CC BY
30
© Коллектив авторов, 2001
УДК 618.19-006.6-033.2-078.73:616.419+616.428
В. П. Летягин, А. В. Паниченко, О. В. Крохина, Н. Н. Тупицын.,
В■ Д. Ермилова, С. Н. Рязанцева, Е. В. Артамонова,
В. К. Соколова, В. Н. Блиндарь
ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКОЕ СТАДИРОВАНИЕ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
НИИ клинической онкологии
Рак молочной железы является самой частой злокачественной опухолью у женщин в России [2]. Проводятся крупномасштабные разработки по совершенствованию диагностики и лечения рака молочной железы на основе изучения молекулярно-генетических механизмов опухолевой прогрессии.
Принципиально новым подходом к оценке степени распространенности рака молочной железы в организме является иммунологическое обнаружение опухолевых клеток в гемопоэти-ческих органах (лимфоузлы, костный мозг). В основе метода иммунодиагностики метастазов лежит специфика экспрессии ряда генов, присущая только эпителиальным клеткам. Продуктами этих генов являются цитокератины, Egp34, НМРО-1, раково-эмбриональный антиген (РЭА) и другие белки, которые могут быть обнаружены с помощью моноклональных антител (МКА). Экспрессия эпителиальных генов может быть установлена также на уровне мРНК методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Чувствительность иммуноморфологических методов с использованием МКА и чувствительность ПЦР примерно одинакова. Эти методы позволяют обнаружить 1 опухолевую эпителиальную клетку среди миллиона гемопоэтических клеток, что является значительно более точным в сравнении с морфологическими методами. Вместе с тем возникает и проблема: нужна ли столь высокая точность обнаружения метастатических клеток дан стадирования рака молочной железы? Насколько важен вклад единичных опухолевых клеток (называемых микрометастазами) в развитие клинической картины метастатического поражения?
Данные литературы по этому вопросу противоречивы. Большинство исследователей считают, что наличие микрометастазов рака молочной железы в лимфоузлах или в костном мозге, так же, как и наличие метастазов, выявляемых морфологическими методами, является показателем степени диссеминации опухоли по организму и взаимосвязано с ухудшением прогноза заболевания [4, 6, 9, 10]. В действительности эта проблема не является простой, и для ее решения потребуется достаточно длительное (по меньшей мере 5-летнее) наблюдение за больными, прошедшими на этапе диагностики, до оперативного вмешательства, иммуноморфологическое исследование регионарных лимфоузлов и костного мозга для выявления микрометастазов.
В настоящей работе мы представляем результаты иммуномор-фологического исследования регионарных лимфоузлов и костного мозга у 89 больных раком молочной железы различных стадий и гистологических типов. Данные указывают на значительно большую чувствительность иммуноморфологического метода в сравнении со стандартным гистологическим исследованием лимфоузлов и морфологическим изучением мазков костного мозга.
VP.Letyagin, A. V.Panichenko, O. V.Krokhina, N.N. Tupitsyn, V.D.Ermilova, S.N.Ryazantseva, E. VArtamonova, V.K.Sokolova, V.N.Blindar
IMMUNOMORPHOLOGICAL STAGING OF BREAST CANCER
Institute of Clinical Oncology
Breast cancer is the commonest female malignancy in Russia [2]. There was a vast study aimed to improve diagnosis and treatment of breast cancer on the basis of molecular genetic mechanisms of tumor progression over the recent years.
Immunological identification of tumor cells in hemopoietic organs (lymph nodes, bone marrow) is a novel approach to assessment of breast cancer advance. The immunodiagnosis of metas-tases is based on specific expression of some genes on epithelial cells only. Products of these genes include cytokeratins, Egp34, HMFG-1, carcinoembryonic antigen (CEA) and other proteins that can be detected with monoclonal antibodies (MAb). Epithelial gene expression may also be found at the mRNA level by reverse transcription and polymerase chain reaction (PCR).
The immunomorphological tests with MAb and PCR have similar sensitivity. These tests can discover a single epithelial cell among one million hemopoietic cells, i.e. their sensitivity is much higher as compared with morphological tests. However, the question may arise whether such accuracy of metastatic cell identification is needed to stage breast cancer? How great is the contribution of single metastatic cells (referred to as micrometastases) into development of clinical pattern of metastatic disease?
