CC BY
57
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
EXPERIMENTAL INVESTIGATIONS
© А. Ю. Барышников, П. К. Иванов, 2001 УДК 615.277.3:616-097
А. Ю. Барышников, П. К. Иванов
ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ
НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей
Одним из направлений деятельности НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей, которая проводится в сотрудничестве с целым рядом клинических отделений и экспериментальных лабораторий РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, является разработка фармпрепаратов на основе моноклональных антител (МКА). В отличие от средств традиционной химио-и радиотерапии препараты МКА обладают высокой специфичностью и менее токсичны. Уже первый опыт клинического использования МКА (ОКТЗ, мабтера, герцептин) показал их эффективность при трансплантации костного мозга, в терапии гемобластозов, рака молочной железы и других органов [6, 10, 12]. Создание фармпрепапратов на основе МКА стало возможным во многом благодаря открытию опухольассоциированных антигенов [1], а также изобретению гибридомной технологии [11], которая стала мощным инструментом для научных исследований в биологии, иммунологии и медицине, импульсом для создания новых диагностических и лечебных средств.
МКА представляют собой высокоспецифичные антитела к определенному антигену, которые вырабатываются специально создаваемыми линиями клеток — гибридомами. Гибридома является продуктом слияния «бессмертной» линии клеток миело-мы мыши и клеток селезенки мышей, иммунизированных данным антигеном. После слияния клетки рассеивают по одной и отбирают те колонии, которые продуцируют антитела к исходному антигену. Полученные гибридные клетки неограниченно долго поддерживаются в культуре и вырабатывают большое количество антител, специфичных к исходному антигену. Поскольку все клетки культуры-продуцента являются потомками одной гибридной клетки и представляют собой один клон, синтезируемые ими антитела называют моноклональными.
К настоящему времени получено громадное количество шб-ридом-продуцентов МКА к различным, в том числе опухольассо-циированным, антигенам. Эти антитела используются для создания противоопухолевых препаратов — как чистые антитела, так и иммуноконъюгаты — иммунотоксины, радиофармпрепараты. Они применяются для радиоиммунолокализации опухолей и метастазов, в иммунометрическом определении опухольассоциированных антигенов. Общепризнанны и широко распространены в
A.Yu.Baryshnikov, P.K.Ivanov
ANTITUMOR THERAPEUTICALS ON THE BASIS OF MONOCLONAL ANTIBODIES
Institute of Experimental Diagnosis and Therapy of Tumors
Development of pharmaceutical agents on the basis of monoclonal antibodies (MAb) is an important field of joint research of the Institute of Experimental Diagnosis and Therapy of Tumors and several clinical and experimental laboratories of the N.N.Blokhin CRC, RAMS. Unlike conventional chemo- and radiotherapeuticals the MAb-based drugs are highly specific and low toxic. Pilot clinical study of MAb such as OKT3, mabtera, herceptin demonstrated their efficacy in bone marrow transplantation, therapy for hematological malignancies, breast cancer and other malignant diseases [6,10,12]. The development of MAb-based drugs was possible owing to discovery of tumor-associated antigens [1] and advance in hybridoma technology [11] that became a powerful tool for scientific biological, immunological and medical research, an impetus for development of new diagnostic and therapeutical agents.
MAb are high-specificity antibodies to certain antigens generated by specially produced cell lines, i.e. hybridomas. The hybridoma is a product of merging of an "immortal" mouse myeloma cell line and mouse splenic cells immunized with an antigen. After merging individual cells are cultured and those colonies that secret antibodies to the initial antigen are selected. The resultant hybrid cells are maintained in culture for unlimitedly long time to produce a large number of antibodies with specificity to the starting antigen. Since all cells of the pro-ducent culture are offspring of a single hybrid cell and thus form a single clone, the antibodies they produce are referred to as monoclonal.
There are a large number of MAb producent hybridomas for different antigens including tumor-associated antigens. These antibodies are used to develop anticancer drags consisting of both pure antibodies and immunoconjugates such as immunotoxins or radiopharmaceuticals. They are used to locate tumors and métastasés, to detect tumor-associated antigens. Tests for a-fetoprotein, carcinoembiyonic antigen, chorionic gonadotropin, carbohydrate antigens CA-125, CA-19-9, prostate-specific antigen and others are widely applied in the clinical practice [3]. These tests are an important basis for tumor diagnosis, chemo- and radiotherapy, detection of recurrent and metastatic tumors. The today diagnosis
клинике тесты на а-фегопрогеин, раково-эмбриональный антиген, хорионический гонадотропин, карбогвдратные антигены СА-125, СА-19-9, простатический специфический антиген и др. [3]. Данные этих анализов являются основанием для диагностики опухолей, проведения химио- или лучевой терапии, выявления рецидивов и метастазов. Сегодня невозможно представить современную диагностику гематологических заболеваний и иммунного статуса без им-мунофенотипирования клеток крови с помощью МКА
В РОНД им. Н. Н. Блохина РАМН создана большая панель МКА к дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека (более 60 наименований), позволяющая детально характеризовать гемобластозы, контролировать ход их лечения [2].
