CC BY
48
EFFECT OF THE NITRIC OXIDE DONOR ON THE THERAPEUTIC EFFECIENCY OF CYTOSTATICS AND DNA SYNTHESIS
N.P. Konovalova, L.M. Volkova, O.I. Yakushchenko, L. Yu. Dederer*, L.B. Gorbacheva*
Institute of Chemical Physics Problems RAS, Chernogolovka N.M. Emanuel Institute of Biochemical Physics RAS, Moscow*
ABSTRACT
Effect of the nitric oxide donor on cytostatic activity of some drugs (cyclophosphamide, cisplatin, doxorubicin) and their combination was studied. It was shown that the nitric oxide donor 3,3-bis(nitroxymethyl)oxetane induced the essential increase of antileukemic activity of the drugs and combination of cyclophosphamide with cisplatin. The nitric oxide donor also significantly improves therapeutic index of cyclophosphamide. Suppression of DNA synthesis by cyclophosphamide in P388 leukemia cells after administration to tumor-bearing mice of the nitric oxide donor significantly increased. The nitric oxide donor obviously protects bone marrow cells from damaging actions of cyclophosphamide. We propose that nitric oxide donor may be used in chemotherapy for increasing of efficiency anticancer treatment.
ВЛИЯНИЕ ДОНОРА ОКСИДА АЗОТА НА ТЕРАПЕВТИЧЕСКУЮ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЦИТОСТАТИКОВ И СИНТЕЗ ДНК
Н.П. Коновалова, Л.М. Волкова, О.И. Якущенко, Л.Ю. Дедерер*, Л.Б. Горбачева*
Институт проблем химической физики РАН, Черноголовка Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва*
РЕЗЮМЕ
Было изучено влияние донора оксида азота (N0) нацитостатическую активность некоторых препаратов (цик-лофосфан, цисплатин, доксорубицин)иихкомбинацииприлечениимышейслейкозомР388. Показано, что донор оксида азота 3,3-бис(нитроксиметил)оксетан вызывает существенное увеличение антилейкозной активности этих препаратов и комбинации циклофосфана с цисплатином. Донор N0 также заметно улучшает терапевтический индекс циклофосфана и значительно усиливает ингибирующее действие циклофосфана на синтез ДНК в опухолевых клетках, одновременно защищая клетки костного мозга от повреждающего действия циклофосфана.
Введение. Оксид азота (NO) обладает широким спектром биологической активности, регулирует многочисленные физиологические процессы в норме и патологии. В настоящее время существуют весьма противоречивые представления о роли NO в канцерогенезе и химиотерапии опухолевых заболеваний [2; 3; 4]. Известно, что оксид азота, взаимодействуя с кислородом или супероксидом, может вызывать разрывы нитей ДНК, дезаминировать основания, а также ингибировать репарацию ДНК. Установленное в последние годы участие оксида азота в различных биологических процессах инициировало активные исследования возможности его использования в фармакологических целях и, в частности, при онкологических заболеваниях [2; 3; 4].
Целью настоящей работы явилось изучение возможности использования NO-донора в качестве адъювантного средства для повышения эффективности цитостати-ческой терапии. Кроме того, было изучено влияние донора NO, циклофосфана, а также их комбинации на синтез ДНК в клетках лейкоза Р388 и костного мозга in vivo.
Материалы и методы. Препараты. В работе использовали циклофосфан (ЦФ), цисплатин, доксорубицин (ДХ). Цитостатики применяли как в терапевтических, так и в субтерапевтических дозах. В качестве донора оксида азота был использован 3,3-бис(нитроксиметил-)оксетан (НМО), синтезированный в Институте проблем химической физики РАН. Все препараты вводили внутрибрюшинно.
Экспериментальные опухоли. Все опыты проводили на мышах с лимфолейкозом Р388 (внутрибрю-шинная и внутримозговая трансплантация). Прививку опухолей проводили по стандартной методике мышам - гибридам ВБР, [5].