The published data are equivocal. Most investigators believe the presence of lymph node or bone marrow micrometastases of breast cancer as weE as morphologically detectable metastases to be evidence of tumor dissemination and related to poor prognosis
[4,6,9,10]. This problem is not simple, and a rather long follow-up (at least 5-year) is needed over patients having undergone immunomorphological testing of regional lymph nodes and bone marrow for micrometastasis identification at the diagnostic stage before surgery.
This paper describes results of immunomorphological study of regional lymph nodes and bone marrow in 89 patients with breast cancer of different stage and histology. Our findings demonstrate the immunomorphological test to have much higher sensitivity as compared to standard histological investigation of lymph nodes and bone marrow smears.
Materials and Methods. The study was performed in 89 patients with breast cancer managed at the Surgery Department of Breast Tumors, N.N.Blokhin Memorial CRC, RAMS. The patients' age ranged from 28 to 72 years, median 2 years. The patients underwent standard clinical examination including mammography, chest x-ray, ultrasound of liver and small pelvic organs, bone scintigraphy.
Immunohistochemical study of regional lymph nodes was carried out in 50 cases having stage I (4, 24%), stage Ha (24, 48%), stage lib (20, 40%), stage Ilia (1) and Illb (1). Morphological study of regional axillary lymph nodes included lower axillary nodes located laterally to the smaller pectoral muscle (level I), interpectoral nodes located between medial and lateral edges of the smaller pectoral muscle (level II), apical and subclavicular nodes located medially to the smaller pectoral muscle (level III). The study included standard histological investigation (HI) of the tumor, adjacent tissues and
Материалы и методы. Исследование проведено у 89 больных раком молочной железы, проходивших обследование и лечение в хирургическом отделении опухолей молочных желез РОНД им. Н. Н. Блохина РАМН. Возраст больных от 28 до 72 лет, медиана 52 года. Больным проводилось стандартное клиническое обследование, включающее маммографию, рентгенографию органов грудной клетки, УЗИ печени и органов малого таза, сцинтиграфию костей скелета.
Иммуногистохимическое исследование регионарных лимфоузлов проведено 50 пациенткам: I стадия выявлена у 4 (24%) пациенток, Па — у 24 (48%), Пб — у 20 (40%), Ша — у 1 и III6 — у 1 пациентки. Морфологически были охарактеризованы на наличие метастазов регионарные подмышечные лимфоузлы различных уровней: нижнеподмышечные лимфоузлы, расположенные латерально по отношению к малой грудной мышце (I уровень), межпек-торальные лимфоузлы, расположенные между медиальным и латеральным краем малой грудной мышцы (II уровень), апикальные и подключичные лимфоузлы, расположенные медиально по отношению к малой грудной мышце (III уровень). Проводилось стандартное гистологическое изучение (ГИ) опухоли, окружающих тканей и регионарных лимфоузлов, а также иммуногистохимическое (ИГХ) исследование. Использованы МКА к эпителиальным антигенам: САМ5.2 (цитокератины), Egp34 (НЕА-125) — панэпителиальный антиген, РЭА (НЕА-19), HMFG-1 (ИКО-25) — антиген мембран жировых глобул. Исследования иммунофенотипа метастазов были проведены на криостатных срезах материала, полученного интраоперационно.
Иммуноцитологическое исследование на наличие метастатических клеток в костном мозге проведено 39 больным раком молочной железы. В этой группе распределение больных по стадиям было следующим: I стадия рака молочной железы была у 3 (7,7%) пациенток, Па стадия — у 7 (17,95%) больных (T2N0M0 — у 6 и T1N1M0 — у 1), Пб стадия — у 8 (20,5%), Ша стадия — у 2 (5,13%), Шб стадия — у 12 (30,77%) и IV стадия — у 7 (17,95%) больных. Материал для исследования получали при стернальной пункции. Изучение костного мозга проводилось как стандартным цитологическим, так и имму-ноцитологическим методом с применением МКА. Содержание опухолевых клеток оценивали на цитоцентрифужных препаратах. Положительной считали реакцию при наличии 1 метастатической клетки на 1 млн миелокарио-цитов. Использовали МКА к панцитокератинам KL-1 («Immunotech», Франция) и САМ5.2 («Becton Dickinson», США).
