CC BY
91
Методические положения
ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ РЕГЛАМЕНТ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО АНТИГЕНА ПРИ ЛАРВАЛЬНОМ ЭХИНОКОККОЗЕ ИЗ ПРОТОСКОЛЕКСОВ
Cysticercus tenuicollis
В.К. БЕРЕЖКО доктор биологических наук А.А. ТХАКАХОВА аспирант Л.А. НАПИСАНОВА кандидат биологических наук Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина, e-mail: [email protected] (одобрен секцией «Инвазионные болезни животных» Россельхозакадемии 23 сентября 2011 г., протокол № 3)
Многочисленными иммунохимическими исследованиями доказано близкое антигенное родство между Echinococcus granulosus и Cysticercus tenuicollis (W.K. Yong, D.D. Heath, 1984; T.K. Varma et al., 1986; MD. Rickard, D.I. Jenkins, 1986; H.A. Мунтян, 1971; Н.Е. Баллад, 1974; В.К. Бережко, 1994).
Исходя из этих данных и учитывая широкое распространение тенуи-кольного цистицеркоза, позволяющее приобрести достаточное количество биоматериала, была проведена работа по разработке методики выделения диагностического антигена при ларвальном эхинококкозе из протосколексов C. tenuicollis.
Диагностический антиген при ларвальном эхинококкозе представляет собой комплекс белковых компонентов, выделенных из экстракта протоско-лексов C. tenuicollis после гель-фильтрации на носителе TSK-Gel HW-5, и последующего отбора их иммуноферментной реакцией (ИФР) с использованием референс положительной эхинококкозной и отрицательной контрольной сыворотки.
Антиген предназначен для проведения сероэпизоотологических исследований и выявления больных эхинококкозом животных.
Оборудование:
1. Ступка фарфоровая с пестиком;
2. Магнитная мешалка;
3. Ультрацентрифуга лабораторная с охлаждением на 15 тыс. об/мин.;
4. Спектрофотометр СФ-26 (ЛОМО);
5. Термостат 37 оС;
6. Анализатор колориметрический иммуноферментный с длиной волны 492 нм;
7. Полистироловые планшеты для ИФР;
8. Пипетки автоматические переменного объема: 20, 200, 500 мкл;
9. Хроматографические колонки;
10. Коллектор для сбора фракций;
11. Ультразвуковой дезинтегратор MSE 100.
Реактивы:
1. 0,9%-ный раствор хлорида натрия;
2. 0,01 М фосфатно-солевой буфер, рН 7,2-7,4 (ФСБ);
3. 0,01 М карбонатно-бикарбонатный буфер, рН 9,6;
4. 0,5 М цитратный буфер, рН 4,7-5,0;
5. Бычий сывороточный альбумин (БСА);
6. Ортофенилендиамин;
7. Твин 20, 40;
8. Перекись водорода (50%-ный водный раствор) стабилизированная;
9. Водный раствор концентрированной серной кислоты в соотношении 1 : 1.
1. Описание процесса работы.
1.1. Получение протосколексов С. tenuicollis, приготовление экстракта, определение белка.
1.2. Получение положительной эхинококкозной сыворотки.
1.3. Получение нормальной сыворотки (отрицательный контроль).
1.4. Приготовление буферных растворов, конъюгата, субстрата.
1.5. Контроль активности положительной и отрицательной сыворотки.
1.6. Проведение гель-фильтрации экстракта из протосколексов С. tenuicollis, отбор диагностически эффективных белковых фракций при лар-вальном эхинококкозе.
1.7. Получение диагностического антигенного препарата, контроль его активности в ИФР при ларвальном эхинококкозе, определение молекулярной массы.
1.8. Производственные отходы, методы их уничтожения и обеззараживания.
1.1. Получение протосколексов С. 1епы1соШ8, приготовление экстракта,
определение белка
Для приготовления диагностического антигена при ларвальном эхинококкозе используют протосколексы, выделенные из тенуикольных пузырей.
Тенуикольные пузыри получают от убойных естественно инвазирован-ных тенуикольными цистицерками животных. Накопленный биоматериал из протосколексов С. tenuicollis промывают стерильным физиологическим раствором, измельчают ножницами и готовят экстракт.
