CC BY
103
February 09, 2011, from http://www. Gebetic-programming.org/
2. Goldberg, D.E. (1989). Genetic Algorithms in Search, Optimization and Machine Learning. Addison- Wesley Longman Publishing.
3. Graphic Design. (n.d.) Retrieved February 07, 2011, from Wikipedia: http:// en. Wikipedia. Org/ wiki/ Graphic design
4. Koppel, M. &Nickolay, B. (1998, May). Design of image exploring agent using genetic programming. Berlin, Germany.
5. Koza, J.R. (1998). Genetic Programming on the Programming Computers by Means of
Natural Selection. Cambridge, Massachusetts, London, England: MIT Press.
6. Lewis, M. Evolutionary Visual Art and Design. In M. Lewis. USA: ACCAD.
7. Muni, D.P., Pal< N.R., & Das, J. (2006). Texture Generation for Fashion Design Using Genetic Programming. ICARCV. IEEE.
8. Visualization _ Computer Graphics. (n.d.) Retrieved February 05, 2011, from Wikipedia: http:// en/Wikipedia.org/wiki/Visuali-zation _ (computer _ graphics)
9. Winston, P.H., &Horn, B.K. (1981). LISP. Addison - Westley.
УДК 630:576.8:632
ВЛИЯНИЕ б-ЭНДОТОКСИНОВ BACILLUS THURINGIENSIS НА ИЗМЕНЕНИЕ АНТИИНТЕРФЕРОНОВОЙ АКТИВНОСТИ РЯДА УСЛОВНО ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ
Климентова Елена Георгиевна, кандидат биологических наук, доцент ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, 42; Тел. 8(8422)272464, kloushel@mаil.ru Васильев Дмитрий Аркадьевич, доктор биологических наук, профессор Феоктистова Наталья Александровна, кандидат биологических наук, доцент ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина»
432017г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; Тел. 8(422)559547, [email protected]
Ключевые слова: 5 - эндотоксины В. thuringiensis, штаммы Е. соИ, St aиreus, антиин-терфероновая активность, факторы персистенции бактерий.
Установлена высокая антиинтерфероновая активность штаммов Е. соНи St. аиге^, выделенных из толстого кишечника белых мышей в условиях экспериментального дисбактериоза, обусловленного длительным пероральным введением высоких доз 5 - эндотоксинов В. thuringiensis.
Бактерии Bacillus thuringiensis - грам-положительные аэробные спорообразующие бактерии, характерным признаком которых является способность продуцировать комплекс кристаллических белков (5-эндотоксинов). В. thuringiensis имеет близкое молекулярно-генетического родство с такими патогенами, как В. cereus, вызывающих пищевое отравление, и В. anthracts, возбудителя сибирской язвы [8]. Известно, что большинство подвидов В. thuringiensis обладают энтеротоксинами, вызывающими
отравление с диарейным синдромом, гемолизинами и другими факторами вирулентности [9]. Белковые токсины бактерий способны оказывать влияние на микроорганизмы: вызывать появление новых патогенных и условно-патогенных штаммов, изменять биологические свойства отдельных представителей микробиоты, обусловливать дисбиотические нарушения [^.Установлено, что высокие дозы 5-эндотоксинов В. thuringiensis subsp. kurstaki (от50 мг/кг веса), длительно вводимые per os лабораторным
мышам, приводят к формированию дисбио-тических изменений в кишечнике животных [6]. В условиях формирующегося дисбактериоза возможно изменение персистирую-щих свойств условно патогенных бактерий, в частности, антиинтерфероновой активности (АИА), что способствует более длительному пребыванию данных представителей в биотопе. Изучение биологической активности белков параспоральных кристаллов В. thuringiensis в отношении микроорга-низмов-симбионтов желудочно-кишечного тракта теплокровных животных и человека весьма актуально, так как споро-кристаллический комплекс и отдельные параспораль-ные белки этой энтомопатогенной бактерии являются основой значительного количества биоинсектицидов, выпускаемых в настоящее время и, кроме того, сгу-гены введены в целый ряд растений для их защиты от вредных насекомых (генно-модифицированные б£-растения).
Цель и задачи исследования. Цель исследования - изучение влияния 5 - эндотоксинов В. thuringiensis на изменение антиинтерфероновой активности штаммов Е. соИ и St. aиreus, выделенных из толстого кишечника животных в условиях экспериментального дисбактериоза. Задачей явилось изучить изменение антиинтерфероновой активности штаммов Е. соИ и St. аиreus в зависимости от времени и способности штаммов проявлять гемолитическую активность и утилизировать лактозу.