Результаты и обсуждение. При морфологическом и иммуно-гистохимическом обследовании 50 больных раком молочной железы на наличие метастатического поражения регионарного лимфатического аппарата были получены следующие данные: у 33 пациенток были диагностированы метастазы в аксиллярные лимфоузлы (66%) при иммуногистохимическом анализе и только у 20 (40%) пациенток при морфологическом исследовании.
Из 584 лимфоузлов, исследованных морфологически, метастатическое поражение было выявлено в 102 (17,5%) случаях. Наличие метастазов иммуногистохимическим методом было обнаружено в 91 (36%) случае из 253.
Более половины пораженных лимфоузлов при обоих методах исследования приходилось на I уровень метастазирования (56% при ГИ, 51% при ИГХ-методе), на II уровне было выявлено 27 и 31% метастатических лимфоузлов и на III уровне — 14 и 16,5% лимфоузлов соответственно при ГИ и ИГХ-анализе.
Наиболее показательными маркерами, подтверждающими наличие метастатического поражения регионарного лимфатического аппарата при раке молочной железы, являются САМ5.2, ИКО-25, НЕА-125 (табл. 1).
В большинстве случаев метастатические клетки в пораженных лимфоузлах коэкспрессировали эпителиальные маркеры — НЕА-125 + ИКО-25 + САМ5.2+ (47%). Значительно реже обнаруживалась реакция САМ5.2 в сочетании с ИКО-25 (14%) или без такового (13%). Другие комбинации антигенов были немногочисленными (табл. 2).
При стандартном цитологическом исследовании метастазы в костный мозг были выявлены у 2 (5,13%) из 39 больных. У одной из них IV клиническая стадия была установлена до обнаружения метастатических клеток в костном мозге (T4N2M1,
regional lymph nodes as well as immunohistochemical investigation (IGC). The study used the following MAb to epithelial antigens: CAM 5.2 (cytoker-atins); Egp 34 (HEA-125), panepithelial antigen; CEA (HEA-19), HMFG-1 (ICO-25), fat globule membrane antigen. Metastasis immunophenotyping was performed in cryostatic sections of operative specimens.
Immunocytological identification of bone marrow metastatic cells was performed in 39 breast cancer patients. Distribution of cases with respect to disease stage was as follows: 3 (7.7%) had stage I, 7 (17.95%) (6 T2N0M0 and 1 T1N1M0) had stage 11a, 8 (20.5%) had stage lib, 2 (5.13%) had stage Ilia, 12 (30.77%) had stage Illb, 7 (17.95%) had stage IV. Study material was harvested by sternal puncture. Bone marrow study was carried out both by standard cyto-logical and immunocytological tests with MAb. Tumor cell content was assessed in centrifuged specimens. Positive test was defined as the presence of 1 metastatic cell per 1 million myelocaryocytes. The MAb to pancytokeratins KL-1 (Immunotech, France) and CAM5.2 (Becton, Dickinson, USA) were used.
Results and Discussion. Of the 50 women undergoing morphological and immunohistochemical testing for regional lymph node métastasés axillary lymph node involvement was identified in 33 (66%) cases immunohistochemicaly and in 20 (40%) morphologically.
Of 584 lymph nodes studied morphologically 102 (17.5%) were positive. Immunohistochemical testing discovered métastasés in 91 (36%) of 253 nodes.
More than half the affected lymph nodes as found by both techniques were at metastasis level I (56% by HI, 51% by IHC), 27% and 31% were found at level II, 14% and 16.5% at level III by HI and IHC, respectively.
CAM5.2, ICO-25, HEA-125 were the most informative markers of metastatic affection of regional lymph nodes in breast cancer (table 1).
In most cases metastatic cells in affected lymph nodes coexpressed epithelial markers HEA125 + ICO-25 + CAM5.2 (47%). CAM5.2 with (14%) orwithout (13%) ICO-25 was found less frequently. There were but few cases with other antigen combinations (table 2).