Подготовленный гельминтологический материал растирают в ступке, помещенной в посуду со льдом, в полученную массу добавляют фосфатный буферный раствор рН 7,2-7,4 в соотношении 1 : 5 и озвучивают 10 мин на ультразвуковом дезинтеграторе MSE 100 при амплитуде 8 мкм и мощности генератора 80 Кгц. Полученную гомогенную суспензию оставляют на ночь в холодильнике (4 оС), а затем центрифугируют в течение 45 мин. при 12000 об/мин на ультрацентрифуге с охлаждением. Надосадочную жидкость (экстракт) после определения в нем белка на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 280 нм по калибровочной кривой на основании бычьего сывороточного альбумина (фракция 5) по методу Layne E. (1957) используют в дальнейшей работе.
1.2. Получение положительной эхинококкозной сыворотки
Положительную эхинококкозную сыворотку получают от естественно инвазированных ларвальными эхинококками животных при убое.
Полученную после обескровливания туш кровь собирают в стерильную стеклянную посуду, оставляют на 1 ч при 37 оС, затем переносят в холодильник на 16-18 ч при температуре 2-10 оС, стерильно отсасывают образовавшуюся сыворотку, центрифугируют ее при 2000 об/мин в течение 15-20 мин, осадок эритроцитов удаляют. Сыворотку проверяют на активность в ИФР.
Положительно реагирующие с эхинококковым антигеном сыворотки, удовлетворяющие требованиям контроля, в стерильных условиях разливают по флаконам, этикетируют и хранят до использования при - 20 оС.
1.3. Получение нормальной сыворотки (отрицательный контроль)
В качестве нормальной сыворотки можно использовать сыворотку крови, полученную от животных в условиях мясокомбинатов или убойных пунктов (см. пункт 1.2). Стерильно полученную сыворотку предварительно проверяют в ИФР с эхинококковым антигеном. Отрицательно реагирующие сыворотки расфасовывают по флаконам, этикетируют и хранят при - 20 оС.
Второй способ получения нормальной сыворотки заключается в том, что кровь берут от животных в хозяйствах, благополучных по инфекционным болезням и гельминтозоонозам (эхинококкоз, трихинеллез). Аналогичным образом (см. пункт1.2) кровь обрабатывают и полученную сыворотку после проверки в ИФР расфасовывают, этикетируют и хранят при - 20 оС.
1.4. Приготовление буферных растворов, конъюгата и субстрата
Карбонатно-бикарбонатный буфер (рН 9,6): в 1 л дистиллированной воды растворяют 1,59 г Na2CO3, 2,93 г NaHCO3.
Фосфатно-солевой буфер (0,01М, рН 7,2): 8,5 г хлорида натрия (NaCl), 1, 15 г двузамещенного фосфорнокислого натрия (NaH2PO4), 0,2 г хлорида калия и 0,2 г однозамещенного фосфорнокислого натрия (Na2PO4) растворяют в 1 л дистиллированной воды и добавляют 0,5 мл твина-20 или твина-40.
Цитратный буфер (0,05 М, рН 4,5-5,0): раствор А - при молекулярной массе 294,1 необходимо 14,7 г цитрата натрия растворить в 1 л дистиллированной воды; раствор Б - 7,2 г лимонной кислоты растворяют в 0,5 л дистиллированной воды. Рабочий буфер готовят смешиванием 500 мл раствора А и 180 мл раствора Б (рН 4,7-5,0).
Конъюгат представляет собой глобулиновую фракцию, выделенную из антисыворотки, полученной иммунизацией животных-продуцентов глобулинами сыворотки соответствующего вида животного, меченную пероксидазой. Конъюгат выпускается предприятием по производству бактериальных препаратов научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи. Каждую партию конъюгата перед употреблением необходимо титровать для подбора оптимального разведения.
Приготовление субстратной смеси: 10 мг ортофенилендиамина растворяют в 20 мл цитратного буфера (рН 4,7-5,0). Перед внесением субстрата в лунки к нему добавляют 10 мкл стабилизированной перекиси водорода.
1.5. Контроль активности положительной и отрицательной сыворотки
Определение активности положительной сыворотки осуществляют с помощью ИФР. Испытуемые сыворотки разводят в соотношении от 1 : 20 до 1 : 1600.
Постановку и учет реакции проводят в соответствии с «Наставлением по применению ИФР для диагностики эхинококкоза свиней». Сыворотку считают активной, если она дает положительный ответ с эхинококковым антигеном в минимальном диагностическом титре 1 : 100 и выше.
Контроль нормальной сыворотки также осуществляют в ИФР с эхинококковым антигеном. Сыворотка считается нормальной и может использоваться в качестве отрицательного контроля, если она реагирует с антигеном в титре не выше 1 : 40. Подобранные положительные и отрицательные контрольные сыворотки используют для отбора диагностически эффективных белковых фракций.