Экспериментальные и клинические исследования с использованием мышиных МКА при терапии опухолей позволили выявить основные механизмы биологического действия МКА. Ключевую роль здесь играет комплементзависимая и антителозависимая цитотоксичностъ, а главными эффекторными клетками выступают цитотоксические Т-лимфоцщы, натуральные киллеры и макрофага. Вместе стемработыпоследнихлет показали, что связывание и блокада клеточных рецепторов МКА могут приводить к генерации трансмембранного сигнала, который непосредственно контролирует клеточный рост и приводит к апоптозу [8].
Первым препаратом, разрешенным к применению в клинике, стал ортоклон ОКТ-3 фирмы «Орто-Фармасьютикалс». Он представляет собой лекарственную форму мышиных МКА к СБЗ-ре-цепгору Т-лимфоцитов и используется в трансплантологии при пересадке костного мозга, почки, печени и других органов. В результате применения препарата количество некупируемых кризов реакции отторжения пересаженной почки сократилось на 76%. Кроме того, профилактическое использование таких антител в раннем послеоперационном периоде позволяет увеличить годовую выживаемость трансплантата до 87% [10].
Разработанный в РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН препарат атэма основан на антителах ИКО-90. Связываясь с СОЗ-ре-цептором Т-лимфоцитов человека, он приводит к гибели этих клеток и обрывает иммунный ответ организма на трансплантированные органы или ткани.
Так же как и эффективные в клинике коммерческие МКА ОКТЗ, ИКО-90 относятся к ^в2а. Специфичность антител определялась по их реактивности с различными клеточными линиями и клетками крови здоровых доноров в сравнении с известными аналогами, в том числе методом двойной метки, и была подтверждена в рамках 5-го Международного рабочего совещания по дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека. Были проведены исследования по определению молекулярной массы антигена, выявляемого антителами, и функциональной активности в реакциях антигенной модуляции и активации Т-лимфоцитов. Оказалось, что по своим свойствам МКА ИКО-90 не уступали зарубежным аналогам [9]. Все эти данные свидетельствовали о возможности создания на основе антител ИКО-90 отечественного лекарственного препарата. Была разработана лекарственная форма препарата, проведены необходимые исследования его специфической активности, фармакокинетики, безвредности в сравнении с зарубежным аналогом ОКТЗ. Определяли апирогенность и стерильность различных серий. Чистота полученных антител по данным электрофореза в полиакриламидном геле и гель-фильтрации с использованием системы БРЬС составила не менее 99%.
of hematological malignancies and immunity status is impossible without immunophenotyping of blood cells with MAb.
Investigators from the N.N.Blokhin CRC, RAMS, have developed a large panel of MAb to human leukocyte differentiation antigens (more than 60) to characterize in detail hematological malignancies and to control their treatment [2].
Experimental and clinical study of murine MAb in tumor therapy discovered principal mechanisms of MAb biological activity. Complement-dependent and antibody-dependent cytotoxicities play the key role here, and cytotoxic T-lympho-cytes, natural killers and macrophages act as main effector cells. However, recent study demonstrated that the binding and blocking of cell receptors by MAb might result in generation of transmembrane signal that controls directly cell growth and leads to apoptosis [8].
Orthoclone OCT-3 supplied by Ortho-Pharmaceuticals was the first drag allowed for clinical application. It is a dosage form of murine MAb to CD3-receptor of T-lymphocytes and is used in transplantation of bone marrow, kidney, liver and other organs. As a result of the drug application the rate of uncontrollable rejection crises reduced to 76%. Besides, prophylactic administration of these antibodies early postoperatively increased 1-year graft survival to 87% [10].
The drug atema developed at the N.N.Blokhin CRC, RAMS, on the basis of antibody ICO-90 binds to CD3-receptor of human T-lymphocytes thus killing these cells and interrupting the body's immune response to the graft.