Оценка эффекта. Увеличение средней продолжительности жизни животных (1ЦЗ%), число излеченных животных (проживших 60 суток) и химиотерапевтический индекс были использованы в качестве критериев эффективности терапии.
Синтез ДНК. Для изучения влияния препарата НМО (10 мг/кг) на синтез ДНК в клетках лейкоза Р388 и ак-
Таблица 1
Повышение эффективности цисплатина в терапевтической дозе при его комбинации с НМО (лейкоз Р-388)
Препарат Разовая доза, мг/кг Режим введения, сутки Количество животных в опыте Выжившие животные, % 1ЬБ,%
Цисплатин 4 1,5,9 6 67 297
НМО 1 1,5,9 6 0 0
НМО 1 1-9 6 0 0
НМО 10 1,5,9 6 0 5
Цисплатин 4 1,5,9
+ + 6 83 312
НМО 1 1,5,9
Цисплатин 4 1,5,9
+ + 6 100 -
НМО 1 1-9
Цисплатин 4 1,5,9
+ + 6 100
НМО 10 1,5,9
Контроль 6 0
тивно пролифирирующих клетках костного мозга мы-шей-опухоленосителей на 5-е сут. после прививки лей-козных клеток мышам однократно вводили водный раствор НМО, цилофосфан или их комбинацию. Животных забивали через 24; 48; 72 и 144 ч после введения препаратов. За час до забоя всем животным вводили радиоактивный предшественник ДНК 2-14С-тими-дин по 2 мКи на мышь. У мышей-опухоленосителей извлекали костный мозг и опухолевые клетки. Лейкоз-ные клетки отбирали в охлажденный раствор 0,83-%-ного 1ЧН4С1 для лизиса эритроцитов, центрифугировали (170§ 10мин) и промывали тем же раствором. Костный мозг вымывали из бедренных костей дистиллятом и гомогенизировали в шприце. Клетки гомогенизировали в дистилляте в соотношении 1: 5, макромолекулы осаждали равным объемом 0,5Ы НСЮ4 после 30-минутной инкубации при 0°С центрифугировали (170£ Юмин), осадок дважды промывали 0,25Ы НС104 для удаления невключившейся метки, инкубировали в 1,6 N НСЮ4 при 70°С 15 мин для гидролиза ДНК и гидролизат использовали для определения радиоактивности (сцинтиллятор: 700 мл толуола, 300 мл метанола, 3 г РРО, 0,5 г РОРОР) и количества ДНК по Бартону.
Результаты и обсуждение. В табл. 1 представлены результаты совместного введения мышам с лейкозом Р388 цисплатина в терапевтической дозе 4 мг/кг, трехкратно и NО-донора (препарат НМО) в дозах 1 или 10 мг/кг. Отмечается потенциирующий эффект НМО: процент выживших животных возрастает с 67 (один цисплатин) до 100 (при совместном введении).
Терапевтический эффект комбинации доксоруби-цин + циклофосфан также усиливался добавлением >ТО-донора: 100% животных с лейкозом Р388 жили более 60 дней (рис. 1).
При внутримозговой трансплантации препарат НМО также повышал чувствительность лейкоза Р388 к циклофосфану. Средняя продолжительность жизни животных увеличивалась приблизительно в 3 раза по сравнению с результатами лечения одним цик-лофосфаном (рис. 2).
Полученные результаты свидетельствуют об улучшении терапевтической эффективности некоторых ци-тостатиков под влиянием 1ЧО-донора.
Существует несколько объяснений этого эффекта. Прежде всего, известно, что оксид азота является эффектором апоптоза [7; 8]. В частности, в клетках лейкоза человека НЬ-60 оксид азота индуцирует апоптоз. Авторы связывают эти наблюдения с активацией каспаз [10]. Известен также антиапоптотический эффект N0. Как правило, апоптоз инициируется оксидом азота, выделяемым экзогенными донорами [9], в то время как антиапоптотический эффект связан с эндогенной продукцией N0.