Standard cytological study discovered bone marrow métastasés in 2 (5.13%) of 39 patients. One of these patients had stage IV disease before the discovery ofbone marrow involvement (T4N2M1, axillary lymph node conglomeration, epigastral and para-aortal, lymph node métastasés, hepatic métastasés). In the other case disease stage was initially assessed as T2N0M0 (Ha) to be changed to IV after bone marrow involvement was found. The presence of bone marrow métastasés was confirmed by immunocytology in both cases.
Bone marrow micrometastases were discovered in 19 (48.7%) of 39 patients by immunocytological tests using CAM5.2 and KL-1.
Table 3 presents frequencies ofbone marrow metastasis with respect to breast cancer stage.
These findings are in favor of identification of metastatic cells in bone marrow of patients with different stages of breast cancer. No métastasés (0%) were found in stage I. Frequency ofbone marrow involvement was higher in stage Ha. More than half the cases with stage Illb, IV and lib disease presented with bone marrow involvement. The highest percentage of micrometastases was found in stage lib. What is important, the number of cells discovered immunocyto-logically was very small ranging from 1 to 12 per million myelocaryocytes. Only 2 of 19 cases had 20 to 45 cells per million normal bone marrow cells. Both patients had stage IVbreast cancer (T2N1M1 and T1N2M1), supraclavicular lymph node métastasés. Both the patients were young (28 and 39 years). The ability to detect single tumor cells in bone marrow accounts for higher sensitivity of this test as compared to cytology: cf., 19 (48.7%) and 2 (5.13%) of 39. Immunocytological test provides a more accurate assessment of hematogenous dissemination of breast cancer into bone marrow than standard cytology.
конгломерат лимфоузлов в подмышечной области, метастазы в лимфоузлы эпигастральной области, парааортальные лимфоузлы, печень). В другом случае исходная стадия заболевания была расценена как T2N0M0 (Па), после цитологического обнаружения метастазов в костный мозг стадия изменена на IV. У обеих больных метастазы в костный мозг подтверждены им-муноцитологическим методом.
Микрометастазы в костный мозг были выявлены у 19 (48,7%) из 39 больных с помощью иммуноцитологического метода с применением САМ5.2 и KL-1.
Частота обнаружения метастазов в костном мозге в зависимости от стадии рака молочной железы представлена в табл. 3.
Представленные данные свидетельствуют о возможности обнаружения метастатических клеток в костном мозге у больных раком молочной железы на различных стадиях заболевания. Наименьший процент (0) метастазов отмечен при I стадии заболевания. Частота выявления опухолевых клеток в костном мозге возрастала при Па стадии. Метастазы выявлены более чем в половине случаев при III6, IV и 116 стадиях. Наибольший процент микрометастазов отмечен при 116 стадии. Важным является то, что количество опухолевых клеток, определяемых иммуноцитологическим методом, являлось очень низким: от 1 до 12 на 1 млн миелокариоцитов. Лишь у 2 из 19 больных иммуноцитологически было выявлено 20 и 45 клеток в 1 млн нормальных клеток костного мозга. У обеих пациенток была установлена стадия IV рака молочной железы (T2N1M1 и T1N2M1), имелись метастазы в надключичные лимфоузлы. Обе больные были молодого возраста (28 и 39 лет). По-видимому, возможность выявления единичных опухолевых клеток в костном мозге является главной причиной большей чувствительности данного метода в сравнении с цитологическим исследованием: 19 (48,7%) больных из 39 и 2 (5,13%) из 39. Следовательно, иммуноци-тологический метод позволяет более точно судить о степени гематогенной диссеминации рака молочной железы в костный мозг, чем стандартное цитологическое исследование.
Табл ица 2
Комбинации эпителиальных маркеров на метастатических ю
Таблица 1 Table 1
Частота обнаружения различных маркеров
на метастазах рака молочной железы
Frequency of marker detection in breast cancer métastasés
Маркер Количество пораженных лимфоузлов Общее количество исследованных лимфоузлов Частота выявления метастазов, %*
CAM 5.2 80 249 87,9
ИКО-25 ICO-25 71 245 78
HEA-125 59 250 64,8
HEA-19 15 250 16,4
No. of lymph Total No. of Percentage of
Marker nodes lymph nodes metastasis
affected studied detection*
* Процент от общего числа метастазов (п = 91), выявленных ИГХ-методом. / *, Percentage of the total number of metastases (n=91) as detected by IHC.