Like clinically effective MAb OKT3, ICO-90 belongs to IgG2a class. The antibody specificity was determined by reactivity with various cell lines and healthy donors' blood cells in comparison with known analogs among others by double-label technique, and was verified at the 5th International Workshop on human leukocyte differentiation antigens. The study included measurement of molecular weight of the antigen recognized by the MAb, and determination of its functional activity by reactivity in antigen modulation and T-lymphocyte activation tests. The MAb ICO-90 was found as effective as its foreign analogs [9]. This was a good background for development of a home drug on the basis of ICO-90. We developed a pharmaceutical form, conducted specific activity, pharmacokinetics, safety studies in comparison with the foreign analog OKT3. Pyrogenicity and sterility testing of different series was performed. Purity of the antibody by electrophoresis in polyacrylamide gel and gel filtration using an FPLC system was not less than 99%.
The drug is currently on clinical trial at leading kidney transplantation centers. The drug was successfully used in the treatment of 4 patients with the risk of graft rejection. The Institute of Pediatric Oncology, CRC, also has some experience in the use of this drug.
Patient K., a 20-year old female, was managed at the Hematology and Kidney Transplantation Department, Moscow Regional Clinical Institute. On day 20 following surgery the patient presented with graft rejection reaction, increased serum creatinine and significantly decreased diuresis. Routine immunosuppressive therapy was ineffective. There was a risk of losing the kidney and the drag atema was administered by vital indications. Atema was given intravenously at 5 mg daily for 10 days. T-lymphocyte measurement demonstrated that already by
Experimental Investigations
В настоящее время препарат проходит клинические испытания в ведущих центрах трансплантации почки. С его помощью уже вылечены 4 пациента, у которых возникла угроза отторжения трансплантата, опьгг его использования есть и в отделении трансплантации костного мозга Института детской онкологии РОНЦ.
В отделении гемодиализа и трансплантации почки Московского областного научно-исследовательского клинического института убольнойК., 20 лет, на 20-е сутки после операции по пересадке почки возникла реакция отторжения трансплантата. Возрос уровень креатинина в сыворотке крови, резко снизился диурез. Традиционная иммуносупрессивная терапия была неэффективной, возникла угроза потери органа, и тогда по жизненным показаниям был назначен препарат атэма. Он вводился ежедневно по 5 мг внутривенно на протяжении 10 дней. При определении содержания Т-лимфоцитов в крови больной было показано, что уже к 6-му часу от начала введения антител уровень СОЗ-положительных клеток снижается практически до нуля. В дальнейшем происходит постепенное их нарастание до нормального уровня. В результате проведенного лечения у больной появился диурез, уровень креатинина понизился. Таким образом, функция трансплантированной почки была восстановлена, и через 4 нед больная была выписана домой в хорошем состоянии. В настоящее время ее самочувствие удовлетворительное.
Другой препарат — имутеран — был разработан совместно с НИИ онкологии им. П. А. Герцена на основе МКА ИКО-25. Эти антитела направлены к опухольассоциированному антигену семейства белков, кодируемых геном MUC1. Антиген MUC1 представляет собой гликолипопротеин с мол. массой более 250 кД. Степень гликозилирования его в злокачественных клетках значительно ниже, чем в нормальных тканях. Уровень антигена резко повышается при раке молочной железы, матки, яичника, толстой кишки, щитовидной железы. Известно, что этот антиген обладает антиадгезивными свойствами и способствует метаста-зированию опухолей. В результате исследований было показано, что МКА ИКО-25 относятся к классу IgGl, оказывают цитоста-тическое действие в культуре опухолевых клеток. В экспериментах in vivo внутривенное введение антител ИКО-25 бестимусным мышам тормозит рост гетеротрансплантата клеток рака толстой кишки [5]. Была создана лекарственная форма препарата, получено разрешение Минздрава РФ и начата 1-я фаза клинических испытаний в химиотерапевтических отделениях РОНЦ. В задачи исследования входит определение максимально переносимой дозы и выяснение видов токсичности. При введении препарата 3 больным с диагнозом «диссеминированный рак матки, диссе-минированнй рак молочной железы с метастазами в легкие из невыявленного первичного очага» было установлено, что имутеран не обладает токсическими свойствами.
Важным направлением работы мы считаем не только создание чистых терапевтических МКА, но и их использование в качестве агента для адресной доставки к опухолевой клетке токсинов. Одним из таких препаратов, созданных совместно с исследователями НИИ трансплантации и искусственных органов, является аристатин 5. Это конъюгат МКА ИКО-80, направленных к CD-5 рецептору Т-лимфоцитов и a-цепи рицина. Специфичность действия аристатина была исследована на лимфоцитах периферической крови здоровых доноров, а также на клетках перевиваемых клеточных линий, экспрессирующих антиген CD5. Было показано, что специфичность антител в
hour 6 after antibody therapy start the level of CD3-positive cells reduced practically to zero. Then their recovery to normal levels occurred. As a result of treatment the patient had diuresis, creatinine level decreased and the function of the grafted kidney was restored. At 4 weeks the patient was dismissed in good general condition. At present she feels quite well.