Кроме того, оксид азота является эффектором клеточного иммунитета, что способствует увеличе-
ю
Рис. 1. Влияние НМО на эффективность комбинированной терапии лейкоза Р388:
1: циклофосфан, 30 мг/кг;
2: доксорубицин, 0,5мг/кг;
3: НМО, 9,5 мг/г;
4: циклофосфан, 30тя/к£ + доксорубицин, 0,5мг/кг;
5: циклофосфан, ЗОт^к^ + доксорубицин, 0,5 мг/кг + НМО, 9,5мг/кг.
Циклофосфан и доксорубицин вводили на 1-е и 6-е сут.; НМО-с 1-хпо 6-е.
1 2 3 4 5
Рис. 2. Повышение чувствительности лейкоза Р388 (внут-римозговая трансплантация) к циклофосфану при его комбинации с НМО:
1: циклофосфан, 60,0 мг/кг, 1,6 сут.
2: НМО, 1,0 мг/кг, 1 - 6 сут.
3: НМО, 10,0 мг/кг, 1 - 6 сут.
4: циклофосфан, 60,0 мг/кг + НМО, 1,0 мг/кг, в тех же режимах; циклофосфан, 60,0 мг/кг + НМО, 10,0 мг/кг, в тех же режимах
Время,ч
Рис. 3. Влияние циклофосфана и его комбинации с НМО на синтез ДНК в клетках лейкоза Р388
серые столбцы - циклофосфан 8,0 мг/кг
белые столбцы - циклофосфан, 8,0 мг/кг + НМО, 10,0 мг/кг
нию терапевтической эффективности комбинации цитостатика с ]ЧО-донором [1].
Показано, что КО-доноры повышают проницаемость гемато-энцефалического барьера [6]. Результаты, полученные в настоящей работе с использованием внутримозговой трансплантации лейкоза Р388 (рис. 2), по-видимому, подтверждают это наблюдение.
Известно, что оксид азота, взаимодействуя с кислородом или супероксидом, может вызывать повреждения ДНК (разрывы нитей, дезаминирование оснований). Было изучено влияние НМО, циклофосфана и их комбинации на синтез ДНК. Циклофосфан вызывает практически полное подавление синтеза ДНК даже в
0,5 терапевтической дозы (30 мг/кг): через 72 ч после введения включение меченого предшественника в ДНК составляет 8% от контроля. Поэтому для изучения действия на синтез ДНК комбинации препаратов была выбрана низкая доза циклофосфана - 8 мг/кг.
НМО существенно усиливает ингибирующее действие циклофосфана на синтез ДНК в клетках лейкоза Р388 по крайней мере в течение 144 ч при одновременном введении (рис. 3). Введение одного НМО в дозе 10 мг/кг вызывает лишь кратковременное ингибирование синтеза ДНК.
Кроме того, было изучено влияние циклофосфана, НМО и их комбинации на синтез ДНК в активно пролиферирующих клетках костного мозга.
В костном мозге циклофосфан вызывает сначала ингибирование (50% через 24 ч после введения), затем активацию (200% через 48 ч) синтеза ДНК (рис. 4, кривая 1). НМО (10 мг/кг) вызывает торможение синтеза ДНК на 50% через сутки после введения, но к третьим суткам синтез ДНК восстанавливается до контрольных значений (рис. 4, кривая 2). Комбинация циклофосфа-
на с НМО (рис. 4, кривая 3) в наименьшей степени подавляет синтез и вызывает более значительную и длительную стимуляцию синтеза ДНК (400%).
Это позволяет предположить, что НМО защищает костный мозг, способствуя более быстрому восстановлению поврежденных циклофосфаном клеток. Таким образом, НМО при комбинации с циклофос-
Время, ч
Рис. 4. Влияние циклофосфана и его комбинации с НМО на синтез ДНК в клетках костного мозга мышей-опухоле-носителей:
1 - циклофосфан, 30,0 мг/кг;
2 -НМО, 10,0 мг/кг;
3 - циклофосфан, 30,0 мг/кг + НМО, 10,0 мг/кг.
