CC BY
25
УДК 630:576.8:632
Ключевые слова: дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis, микробиота кишечника, гемолитические E. coli, дисбактериоз
Key words: delta-endotoxin of Bacillus thuringiensis, intestinal microbiota, hemolytic E. coli, bacteria overgrowth
Климентова Е. Г.
АНТАГОНИСТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ГЕМОЛИТИЧЕСКИХ ESCHERICHIA COLI, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ТОЛСТОЙ КИШКИ МЫШЕЙ С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ДИСБАКТЕРИОЗОМ, ОБУСЛОВЛЕННЫМ ДЕЙСТВИЕМ 6-ЭНДОТОКСИНОВ BACILLUS THURINGIENSIS
antagonistic activity of hemolytic Escherichia coli, isolated from the colon of mice with experimental dysbiosis caused by the action of s-endotoxins of bacillus thuringiensis
ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет». Адрес: 432000, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, 42
ulyanovsk state university. Address: 432000, Russia, ulyanovsk, L. Tolstoy street, 42
Климентова Елена Георгиевна, к. б. н., доцент
Klimentova Elena G., Ph.D., Associate Professor
Аннотация. В статье приведены результаты изучения антагонистической активности гемолитических Escherichia coli, выделенных из толстой кишки мышей с экспериментальным дисбактериозом, обусловленным длительным применением высоких доз 5-эндотоксинов Bacillus thuringiensis, по отношению к ряду симбиотических бактерий и ее связь с наличием ферментативной активности, в частности со способностью ферментировать лактозу.
Summary. This article presents the results of the study on the antagonistic activity of hemolytic Escherichia coli against a number of symbiotic bacteria and its relation to the presence of enzymatic activity and in particular the ability to ferment lactose. Abovementioned Escherichia coli were isolated from the colon of mice with experimental dysbiosis caused by prolonged use of high doses of S-endotoxins of Bacillus thuringiensis.
Введение
В настоящее время известно о более чем 200 антибиотиках, бактерицинах, эндо- и экзотоксинах, образуемых энтомопатоген-ной спорообразующей бактерией Bacillus thuringiensis. Споро-кристаллический комплекс и отдельные параспоральные белки (Cry- и Cyt-белки, 5-эндотоксины) данной бактерии являются основой наиболее эффективных и широко применяемых биопестицидов для борьбы с вредными насекомыми; кроме того, сгу-гены введены в целый ряд растений для их защиты от вредных насекомых (генно-модифицированные Bt-растения - растения со встроенным геном, кодирующим синтез токсинообразования). Показано, что Cry- и Cyt-белки параспо-ральных кристаллов обладают выраженной биологической активностью по отношению к прокариотам различных систематических групп [7, 8, 9].
Большие количества активных белков и их фрагментов, содержащихся в биопести-
цидах или в трансгенных В^растениях, попадая в организмы различных животных при питании, могут существенно повлиять на симбиотические биоценозы кишечника, изменяя биологические свойства отдельных представителей микробиоты, усиливая или, напротив, селективно подавляя их рост [6], способствуя образованию гетерогенности популяции по различным биологическим признакам.
Ранее было установлено, что высокие дозы 5-эндотоксинов В. thuringiensis (100 мг / кг веса и более), вводимых белым мышам перорально, приводят к микроэкологическим нарушениям в кишечнике животных, приводящим к развитию дисбакте-риоза. Образующиеся популяции бактерий содержали штаммы с измененными биологическими свойствами (гемолитические), способные к продуцированию дополнительных факторов патогенности [4].
В соответствии с рассмотренными выше обстоятельствами, актуальным является ис-
следование, позволяющее установить характер изменения межбактериальных взаимодействий в биотопе толстой кишки белых мышей с признаками дисбактериоза, обусловленного пероральным введением высоких доз 5-эндотоксинов B. thuringiensis subsp. kurstaki, на основе изучения антагонистической активности гемолитических штаммов E. coli в отношении других симбионтов микробиоценоза.