Regional lymph node status is a most informative characteristic of breast cancer prognosis and a valuable factor for choice of treatment strategy. It was established over the recent years that tumor immunophenotype is related to regional metastasizing, immuno-histochemical methods can identify 1-3 tumor cells which is impossible using morphological tests. Csemietal. [5] reported that 10-20% of metastatically affected lymph nodes might be overlooked by histopathological study. Some investigators demonstrated that IHC may change N0 staging into N1 in some cases which in turn suggests another treatment policy [8]. Frequency of such metastasis ranges from 9% to 33% [7], by our findings 18%.
Metastases of breast cancer start to grow when the primary is still small (less than 0.125cm3) [9]. Hematogenous dissemination of cancer cells starts soon after vascularization of the primary, bone and bone marrow metastasis being most frequent.
Table 2
: / Epithelial marker combinations on metastatic cells
Сочетание маркеров Количество пораженных лимфоузлов, выявленных данным сочетанием МКА Частота от всех пораженных лимфоузлов, выявленных ИГХ (п = 91), %
HEA-125 + ИКО-25 + CAM5.2 HEA-125+ICO-25+CAM5.2 44 48,3
ИКО-25 + CAM5.2 ICO-25+CAM 5.2 13 14,2
CAM5.2 12 13,1
HEA-125 + ИКО-25 + CAM5.2 + HEA-19 HEA-125+ICO-25+CAM 5.2+HEA-19 8 8,7
HEA-125 + CAM5.2 6 6,5
И КО-25 / ICO-25 3 3,2
ИКО-25 + CAMS. 2 + HEA-19 ICO-25+CAM5.2+HEA-19 3 3,2
HEA-125 2 2,1
HEA-125 + HEA-19 + CAM5.2 1 1
HEA-19+ CAM5.2 1 1
Marker combination No. of affected lymph nodes as identified by the given MAb combination Percentage of the total No. of affected lymph nodes identified by IHC (n=91)
Состояние регионарных лимфоузлов при раке молочной железы является одним из наиболее информативных показателей, определяющих прогноз заболевания и дальнейшую тактику лечения. Работами последних лет установлена закономерность влияния иммунофенотипа опухоли на возникновение регионарных метастазов, при помощи иммуногистохимической методики показана возможность определения 1—3 опухолевых клеток, морфологическая идентификация которых невыполнима. По данным G. Csemi и соавт. [5], 10—20% случаев метастатически измененных лимфоузлов может бьггь пропущено при гистопато-логическом исследовании. Некоторые исследования показали, что при использовании ИГХ-метода пациенты из NO-группы могут быть переведены в Nl-ipyimy, что соответственно влияет на дальнейшую тактику лечения [8]. Частота подобных микрометастазов колеблется от 9 до 33% [7], по нашим данным — 18,5%.
Метастазы рака молочной железы начинают развиваться при очень малых размерах первичной опухоли (менее 0,125 смЗ) [9]. Гематогенная диссеминация раковых клеток наступает вскоре после васкуляризации первичной опухоли, наиболее часто отмечается метастазирование в костную систему, а также в костный мозг.
Повышение чувствительности выявления микрометастазов в костный мозг достигается с помощью иммуноцитологичес-кого исследования с использованием МКА. Для выявления микрометастазов также могут быть использованы ПЦР, проточная цитометрия, метод тканевых культур [1].
Частота выявления раковых клеток в костном мозге возрастает при более поздних стадиях процесса и наличии неблагоприятных факторов прогноза [4,9,10]. Рад исследователей попытались количественно определить «критическую» опухолевую нагрузку костного мозга, превышение которой достоверно было бы связано с ростом частоты рецидивов заболевания. Было показано, что количество рецидивов рака молочной железы резко возрастает при обнаружении в костном мозге 10 или 15 изолированных опухолевых клеток [3].
