процента бокаловидных клеток, тогда как в каудальном отделе отмечается некоторый рост реснитчатых клеток.
По мере увеличения срока действия холодового фактора в составе эпителия трахеи появляются очаги метаплазии. Вначале подобные изменения выявляются в каудальном отделе, а в дальнейшем и в краниальном, что можно расценить как нарушение дифференцировки стволовых клеток в результате действия холода
в период регенераторной пролиферации. Эпителиальные клетки слизистой оболочки трахеи имеют двойной потенциал, который заключается в том, что они могут претерпевать эпидермальную дифференциацию и все же сохраняют способность вырабатывать муко-идные вещества. Эпидермальная дифференциация является типичной реакцией трахеобронхиального эпителия на холодовое воздействие. Для выявления стволовых клеток воздухоносного отдела легких, претерпевающих эпидермоидную дифференцировку, мы исследовали Е-кадгерин. Выраженная потеря экспрессии Е-кадгерина или ее снижение наблюдается при холодовом воздействии, что связано с низким уровнем дифференцировки камбиальных клеток трахеи. Полученные нами результаты исследований роли Е-кадгери-на при эпидермальной дифференциации на фоне охлаждения определяют дальнейшее изучение комплекса Е-кадгерин/катенин, как возможного биомаркера стволовых клеток при холодовых воздействиях. Электронно-микроскопическое выявление типичного маркера плюрипотентных незрелых клеток — щелочной фосфатазы — при холодовых воздействиях показало изменение ее распределения. Количество гранул конечного продукта на щелочную фосфатазу уменьшается в клеточных мембранах стволовых клеток и в утолщенной базальной мембране. Характерно нарастание активности щелочной фосфатазы в тучных клетках, часть из которых мигрирует в эпителий трахеи. Этот механизм является универсальным и обеспечивает регуляцию регенерации функционально отживших эпителиальных клеток. Остается неясным, что же влияет на повышение миграционной активности тучных клеток в условиях холодового воздействия.
Выводы. Длительное холодовое воздействие на слизистую оболочку трахеи снижает скорость дифференцировки клеточных элементов и изменяет взаимосвязи с клеточным окружением стволовых клеток (нишей). При использовании клеточных маркеров стволовых клеток (Е-кадгерина и щелочной фосфатазы) показано, что важным клеточным элементом «ниши», влияющим на дифференцировку стволовых клеток, являются тучные клетки, мигрирующие при ХОЛОДОВЫХ воздействиях в эпителий.
Повышение миграции тучных клеток при холодовом воздействии в данном случае связано с передачей информационного воздействия на стволовые клетки через жидкую среду, которая уменьшает количество малодифференцированных клеток в эпителии.
В.А. Шаблий 1, Г.С. Лобынцева а, М.Д. Кучма а,
Д.В. Лобынцев а
Получение мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из криоконсервированной ткани плаценты
1 Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, Украина
2 ООО «Институт клеточной терапии», Киев, Украина
У A, Shabliy, G.S. Lobyntseva, M.D. Kuchma, D.V. Lobyntsev Isolation of mesenchymal stem cells from a placenta cryoconserved tissue
Для криоконсервирования ворсинчатой ткани плаценты применяли два вида криопротекторов: 1,5 и 0,7 М ДМСО; 1,5 ДМСО + 0,1 М сахароза и 1,5 М про-пандиол. Тканевый материал замораживали в криоампулах (4,5 мл) по ступенчатой программе, в каждом варианте корректируя точку сидинга.
Целью исследования было подобрать криопротектор и режим, при котором после размораживания сохраняется морфологическая структура ткани и жизнеспособность клеток. Показателем жизнеспособности служила пролиферация МСК при культивировании, а ткань исследовали на гистологических срезах.
Плаценту размораживали в водяной бане + 40°С до 0°С, постепенно добавляли раствор Хэнкса, снижая концентрацию криопротектора в 3 раза, переносили в 0,1% раствор коллагеназы и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Клетки выделяли на фи-колле (1,077 г/л), отмывали в PBS, и сажали 1 х108/см2 в среду ДМЕМ + 10% FBS на культуральный пластик, смену среды проводили каждые 3 сут.
При гистологическом исследовании особых нарушений структуры размороженной ткани не обнаружено, только при использовании пропандиола отмечена повышенная дегидратация ядер. В дальнейшем для криоконсервирования применяли программу с 0,7 М ДМСО.
При культивировании на 5—8 сут. появлялись колонии фибробластоподобных клеток, которые на протяжении 10—15 сут. образовывали монослой. При достижении 80% конфлюэнтного состояния клетки снимали раствором 0,25% трипсина с ЗДТА и проводили фе-нотипирование. Клетки имели фенотип МСК: CD105 + , CD90+, CD73 + , CD34-, CD45-, CD14-. Культуру вели в течение 6 пассажей и замораживали.