Объекты и методы исследований
В работе использовали 39 штаммов гемолитических E. coli, выделенных из биотопа толстого кишечника белых мышей на 14 и 28 сутки после начала перорального введения раствора 5-эндотоксинов B. thuringiensis subsp. kurstaki в дозе 100 мг/кг веса.
Антагонистическую активность E. coli Hly+ определяли методом отсроченного антагонизма [3]. Для контроля вместо индикаторного штамма высевалась изучаемая культура E. coli Hly+. В качестве индикаторных штаммов использовались культуры лакто-бактерий (84 штамма), условно-патогенных энтеробактерий - Klebsiella spp. (17 штаммов), Proteus spp. (21 штамм), Citrobacter spp. (19 штаммов), типичные E. coli (57 штаммов), а также стафилококки: St. aureus., не обладающие гемолитической активностью (46 штаммов), и St. epidermidis (19 штаммов), выделенные от мышей с экспериментальным дисбактериозом. Титры штаммов E. coli Hly+ - продуцентов факторов ингибирования и культур индикаторных штаммов - 106-7 клеток/мл. Через 24-48 часов культивирования при оптимальной для испытуемых культур температуре и условиях культивирования (микроаэрофильных для лактобактерий) учитывали расстояние зоны задержки роста индикаторных штаммов. Такие условия культивирования создавали раздельные оптимальные условия как для роста штамма - продуцента факторов антагонизма, так и для роста индикаторной культуры.
Микроорганизмы выделялись из содержимого толстой кишки животных с использованием классических бактериологических методик. Анализ выделенных микроорга-
низмов проводили согласно определителю Берджи [5] по морфологическим, биохимическим и культуральным признакам. Биохимическую идентификацию культур проводили с использованием тест-систем "Enterotest" и "Stafitest" фирмы "Lachema" (Чехия). Наличие E. coli Hly+ учитывали на кровяном агаре из разведения 10-5.
Все материалы были подвергнуты статистической обработке с использованием методов статистического и вариационного анализа. Различия между величинами считались достоверными при р < 0,05.
Результаты исследований
E. coli, выделенные от мышей с экспериментальным дисбактериозом, обусловленном длительным пероральным введением высоких доз ô-эндотоксинов B. thuringiensis subsp. kurstaki, вырастали на поверхности МПА в течение суток в виде полупрозрачных колоний с гладкой поверхностью и ровными краями размером примерно 3-4 мм. На среде Эндо они давали рост в виде красновато-малиновых колоний с металлическим блеском, при этом лактозонегативные штаммы росли в виде бледно-матовых колоний. Биохимические свойства выделенных штаммов E. coli соответствовали следующим показателям: малонат и цитрат натрия -отрицательный; цитрат натрия с глюкозой -расщепление с образованием кислоты и газа; лизиндекарбоксилаза и орнитиндекарбокси-лаза - положительный; аргининдегидролаза и фенилаланиндезаминаза - отрицательный; индол - положительный; ацетилметил-карбинол, уреаза, образование сероводорода - отрицательный; глюкозу, лактозу, ß-галактозидазу, манит, сахарозу, инозит, сорбит, арабинозу, мальтозу расщепляли с образованием кислоты и газа. Из всех выделенных штаммов 7 не расщепляли лактозу (лактозонегативные штаммы, lac-) и 11 штаммов были со слабо выраженной ферментативной активностью.
Из данных, представленных в таблице 1, следует, что все исследованные индикаторные штаммы оказались в той или иной степени чувствительны к антагонистическому действию гемолитических эшерихий.
Таблица 1.
Чувствительность индикаторных штаммов бактерий к антагонистическому действию E. coli Hly+ с нормальной ферментативной активностью (21 штамм)
№ п/п Индикаторные штаммы Число штаммов микроорганизмов в опыте, ед. Чувствительных штаммов Чувствительность в мм подавления роста
Ед. %
1 Lactobacillus spp. 84 53,3±4,1 63,5±4,9 19,1±1,8
2 E. coli тип. 57 23,2±1,3 40,7±2,2 10,2±0,9
3 Proteus spp. 21 11,0±0,9 52,3±4,5 6,2±1,9
4 Citrobacter spp. 19 11,1±0,5 58,8±2,7 5,3±1,5
5 Klebsiella spp. 17 9,3±0,9 54,7±5,1 7,1±0,8
6 St. aureus 46 28,0±4,3 61,2±3,4 4,8±1,2
7 St. epidermidis 19 12,0±1,4 67,2±5,2 7,9±1,1
Примечание. Степень чувствительности индикаторных штаммов: до 2 мм - очень низкая; от 2 до 5 мм - низкая; 5-10 мм - средняя; более 10 мм - высокая.