Материалы и методы исследования. В работе был использован штамм Z-52 В. ЬЬиппд^впз'я subsp. ки&ак1, продуцирующий кристаллы 5 - эндотоксинов класса Сгу1А и Сгу2, полученный из ФГУП ГосНИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов. Выделяли параспоральные кристаллы 5-эндотоксинов по известной методике с помощью п-ксилола [7], после этого белки осаждали ледяной уксусной кислотой, отделяли от супернатанта центрифугированием и перерастворяли в 0,02М фосфатном буфере при рН 7,8 [10], немедленно готовили разведения растворов в этом буфере, которые и применяли для перорального введения лабораторным животным (60-ти белым
беспородным мышам-самкам возраста 45 суток) в дозе 100 мг/кг веса в течение 28 суток. Животные контрольной группы (10 особей) получали перорально аналогичный объем буферного раствора. На 14 и 28 сутки проведения эксперимента мышей подвергали усыплению эфиром, вскрывали и проводили отбор фекальных масс из содержимого прямого отдела толстой кишки для исследования просветной микробиоты. Антиинтерфероновую активность (АИА) выделенных штаммов культур E.coli и St. aureus исследовали по методу О.В. Бухарина и В.Ю. Соколова (1989) [4] с учетом антибактериального действия препарата человеческого лейкоцитарного интерферона. При этом АИА исследуемого штамма считали высокой при инактивации человеческого лейкоцитарного интерферона в концентрации более 2 ед., средней - от 1,1 - 2ед, низкой - от 0 до 1 ед.Все исследования проводились в 10
- кратной повторности.
Результаты исследования. Антиин-терфероновая активность относится к средствам дистанционного действия, способствующего персистенции, изменение которой наблюдается при дисбактериозе. По мнению ряда авторов, существует прямая зависимость между вирулентностью энтеробактерий и их АИА. Антиинтерфероновый фактор обладает способностью к подавлению катионных белков фагоцитов и цитоток-сическим эффектом [3].
АИА была оценена у 49 штаммов E. coli, выделенных от контрольных условно здоровых животных, у 52 штаммов E. coli и 26 штаммов St. aureus, выделенных от 10 животных на 14 сутки применения 5-эндотоксина и у 80 штаммов E. coli и 50 штаммов St. aureus, выделенных от 14 мышей с признаками дисбактериоза на 28 сутки. Установлено, что на 14, а особенно на 28 сутки эксперимента высевалось больше гемолитических и лактозонегативных штаммов бактерий (табл.1).
Из 59 штаммов E. coli, выделенных от контрольной группы животных, 32 штамма (65,2±5,5%) оказались неактивны, 4 штамма (8,1±1,5%) проявили низкую АИА, 8 (15,2±2,3%) - среднюю степень АИА и 5
Таблица 1
Количество штаммов, выделенных из содержимого просветного отдела прямой кишки мышей
Группы животных Штаммы E. coli Штаммы St. aureus
Всего В т.ч.Н1у+/1ас- Всего В т.ч. Hly+
Контроль 59 2/0 0
14 сутки 63 16/2 26 3
28 сутки 80 23/5 50 11
(11,5±2,0%) - высокую степень. На 14 сутки проведения эксперимента было установлено, что неактивными оказались 37 штаммов (59,5±8,1%), количество штаммов с низкой АИА также уменьшилось до 4 (6,0±1,3%). Количество штаммов со средней степенью инактивировать интерферон незначительно увеличилось - до 10 (16,5±5,2%), а штаммов с высокой АИА - до 12 (18,5±3,5%), или почти в 1,5 раза. Из 80 штаммов E. coli, выделенных от животных на 28 сутки, неактивными оказалось уже меньше половины - 39 штаммов (49,8±6,5%), что в 1,3 раза меньше, чем в контроле; количество штаммов с низкой АИА также уменьшилось, но незначительно, до 6 (7,2±1,5%), а количество штаммов со средней способностью инактивировать интерферон увеличилось до 17 (20,5±3,2%) или в 1,3 раза, а штаммов с высокой АИА -до 21 (22,5±4,0%), или почти в 2 раза.
Изучение АИА штаммов St. a^eus показало, что из 26 штаммов, выделенных из контрольной группы животных, 4 штамма (15,2±2,5%) оказались неактивны, 12 (48,1±4,4%) проявили низкую АИА, 7 (25,2±4,3%) - среднюю степень АИА и 3 (11,5±2,6%) - высокую степень. По мере увеличения продолжительности действия 5-эндотоксинов B. thuringiensis на 28 сутки число штаммов со средней степенью инактивировать интерферон практически не изменилось и осталось на уровне 12 (24,5±4.4%), а штаммов с высокой АИА увеличилось до 14 (28,3±5,0%), или почти в 2,5 раза по сравнению с контролем. Неактивным оказался каждый десятый штамм, что в 1,5 раза меньше, чем в контроле, количество штаммов с низкой АИА уменьшилось до 19 (37,2±6,5%).
Развитие дисбактериоза в кишечнике теплокровных животных, связанного с влия-
нием ксенобиотиков (в том числе антибиотиков и токсинов), тесно связано с изменением комплекса факторов патогенности условно патогенных видов, снижением популяционного уровня форм E. coli с нормальной ферментативной активностью, созданием условий для избыточной колонизации лактозонегативными и обладающими гемолитической активностью штаммами, размножение которых в нормальных условиях подавлено конкуренцией со стороны активных симбионтов. Условно патогенные микроорганизмы при этом могут переходить из разряда безвредных в агрессивную форму [2].