Несмотря на широкое внедрение иммуноморфологического метода обнаружения метастатических клеток в регионарных лимфоузлах и костном мозге больных раком молочной железы, четких критериев использования этого показателя при установлении стадии заболевания не существует. Эта проблема остается актуальной и может быть обозначена как разработка критериев иммунологического стадирования рака молочной железы.
Представленные нами результаты убедительно демонстрируют необходимость иммунологического исследования регионарных лимфоузлов и костного мозга д ля оценки степени распространенности рака молочной железы.
Для установления клинической значимости микрометастазов и, в частности, возможности стадирования рака молочной железы на этой основе необходим проспективный анализ продолжительности периода до возврата заболевания в сравниваемых группах при условии проведения больным однотипного лечения.
ЛИТЕРА ТУРА /REFERENCES
1. Берензон Б. Г., Колосков А. В., Тарасов В. А. //Гематол. и трансфузи-
ол. - 2000. - Т. 45, № 5. - С. 35-37.
2. Трапезников Н. Н., Аксель Е. М. Заболеваемость злокачественными
новообразованиями и смертность от них населения стран СНГ. —
М., 1999. - С. 85.
Таблица 3 Table 3
Распределение больных с микрометастазами рака молочной железы в костный мозг по стадиям Distribution of cases with bone marrow micrometastases of breast cancer with respect to disease stage
Число больных
Стадия Число больных с микрометастазами в костном мозге
абс. %
1 3 0 0
lia 7 3 42,86
116 8 5 62,5
Illa 2 0 0
1116 12 7 58,33
IV 7 4 57,14
No. of patients abs. %
Stage No. of patients with bone marrow micrometastases
Immunocytological tests with MAb provide a higher sensitivity of testing for bone marrow micrometastases. PCR, flow cytometry and tissue cultures may also be used to identify micrometastases [ 1 ].
The rate of detection of cancer cells in bone marrow increases with disease stage and in the presence of poor prognosis factors
[4,9,10]. Some investigators attempted quantification of a cutoff tumor load for bone marrow, with a larger number of metastatic cells being related to increased risk of breast cancer recurrence. It was demonstrated that detection of 10 or 15 isolated tumor cells was indicative of increased risk of breast cancer recurrence [3].
In spite of wide application of immunomorphological identification of metastatic cells in regional lymph nodes and bone marrow of breast cancer patients, there are no clear-cut tests to stage the disease. This problem is very important and may be defined as development of tests for immunological staging of breast cancer.
Our findings demonstrate the necessity of immunological study of regional lymph nodes and bone marrow to assess breast cancer advance. Perspective analysis of time to recurrence in groups of patients undergoing similar treatment is needed to determine clinical significance of micrometastases and, in particular, the possibility to stage breast cancer by these tests.
3. Calaluce R., Miedema B. W., Yesus Y. W. //J. surg. Oncol. — 1998.
- Vol. 67. - P. 194-202.
4. Coombs R. S., Redding W. H., Monaghan P. et al. //Lancet. — 1983.
— N2.-P. 1271.
5. Csemi G., Boross G., Baltas B. The role of the histopathological
analysis of sentinel lymph nodes in breast cancer. Preliminary findings. Orv Hetil. - 1998. - Vol. 139, N 32. - P. 1899-1903.
6. CoteRJ.,RosenP.P., Lesser M. L. //J. clin. Oncol. —1991. — N 9. — P.
1749.
7. Dowlatshahi K, Fan M. etal. //Cancer. —1997. — \5L 80, N 7. — E 1188—
1197.
8. MarchettiA., Viacava P., NaccaratoA. G., BonadioA, etal. //Proc.
Annu. Meet Am. Assoc. Cancer Res. — 1997. — Vol. 38. — P. A1795.
9. Reichman B. S., Osborne M. P. //Breast Cancer. — 1992. Section
XXI, ch. 70. - P. 1299-1302.
10. Unal E., Camlibel M. et al. //J. exp. clin. Cancer Res. — 1994. — Vol. 13. - P. 2.
Поступила 19.03.01 / Submitted 19.03.01