Высокую чувствительность к антагонистическому действию к гемолитическим эшери-хиям проявили 40,7±2,2 % штаммов типичных E. coli, величина подавления роста культуры составила 10,2±0,9 мм, и 63,5±4,9 % штаммов Lactobacillus spp., зона ингибирования их роста оказалась наибольшей и составила в среднем 19,1±1,8 мм. Из исследованных 19 штаммов St. еpidermi-dis 12,0±1,4, или 67,2±5,2 %, проявили среднюю чувствительность к E. coli Hly+, величина подавления роста составила в среднем 7,9±1,1мм. Такая же степень чувствительности оказалась у 52,3±4,5 % исследованных штаммов Proteus spp., 58,8±2,7 % штаммов Citrobacter spp. и у 54,7±5,1 % штаммов Klebsiella spp. Размер зон подавления роста варьировал от 5,3±1,5 до 7,1±0,8 мм. Наименее чувствительными к ингибирующему действию E. coli Hly+ оказались 61,2±3,4 % штаммов золотистого стафилококка с зоной подавления роста в среднем 4,8±1,2 мм.
Среди представителей кишечной нормоф-лоры Lactobacillus spp. оказались наиболее чувствительными к действию гемолитических эшерихий по зоне подавления роста (19,1±1,8мм). Размер зон лизиса в среднем почти в 2 раза превышал таковую у нормальных E. шН (10,2±0,9мм) и почти в 4 раза у St. аигеш (4,8±1,2мм). Чувствительность в мм подавления роста условно-патогенных энтеробактерий (Proteus spp., Citrobacter spp. и Klebsiella spp.) была примерно на одном уровне - от 5,3±1,5 до 7,1±0,8 мм.
Изучение влияния лактозного признака на антагонистическую активность штамма -продуцента факторов патогенности показало (табл. 2), что по отношению к культуре Klebsiella spp. проявилась наибольшая активность, рост клебсиэлл подавляли 100 % штаммов E. coli с пониженной ферментативной активностью и 72,5±8,7 % лактозонега-тивных штаммов. Немного менее активны были эшерихии с измененными биологическими свойствами по отношению к лактоба-циллам, рост этой культуры рост подавляли 66,8±4,8 % штаммов E. coli с пониженной ферментативной активностью и 72,5±8,7 % лактозонегативных штаммов. Стафилококковая микробиота - культуры St. epidermidis и St. аureus были чувствительны к антагонистическому действию примерно 62,5-67,0 % штаммов E. coli Hly+ с пониженной ферментативной активностью и 40,6-49,0 % лактозонегативных штаммов. Рост условно-патогенных энтеробактерий Citrobacter spp. подавлялся 59,2±6,0 % штаммов с пониженной ферментативной активностью и 33,8±2,9 % лактозонегативных штаммов. Самая низкая чувствительность к факторам антагонизма гемолитических эшерихий отмечалась у Proteus spp., lac-штаммы оказались активны только в 7,7±2,6 % случаев, штаммы с пониженной ферментативной активностью - только в 18,2±3,6 %. Рост клеток E. coli тип. подавлялся 51,2±3,6 % штаммов гемолитических эшерихий с пониженной
Таблица 2.