Another drug, imuteran, was developed together with the P.A.Hertzen Institute of Oncology, on the basis of MAb ICO-25. This antibody is against a tumor-associated antigen of a protein family encoded by gene MUC1. The MUC1 antigen is a glycoprotein with molecular weight more than 250 kilodanton. Its gly-cosylation degree in malignant cells is much higher than in normal tissues. The antigen level is elevated dramatically in cancer of the breast, womb, ovary, colon, thyroid. The antigen demonstrates antiadhesive properties and promotes tumor metastasis. MAb ICO-25 belongs to IgGl class, demonstrates cytotoxic activity in tumor cell culture. In in vivo experiments intravenous administration of ICO-25 to athymic mice inhibited growth of colonic cancer cell heterografits [5].
A pharmaceutical form of the drug was developed and the RF Health Ministry allowed phase I clinical trial of the drug at chemotherapeutical departments of the CRC. The puipose of the study was to determine maximally tolerable dosage and toxicity. The drug was administered to 3 patients with advanced cancer of the womb, advanced breast cancer and lung metastases of unknown origin. Imuteran had no toxic effects.
Another important field of research involves development of agents for target-specific transport of toxins to cancer cells on the basis of MAb. Aristatin 5 is a new agent developed together with the Institute for Transplantology and Artificial Organs. The drug is a conjugate of ICO-8O to CD-5 receptor of T-lympho-cytes and ricin a-chain.
Aristatin specificity was studied on peripheral lymphocytes from healthy donors and on CD5-expressing transplantable cell lines. It was demonstrated that the antibody preserved its specificity in the immunoconjugate and produced selective cytotoxic effect on target cells as discovered by MTT testing. As appeared, lethal toxin concentration in the conjugate was two orders of magnitude lower than that of pure toxin having the same effect [4].
We are currently completing preclinical study of the drug and hope that it will be useful in transplantation of allogeneic bone marrow to prevent graft-versus-host reaction and to clear bone marrow from leukemic T-cells in autotransplantation. Another immunotoxin is under development that is based on MAb to melanoma-associated antigen ICO-218 and ricin a-chain. Immunohistochemical study demonstrated the conjugate to bind to melanoma cells, and cytotoxicity testing demonstrated selectivity of the drug action.
Immunomagnetic cell separation is another relatively new field of MAb application. In spite of the advance in development of highly effective antitumor drugs their use is often limited due to hematotoxicity. Bone marrow autografting is a way to overcome this toxicity. However, if bone marrow is affected by metastasis its grafting will inevitably result in cancer recurrence. The problem is therefore to select normal hemopoietic cells in bone marrow.
The essence of the method consists in the following. MAb, bound to ferromagnetic microparticles, interact with CD34+ hemopoietic cells, under magnetic field these cells are separated
иммуноконъюгате сохраняется, а в МТТ-тесте установлено, что аристатин оказывает избирательное цитотоксическое действие по отношению к клеткам-мишеням. Оказалось, что концентрация токсина в конъюгате, вызывающая гибель клеток, на 2 порядка ниже, чем чистого токсина, дающего подобный эффект [4]. В настоящее время заканчиваются предклиничес-кие исследования препарата, и мы надеемся, что он может быть использован при трансплантации аллогенного костного мозга для предупреждения реакции «трансплантат против хозяина», а также для очистки костного мозга от лейкозных Т-клеток при аутотрансплантации. Разрабатывается и другой иммунотоксин на основе МКА к меланомоассоциированному антигену ИКО-218 и а-цепи рицина. В иммуногистохимичес-ком исследовании определялось связывание конъюгата с клетками меланомной линии, а цитотоксический тест свидетельствовал об избирательном действии препарата.