Таким образом, метод криоконсервирования под защитой 0,7 М ДМСО позволяет сохранить ворсинчатую ткань плаценты и выделить из нее МСК. Возможность использования их в клинической практике требует более детального изучения.
А.К. Шафигуллина, А.А. Трондин, А.Р. Шайхутдинова, М.С. Калигин, И.М. Газизов, А.А. Гумерова,
А.П. Киясов
Влияние растворимых факторов, вырабатываемых перисинусоидальными клетками печени, на мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга крысы
ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», Казань, Россия [email protected]
А.К. Shafigullina, А.А. Trondin, A.R. Shaihutdinova,
M.S. Kaligin, I.M. Gazizov, A.A. Gumerova, A.P. Kiyasov Study of the influence of Hepatic Perisinusoidal Cells paracrine secretion on culture of Bone Marrow-derived mesenchymal stem cells
Перисинусоидальные клетки печени (ПКП) — популяция клеток, обладающая различными свойствами — накапливать витамин А, трансформироваться под воздействием неблагоприятных факторов в миофиброб-ласты и продуцировать коллаген, являясь при этом источником соединительной ткани при фиброгенезе печени. В то же время, было высказано предположение, что ПКП, благодаря секреции факторов роста и прямых межклеточных контактов, создают микроокружение, необходимое для дифференцировки прогени-торных клеток в гепатоциты.
Цель исследования: изучить влияние растворимых факторов, вырабатываемых перисинусоидальными клетками печени на мезенхимальные стволовые клетки костного мозга крысы в условиях in vitro.
Материал и методы: перисинусоидальные клетки печени были выделены методом коллагеназно-про-назной перфузии печени крысы с последующим разделением клеток в градиенте плотности гистоденза. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) костного мозга крысы были выделены путем селективной адгезии к пластику. Далее было проведено культивирование ММСК клеток на среде ПКП. В качестве контроля ММСК культивировали в питательной среде ДМЕМ Ш!дта, США) с 10% содержанием бычьей сыворотки и 100 Ед/мл пенициллина — 100 мкг/мл стрептомицина. Морфологические признаки клеток оценивали методами фазово-контрастной и флуоресцентной микроскопии. Фенотипические признаки выделенных клеток изучали методами им-муноцитохимического анализа и ПЦР в реальном времени.
Результаты. Из первичной культуры ММСК и ПКП была выделена мРНК для последующего анализа экспрессии генов СК19 и У-САМ. Согласно данным РТ-ПЦР экспрессия мРНК СК19 отсутствовала в культуре ММСК и была отмечена в культуре ПКП. По данным ПЦР в реальном времени экспрессия мРНК У-САМ в культуре ПКП была в 100 раз выше, чем культуре ММСК.
На 2-е сут. культивирования ММСК в среде ПКП было отмечено изменение их морфологии — уменьшение размеров клеток и укорочение их отростков, в то время как в контроле они были вытянутой веретенообразной формы. На 5-е сут. культивирования ММСК в среде клеток ПКП было отмечено повышение пролиферативной активности ММСК по сравнению с контролем. Изменений со стороны экспрессии маркеров мезенхимальных клеток (виментин, десмин, —-ГМА) и С-кШ не было.
На 21 -е сутки культивирования ММСК в среде ПКП было отмечено появление экспрессии эпителиальных маркеров СК18, СК19. На 28-е сут. экспрессия СК18 и СК19 была и в контрольной группе клеток, что свидетельствует о спонтанной эпителиальной диффе-ренцировке клеток. В опытной культуре клеток на 28-е сут. было выявлено наличие экспрессии ЕБА, Вс1-2 и С-теЬ и экспрессия маркеров гепатобластов/ гепатоцитов НБА и —-ГР, что свидетельствует о возможности гепатоцитарной дифференцировки ММСК. В контрольной группе экспрессии данных маркеров не было.
Выводы. В ходе экспериментов по изучению пара-кринных влияний со стороны ПКП на ММСК были выявлены повышение уровня их пролиферации, изменения морфологии и фенотипа ММСК. Появление экспрессии эпителиальных маркеров ЕБА, СК18 и СК19
—
ет о способности ММСК к гепатоцитарной дифферен-цировке при паракринной регуляции со стороны ПКП. Полученные данные подтверждают гипотезу о роли ПКП в создании микроокружения для прогениторных клеток и их влиянии на дифференцировку данных клеток в гепатоциты.