Чувствительность индикаторных штаммов бактерий к E. coli Hly+, различных по способности ферментировать лактозу
№ п/п Индикаторные штаммы Чувствительные штаммы E. coli Hly+
1-я группа с пониженной ферментативной активностью (11 штаммов) Чувствительность в мм подавления роста 2-я группа lac-(7 штаммов) Чувствительность в мм подавления роста
Кол-во (n) в % Кол-во (n) в %
1 Lactobacillus spp. 7,3±0,5 66,8±4,8 17,1±2,0 5,9±0,5 85,0±7,9 16,4±2,1
2 E. coli тип. 5,6±0,4 51,2±3,6 12,8±1,7 1,6±0,4 23,4±5,4 14,2±1,9
3 Proteus spp. 2,2±0,4 18,2±3,6 6,0±1,4 0,5±0,2 7,7±2,6 6,4±1,5
4 Citrobacter spp. 6,5±0,7 59,2±6,0 6,2±1,0 2,4±0,2 33,8±2,9 5,8±1,2
5 Klebsiella spp. 11, 0 100,0 7,5±0,6 5,1±0,6 72,5±8,7 7,8±0,5
6 St. epidermidis 6,9±0,5 62,5±4,3 7,0±1,2 2,9±0,3 40,6±4,3 7,1±1,0
7 St. aureus 7,4±0,6 67,0±5,5 5,2±1,4 3,4±0,2 49,0±3,2 5,0±1,1
ферментативной активностью и 23,4±5,4 % лактозонегативных штаммов.
По величине размеров зон подавления роста наиболее чувствительными оказались культуры Lactobacillus spp. и E. coli тип. (16,4-14,2 мм) и наименее - золотистый стафилококк (5,0 мм). Остальные индикаторные культуры микроорганизмов проявили среднюю устойчивость, размеры зон лизиса варьировали от 5,8 до 7,8 мм.
Обсуждение результатов
Совокупность всех микробиоценозов теплокровных животных и человека представляет собой единую экологическую систему, находящуюся в состоянии биологического равновесия. Вследствие изменения условий существования под действием, например, бактериальных токсинов, микроорганизмы могут переходить из разряда безвредных в агрессивную форму, при этом меняются и симбиоти-ческие отношения между микроорганизмами, входящими в один и тот же биотоп. Это характерно в основном для условно-патогенной микробиоты. При развитии дисбактериоза происходит снижение популяционного уровня форм E. coli с нормальной ферментативной активностью и создаются условия для избыточной колонизации кишечника лактозонега-тивными и обладающими гемолитической активностью штаммами, размножение которых в нормальных условиях подавлено конкуренцией со стороны активных симбионтов [1].
В данном исследовании было установлено, что гемолитические штаммы E. соН с нормальной ферментативной активностью обладали антагонистическим действием по отношению к бактериям - симбионтам микробиоценоза толстой кишки со способностью ингибировать рост лактобацилл, близкородственных энтеробактерий, в том числе типичную кишечную палочку, и неродственных патогенных и условно-патогенных микроорганизмов - стафилококков, протей и клебсиэлл.
По мере убывания чувствительности к ин-гибирующему действию E. coli Hly+ с нормальной ферментативной активностью по размеру зоны подавления роста культуры-симбионты микроценоза кишечника расположились следующим образом: Lactobacillus spp. > E. coli тип. > St. epidermidis > Klebsiella spp. > Proteus spp. > Citrobacter spp. > St. aureus.
Таким образом, гемолитические штаммы эшерихий с нормальной ферментативной активностью активнее всего подавляли рост представителей нормобиоты кишечника, а условно-патогенные и патогенные культуры оказались более устойчивы к подобному действию, и самым устойчивым микроорганизмом оказался золотистый стафилококк.
Известно, что популяция бактерий рода E. coli весьма гетерогенна и изменение биохимических свойств данного микроорганизма, в частности способности ферментиро-
вать лактозу, как правило, влечет за собой и изменение способности к продуцированию факторов патогенности [2].
По степени чувствительности культур к ингибирующему действию гемолитических штаммов E. coli Hly+ с пониженной ферментативной активностью по размеру зоны подавления роста микроорганизмы расположились следующим образом: Lactobacillus spp. > E. coli тип. > Klebsiella spp. > St. epidermidis > Citrobacter spp. > Proteus spp. > St. aureus; а по степени чувствительности культур к ингибирующему действию гемолитических лактозонегатив-ных штаммов E. coli: Lactobacillus spp. > E. coli тип. > Klebsiella spp. > St. epidermidis > Proteus spp. > Citrobacter spp. > St. aureus.