Относительно новым направлением в использовании МКА является иммуномагнитная сепарация клеток. Дело в том, что, несмотря на достижения в создании высокоэффективных противоопухолевых препаратов, их применение зачастую ограничено из-за гематотоксичности. Одним из путей ее преодоления является аутотрансплантация костного мозга. Но если костный мозг поражен метастазами, его пересадка неизбежно приведет к рецидивированию опухолевого процесса. Таким образом, задача состоит в избирательной селекции здоровых гемопоэтичес-ких стволовых клеток костного мозга. Суть метода состоит в том, что МКА, связанные с ферромагнитными микрочастицами, взаимодействуют с СВ34+-гемопоэтическими клетками, в магнитном поле эти клетки отделяются от всех остальных, а после разрушения комплекса с иммуносорбентом стволовые клетки замораживаются и используются для аутотрансплантации. Для решения этой задачи совместно с НИИТОЧМАШ и НПЦ «МедБиоСпектр» были разработаны технология получения магнитоуправляемых полистирольных микросфер, не уступающих зарубежным аналогам, а также методы и аппаратура для иммуномагнитной сепарации. Для выделения стволовых гемопоэтических клеток мы использовали анти-СБ34-МКА ИКО-115, конъюгированные с магнитоуправляемыми микросферами. Эксперименты проводились на модельных системах, состоящих из искусственной смеси клеточных линий К01, экспрессирующей антиген СЭ34 и ГУ, не имеющего данного антигена. Изготовленный иммуномагнитный сорбент (ИММС) практически полностью извлекал все клетки линии К01. Аналогичные результаты были получены и при выделении СБ34+~ кяеток из периферической крови больного хроническим мие-лоидным лейкозом в стадии бластного криза. В то же время при инкубации ИММС с суспензией лимфоцитов здорового донора было показано, что сорбент обладает высокой специфичностью — более 98% [10]. Это исследование позволяет надеяться на скорейшее внедрение ИММС в клинику для аутотрансплантации стволовых клеток.
Таким образом, создание лекарственных препаратов на основе МКА является одним из наиболее перспективных направлений в биотерапии опухолей.
from the rest of the cells and after the complex with immunosorbent is destroyed, the stem cells are frozen and ready to use for autotransplantation.
Together with the Institute for Precise Equipment and Science and Production Center MedBioSpectr we developed a technology to produce magnet-controlled polystyrene microspheres of the same quality as their foreign analogs, as well as methods and equipment for immunomagnetic separation. Anti-CD34 MAb ICO-115 conjugated with magnet-controlled microspheres was used to isolate stem hemopoietic cells. The experimental study was performed on a model system consisting of artificial mixture of KG1 cell lines expressing antigen CD34 and JY free from the antigen. The resultant immunosorbent extracted practically all KG1 cells. Extraction of CD34+ cells from peripheral blood of a patient at blast crisis of chronic myeloid leukemia gave similar result. Incubation of the immunomagnetic sorbent with normal donor's lymphocyte suspension demonstrated the sorbent to have a 98% specificity [10]. This study gives hope for clinical application of the immunomagnetic sorbent for stem cell autografting.
In summary, development of drugs on the basis of MAb is a most promising field of scientific research in tumor biotherapy.
ЛИТЕРА ТУРА/REFERENCES
1. Абелев Г. И., Перова С. Д., Храмкова Н. И. и др. // Биохимия. —
1963. - Т. 28, № 4. - С. 625-634.
2. Барышников А. Ю. // Гематол. и трансфузиол. — 1988. — Т. 22,
№ 2. - С. 15-20.
3. Кадагидзе 3. Г. // Веста. Рос. РАМН. - 1999. - № 5. —
С. 19-22.
4. Полосухина Е. Р., Демина И. А., Иванов П. К. и др. // Высокие
технологии в онколгии: Материалы 5—го Всероссийского съезда онкологов. — 2000. — Т. 1. — С. 247—249.
5. Якубовская Р. И., Барышников А. Ю., Кармакова Т. А. и др. //
Арх. пат. — 1991. — № 6.— С. 11—16.
6. Baselga /., Tripathy D., Mendelsohn J. et al. //. Semin. Oncol. —
1999. - Vol. 26, N 4. - P. 78-83.
7. Воппфу—Berard N., Oenesttier L., Flacher M. et al. // Blood. —
1994.-Vol. 83.-P. 1051.
8. Cosimi A. B., Burton R. C., Colvin Jt. B. et al. // Transplantation. —
1981.-Vol. 32, N 6. - P. 535.
9. Ivanov P. K., Blokhin D. Yu., Baryshnikov A. Yu. et al.//7—th International
Congress on anti—Cancer Treatment. — Paris, 1997. — P. 163.
10. Ivanov P. K., Polosukhina E. R., Zabotina T. N. et al. // Proc. 2nd World Meeting API/APV (Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutic Technology). — Amsterdam, 1998. — P. 1189—1190.
11. Kohler O., Milstein C. // Nature. - 1975. - Vol. 256. - P. 495-498.
12. Maloney D. G., Grillo—LopezA. I., White C. A. et al. // Blood. — 1997. - Vol. 90, N 6. - P. 2188-2195.
Поступила 19.03.2001 / Submitted 19.03.2001