1.6. Проведение гель-фильтрации экстракта из протосколексов C. tenuicollis, отбор диагностически эффективных белковых фракций при
ларвальном эхинококкозе
Разделение экстракта протосколексов C. tenuicollis проводят колоночной хроматографией на носителе TSK-Gel HW-50. Колонки диаметром 26 мм, высота столба геля - 1 м, объем наносимого образца - 10 мл (количество белка - 30 мг), объем каждой фракции - 5 мл.
Элюирование осуществляют фосфатно-солевым буфером рН 7,2, скорость протока буфера 10 мл/ч. Регистрацию проводят на Увикорде (LKB) при 280 нм, сбор фракций в коллектор Мультирак. После окончания разделения проводят отбор диагностически эффективных белковых фракций при лар-вальном эхинококкозе. С этой целью все полученные после гель-фильтрации фракции исследуют в ИФР с выбранными положительными и отрицательными контрольными сыворотками (пункт 1.5).
При отборе используют также 2-3 сыворотки соответствующего вида животных с гетерологичной инвазией. Сыворотки доводят титрованием до диагностического титра 1 : 100 фосфатно-солевым буферным раствором с добавлением твина-20 (0,05 %) и 0,05 % бычьего сывороточного альбумина. Разведенные в диагностическом титре сыворотки вносят по 0,1 мл в сенсибилизированные исследуемыми белковыми фракциями лунки полистиролового планшета и инкубируют 60 мин при температуре 37 оС. По окончании инкубации не прореагировавшие компоненты удаляют из лунок путем 3-4-кратного промывания дистиллированной водой с 0,05 % твином-20. Оставшуюся часть воды в лунках удаляют встряхиванием планшетов, после чего в каждую лунку вносят по 0,1 мл конъюгата соответствующего вида животных, доведенного ФСБ, содержащим 0,05 % твина-20 и 0,5 % бычьего сывороточного альбумина, до оптимального разведения. Планшеты с конъюгатом также инкубируют в термостате при 37 оС в течение 45 мин, после инкубации планшеты промывают, как указано выше, и вносят в лунки по 0,1 мл субстратной смеси. Оценку реакции проводят на многоканальном фотометре Multiscan MC (Flow) при длине волны 492 нм или визуально (при отсутствии аппаратуры). Визуальную оценку проводят по интенсивности окрашивания содержимого лунок:
++ ярко положительная реакция, темно-желтое окрашивание; + положительная реакция, желтое окрашивание; +- сомнительная реакция, светло-желтое окрашивание; - отрицательная реакция, окрашивание практически отсутствует.
По результатам реакции, по разнице оптической плотности между положительными, отрицательными и сыворотками животных с гетерологичной инвазией проводят отбор белковых фракций, в состав которых входят антигенные компоненты, диагностически эффективные при ларвальном эхинококкозе.
1.7. Получение диагностического антигенного препарата, контроль его активности в ИФР при ларвальном эхинококкозе, определение молекулярной массы
Отобранные диагностически эффективные фракции объединяют и проводят контроль полученного антигенного препарата в ИФР, предварительно определив его оптимальную концентрацию методом титрования кратно двум с содержанием белка от 3 мкг/мл, используя контрольные сыворотки (см. пункты 1.2 и 1.3). В дальнейшем проводят сенсибилизацию планшета полученным антигенным препаратом в оптимальной концентрации и вносят в 6 лунок по 0,1 мл положительной эхинококкозной сыворотки в диагностическом титре 1 : 100, в 6 лунок - по 0,1 мл нормальной сыворотки и в 6 лунок -гетерологичные видовые сыворотки (по 0,1 мл в том же титре). Остальные лунки планшета заполняют сыворотками убойных животных с подтвержденным диагнозом эхинококкоза и других гельминтозов, а также клинически здоровых. Постановку и учет реакции проводят как указано выше (пункт 1.7). Испытуемый антиген считают диагностически эффективным, если с эхинококкозны-ми сыворотками в указанном разведении реакция оценивается как положительная, а с гетерологичными и нормальными сыворотками - отрицательная.
1.8. Производственные отходы, методы их уничтожения и обеззараживания
К производственным отходам технического порядка, т. е. имеющихся постоянно в более или менее значительных количествах, относятся безвредные отходы технологического порядка, не являющиеся источником патогенной для людей инвазии, не токсичные, не выделяющие ядовитых газов и паров. К этой группе относятся все виды получаемых и выбракованных при контроле препаратов, дистиллированная и водопроводная вода, используемая для отмывания планшетов. Эти отходы удаляют через канализационную сеть.