Заключение
Таким образом, гемолитические штаммы эшерихий с измененной ферментативной активностью также активнее всего подавляли рост представителей нормобиоты кишечника - неродственной культуры Lactobacillus spp. и близкородственных микроорганизмов -типичных E. шН. Среди представителей нор-мофлоры Lactobacillus spp. оказались наиболее чувствительными к действию лакто-зонегативных гемолитических эшерихий и по процентному содержанию (более 85 %), и по зоне подавления роста. Условно-патогенные и патогенные энтеробактерии оказались более устойчивы к подобному действию. Средняя бактерицидная активность обнаружена к микроорганизмам, которые не являются нормофлорой кишечника -клебсиэллам, эпидермальному стафилококку, протеям и цитробактериям. Самой устойчивой культурой по отношению к трем группам E. coli Hly+ оказался золотистый стафилококк. Следовательно, наблюдаются значительные различия в чувствительности разных систематических групп микроорганизмов к антагонистическому действию гемолитических штаммов эшерихий, и, как следствие, происходит формирование пер-систенции патогенной и условно-патогенной микрофлоры в толстом кишечнике за счет устойчивости к бактериоцинам и вытеснение из него представителей нормофлоры.
Следовательно, под действием высоких доз 5-эндотоксинов B. thuringiensis происходит формирование дисбиотических изменений в толстом кишечнике животных, изменение биохимических свойств E. coli, в частности способности ферментировать лактозу, что влечет за собой и изменение способности к продуцированию факторов патогенности данного микроорганизма.
Результаты, полученные в ходе данной работы, могут быть использованы при контроле регламента производства и оценке биологической активности промышленно выпускаемых биопестицидов, разработке норм и доз их безопасного применения, так как внедрение интенсивных технологий возделывания сельскохозяйственных культур неизбежно повлечет расширение применения микробиологических средств защиты растений, что приводит обычно к широкомасштабному загрязнению окружающей среды спорами, токсинами и другими биологически активными компонентами микроорганизмов. Кроме того, существуют риски возможного негативного влияния токсичных трансгенных белков Bt-растений, объемы выращивания которых во всем мире постоянно увеличиваются.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 12-04-97016-р_поволжье_а.
Список литературы
1. Барановский, А. Ю. Дисбактериоз и дисбиоз кишечника / А. Ю. Барановский, Э. А. Кондрашин. -СПб. : Питер, 2000. - 209 с.
2. Билалов, Ф. С. Некоторые факторы патогенности E. coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениями / Ф. С. Билалов, З. Г. Габидуллин, М. М. Туйгунов, Ю. З. Габидуллин, Э. Ф. Мамбетова, А. А. Ахтариева, В. Г. Туйгунова // Известия Челябинского научного центра. - Вып. 2 (32), 2006. - C. 123-126.
3. Блинкова, Л. П. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства, методы выявления / Л. П. Блинкова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2003. - № 3. - С. 109-113.
4. Климентова, Е. Г. Изменение микрофлоры толстого кишечника у мышей при длительном перораль-ном введении 5-эндотоксина Bacillus thuringiensis / Е. Г. Климентова, А. А. Купцова, Л. К. Каменек, В. В. Гулий // Сельскохозяйственная биология. -2011. - № 4. - С. 115-120.
5. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Пер. с англ. ; под ред. Хоулта Дж., Крига Н., Снита П., Стей-ли Дж., Уилльямса С. - Мир, 1997. - 800 с.
6. Парфенов, А. И. Антибиотико-ассоциированная диарея / А. И. Парфенов, И. Н. Ручкина, Г. А. Осипов // Экспер. и клин. гастроэнтерол. - 2002. - № 5. -С. 92-95.
7. Юдина, Т. Г. Антимикробная активность белковых включений различных бактерий / Т. Г. Юдина, Н. С. Егоров // Доклады РАН. - 1996. - Т. 349. -№ 2. - С. 283-287.