Персистентные характеристики ассо-циантов в микробиоценозе при дисбактериозе также не остаются инертными, что и было показано в данном исследовании. Как правило, подавление факторов персистен-ции патогенов происходит под действием анаэробной индигенной микрофлоры. Но, как выявилось в предыдущих исследованиях [6], количество анаэробных микроорганизмов Bifidobacterium spp. и Lactobacillus spp. в микробиоценозе толстой кишки мышей при дисбактериозе, обусловленном длительным пероральным введением высоких доз растворов 5-эндотоксинов B. thuringiensis, уменьшилось и индигенная микрофлора, по всей видимости, не стала полностью справляться с данной функцией.
Известно, что повышение персистентного потенциала условно патогенной микрофлоры может происходить под действием ассоциантов-симбионтов при формировании патобиоценозов. Например, метаболиты грибов Candida кишечной микрофлоры, в большем количестве высеваемые при дисбактериозе, усиливают антилизо-цимную и антикомплементарную активность гемолитической и лактозонегативной кишечной палочки, клебсиэлл и золотистых стафилококков [5]. Также возможно изменение персистентных характеристик бактерий под воздействием лекарственных средств или других биологических препаратов, например, токсинов бактерий, что показано в
нашем случае.
Таким образом, рост числа штаммов с высокой АИА бактерий, выделенных из кишечника животных с экспериментальным дисбактериозом, вызванным введением 5-эндотоксинов В. thuringiensis, сопряжен с резким увеличением числа колониеобразующих единиц (КОЕ) культур St. aиreus - с единичных колоний, высеваемых от интакт-ных животных в контроле до 1,5^ КОЕ на 28 сутки эксперимента. Достаточно стабильно вела себя в сложных микробиоценотических условиях, обусловленных применением токсина, культура Е.соП. Число КОЕ эшери-хий в кишечнике не увеличивалось по сравнению с контролем, но обнаруживаемое усиление персистентных свойств сочеталось со значительным ростом числа гемолитических штаммов в пуле высеваемых бактерий. Можно предположить, что при увеличении числа штаммов условно патогенных бактерий с высокими персистирующими свойствами, участвующих в биоценозе, формируется их сложное взаимодействие, в ходе которого обеспечиваются облегченные условия для их жизнедеятельности и проникновения в организм теплокровных животных с последующей колонизацией органов и тканей, что приводит к развитию различных патологических состояний.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 12-04-97016-р_поволжье_а.
Библиографический список
1. Барановский А.Ю. Дисбактериоз и дисбиоз кишечника / А.Ю. Барановский, Э.А. Кондрашин. - Санкт-Петербург: Питер, 2000.
- С. 20.
2. Бухарин О.В. Инфекция - модельная система ассоциативного симбиоза / О.В. Бухарин// Журн. микробиол. - 2009. - № 1. - С. 83-86.
3. Бухарин О.В. Персистентный потенциал условно-патогенных микроорганизмов / О.В. Бухарин, А.В. Валышев, С.В. Черкасов //Эпидем. Вакцинопроф. - 2005. - № 4 (23).
- С. 43 - 48.
4. Бухарин О.В. А.с. № 1564191. СССР. Способ определения антиинтерфероновой активности микроорганизмов / О.В. Бухарин, В.Ю. Соколов. - 1989.
5. Валышев А.В. Механизмы формирования бактериально-грибковых ассоциаций в кишечнике человека / А.В. Валышев, Н.Б. Перунова, О.В. Бухарин // Пробл. мед. экол.
- 2004. - № 6 (2). - С. 65.
6. Климентова Е.Г. Изменение микрофлоры толстого кишечника у мышей при длительном пероральном введении 5-эндотоксина Bacillus thuringiensis / Е.Г. Климентова, А.А. Купцова, Л.К. Каменек, В.В. Гулий. // Сельскохозяйственная биология. - 2011. - № 4. - С. 115-120.
7. Юдина Т. Г. Антимикробная активность и экологическая роль белковых включений бактерий - представителей родов Bacillus, Xenorhabdus, Photorhabdus // Дисс. докт. биол. наук. - Москва, 2006. - С. 87.
8. Drobniewski F. The safety of Bacillus species as insect vector control agents / F. Drobniewski, A. Review A. // J. Appl. Bacteriol.
- 1994. - V.76. - P.101-109.
9. Damgaard P. Enterotoxin-producing strains of Bacillus thuringiensis isolated from food / Р. Damgaard, Н. Larsen, В. Hansen, J. Bresciani, K. Jоrgensen // Letters in Applied Microbiology. - 2008. - V.23. -P.133-145.
10. Chestukhina G.G. Crystal-forming proteins of Bacillus thuringiensis. Limited proteolysis by endogenous proteinases as a cause of their apparent multiplicity / G.G. Chestukhina, I.A. Zalunin, L.I. Kostina, T.S. Kotova, S.P. Katrukha, V.M. Stepanov // Biochem. J. - 1980. - V. 187. - P.457-465.