Таблица 2
Увеличение терапевтического индекса при двулекарственной комбинации цитостатика и ГЧО-донора
Опухоль Препарат Т ерапевтический индекс
Лейкоз Р388 Циклофосфан 1,8*
Циклофосфан+НМО 12,0*
чь 3U
ed50
Учитывая полученные факты, можно с уверенностью говорить о способности 1ЧО-доноров повышать эффективность используемых в клинике химиотерапевтических агентов.
Важно учитывать однако, что N0 оказывает влияние на многочисленные факторы, которые, как положительно, так и отрицательно сказываются на развитии опухолей. В этих случаях очень важно исследовать зависимость терапевтической активности от дозы донора оксида азота, так же как и от стадии развития опухолевого процесса.
Работа поддержана грантом МНТЦ (проект N1550).
фаном существенно усиливает его ингибирующее действие на синтез ДНК в опухолевых клетках, одновременно защищая клетки костного мозга от повреждающего действия циклофосфана.
Полученные в настоящей работе экспериментальные результаты указывают на перспективность использования препаратов-доноров N0 как дополнительных лекарственных средств в химиотерапии опухолей. Как видно из приведенных данных, активность всех использованных в работе цитостатиков повышалась при их комбинации с НМО, причем эффективность препаратов в низких, субтерапевтических дозах в сочетании с НМО, как правило, была сопоставима с эффективностью, полученной при использовании высоких доз или превышала её.
Известно, что современные противоопухолевые препараты характеризуются чрезвычайно узким терапевтическим индексом, что указывает на низкую избирательность их действия. При комбинации цитостатика и 140-донора широта терапевтического действия значительно увеличивалась (табл. 2). Так, химиотерапевтический индекс циклофосфана повышался в 6,5 раз при совместном введении с НМО.
На основании этих данных оксвд азота можно рассматривать как модулятор, способствующий увеличению терапевтического индекса цитостатиков.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ванин А.Ф. Оксид азота в биологии: история, состояние и перспективы исследований. II Биохимия. - 1998. - 63, № 7. - С. 867 - 869.
2. Ванин А. Ф. Оксид азота в биомедицинских исследованиях. // Вестник Российской Академии Наук. - М.: Медицина, 2000. -№ 4. - С. 3 - 5.
3. ВинкД.А., Водовоз Й., КукДА.исоавт. Значение химических
свойств оксида азота для лечения онкологических заболеваний. // Биохимия. - 1998. - 63, № 7. - С. 948 - 957.
4. Проскуряков С.Я., Коноплянников А.Г., Иванников А.И. и соавт. Оксид азота и терапия злокачественных новообразований. // Российский онкологический журнал. - 2000. -№ 3. - С. 41-45.
5. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США. Под ред. З.П. Софьиной, А.Б. Сыркина, А. Голдина, А. Кляйна. - М.: Медицина, 1980.
6. Boje К.М., Lakhman S.S. Nitric oxide redox species exert differential permeability effect on the blood-brain barrier. IIJ. Pharmac. Exper. Ther. - 2000. - 293, № 2. - P. 545 - 550.
7. BruneB., vonKnethenA., SandauKB. Nitric oxide (NO): an effector
of apoptosis. // Cell Death Differ., 1999,6,№ 10, P. 969-975.
8. KimP.K., ZamoraR, PetroskoP., Billar T.R. The regulatory role
of nitric oxide in apoptosis. // J. Imunopharmacol. - 2001. -
1, №8.-P. 1421-1441.
9. Kolb I. P. Mechanisms involved in the pro- and anti- apoptotic role of NO in human leukemia. // Leukemia. - 2000. -14, № 9.-P. 1685-1694.
10. Yabuki M„ Tsutsui K., Horton A. A, et al. Caspase activation and cytochrome с release during HL-60 cell apoptosis induced by a nitric oxide donor. // Free Radical Res. - 2000. - 32, №6.-P. 507-514.