8. Юдина, Т. Г. Действие эндотоксинов четырех подвидов Bacillus thuringiensis на различных прокариот / Т. Г. Юдина, Л. И. Бурцева // Микробиология. -1997. - Т. 66. - № 1. - С. 25-31.
9. Cahan, R. Antibacterial activity of Cyt1Aa from Bacillus thuringiensis subsp. Israelensis / R. Cahan, H. Friman, Y. Nitzan // Microbiology. - 2008. - 154. -Р. 3529-3536.
В издательстве Института Ветеринарной Биологии вышла в свет книга проф. Кудряшова А.А.
«ПАТОЛОГОАНАТОМИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА БОЛЕЗНЕЙ ЛОШАДЕЙ»
Данная книга является второй в серии «Ветеринарная патологическая анатомия», выпускаемой НОУ ДО «Институт Ветеринарной Биологии». Как и первая книга «Патологоанатомическая диагностика болезней собак и кошек» (www.invetbio.spb.ru/Kudryashov-2011.htm), настоящее издание является учебным пособием как для студентов ветеринарных факультетов, так и для врачей-иппологов.
В книге изложены порядок вскрытия лошадей, составления протоколов, правила отбора материала для дальнейших исследований, даны детальные описания 40 наиболее часто встречающихся заболеваний лошадей. Подробно освещены этиология, патогенез, клинические проявления и патологоанатоми-ческие изменения. Особое внимание уделено дифференциальной диагностике. Книга иллюстрирована большим количеством авторских фотографий, а также рисунками со схемами.
Тираж: 1000 экз. Формат: А5 (145 х 205 мм), мягкий переплет, 184 с. с илл.
Стоимость книги при заказе наложенным платежом составляет 1040 рублей.
По вопросу приобретения обращайтесь по тел. +7 921 095-89-27, e-mail: [email protected]
Форма on-line заказа: www.invetbio.spb.ru/form_kniga_Kudryashov-loshadi.htm
-U-U-U-U-Ü- Q-U-U-U—U-U—Ü-U-Ü- Q-U-U-U-U-U- Q-U-Ü-Ü-U-U-U-
ПРЕДИСЛОВИЕ
ВСКРЫТИЕ ТРУПОВ ЛОШАДЕЙ
1. Место вскрытия и инструментарий
2. Техника безопасности
3. Некоторые анатомические особенности лошади
4. Определение возраста лошади
5. Масть лошади
6. Порядок вскрытия
7. Техника исследования отдельных органов
8. Протоколирование вскрытия (протокол вскрытия)
9. Отбор и сохранение патологического материала, предназначенного для лабораторных исследований
ПАТОЛОГОАНАТОМИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА БОЛЕЗНЕЙ ЛОШАДЕЙ
ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ
1. Сибирская язва
2. Злокачественный отек
3. Некробактериоз
4. Столбняк
5. Ботулизм
6. Сальмонеллез
7. Листериоз
8. Лептоспироз
9. Моноцитарный эрлихиоз
10. Эпизоотический лимфангит
11. Язвенный лимфангит
12. Мыт
13. Кровопятнистая болезнь
ОГЛАВЛЕНИЕ
14. Сап
15. Туберкулез
16. Бруцеллез
17. Инфекционная анемия
18. Герпесвирусные болезни
19. Грипп лошадей
20. Аденовирусная инфекция
21. Вирусные энцефалиты и энцефаломиелиты
22. Африканская чума однокопытных
23. Вирусный артериит
24. Бешенство
25. Болезнь Ауески
26. Оспа лошадей
27. Везикулярный стоматит
28. Коринебактериоз жеребят
29. Микотоксикозы
30. Идиопатический колит
ИНВАЗИОННЫЕ БОЛЕЗНИ
1. Бабезиоз
2. Трипаносомозы
3. Параскариоз
4. Деляфондиоз
5. Гастрофилез
НЕЗАРАЗНЫЕ БОЛЕЗНИ
1. Паралитическая миоглобинурия
2. Острое расширение желудка
3. Метеоризм кишечника
4. Перекручивание и заворот кишок
5. Амилоидоз печени
ИЛЛЮСТРАЦИИ
