CC BY
39
ЛАБОРАТОРНЫЙ РЕГЛАМЕНТ НА ВЫЯВЛЕНИЕ
СЫВОРОТОЧНЫХ АНТИТЕЛ ПРИ ДИРОФИЛЯРИОЗЕ АНТИГЕНОМ ИЗ СЕТАРИЙ
К.А. ХАЙДАРОВ аспирант Л.А. НАПИСАНОВА кандидат биологических наук В.К. БЕРЕЖКО доктор биологических наук
Всероссийский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина,
117218, Москва, Б. Черемушкинская, 28, тел. 499-124-56-55, e-mail: [email protected] (Одобрен секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии 25 сентября 2008 г., протокол № 3)
Дирофиляриоз - гельминтозооноз, широко распространенное заболевание, регистрируемое во многих странах мира, включая Российскую Федерацию и страны Ближнего Зарубежья.
Возбудителями заболевания являются нематоды Dirofilaria immitis (Leidy, 1856), паразитирующие в правом желудочке сердца и легочной артерии и D. repens (Railliet et Henry, 1911), локализующиеся в подкожной клетчатке.
Диагностика дирофиляриоза базируется в основном на обнаружении мик-рофилярий в крови и их идентификации. Однако при латентной форме и низкой интенсивности инвазии этот метод фактически не дает нужного эффекта, поэтому необходимо иметь на вооружении иммунодиагностические тесты.
Иммунологические методы диагностики, к числу которых относится им-муноферментная реакция (ИФР), значительно расширяют возможности прижизненной диагностики дирофиляриоза.
Для прижизненной диагностики дирофиляриоза разработан ИФР с использованием в качестве антигена фракционированного соматического экстракта половозрелых D. immitis (А.Ю. Медведев, Л.А. Написанова, Б.А. Гар-кави, 2006). Однако, учитывая трудности получения материала для приготов-ления диагностического антигена из дирофилярий, настоящий лабораторный регламент на выявление сывороточных антител к D.immitis основывается на использовании антигена - экстракта из половозрелых сетарий (Setaria labiato-papillosa или Setaria equina). Сетарии относятся к подотряду Filariata и в белковом спектре содержат антигенные компоненты, идентичные диагностическим антигенам из дирофилярий.
Оборудование
- Ступка фарфоровая с пестиком;
- магнитная мешалка;
- центрифуга лабораторная на 12 тыс. об/мин;
- спектрофотометр СФ-26 (ЛОМО);
- термостат;
- анализатор колориметрический иммуноферментный, длина волны 492
нм;
- полистироловые планшеты;
- пипетки автоматические переменного объема: 20, 200, 500 мкл.
Реактивы
- 0,9%-ный раствор хлористого натрия;
- 0,01М фосфатно-солевой буфер, pH 7,2-7,4 (ФСБ);
- 0,01М карбонатно-бикарбонатный буфер, pH 9,6;
- 0,5М цитратный буфер, pH 4,7-5,0;
- бычий сывороточный альбумин (БСА);
- ортофенилендиамин;
- твин 20, 40;
- перекись водорода (50%-ный водный раствор) стабилизированная;
- водный раствор концентрированной серной кислоты (1 : 1).
Методика приготовления экстракта из половозрелых сетарий
Свежезамороженные половозрелые сетарии, полученные от убойного крупного рогатого скота, подвергают ручной гомогенизации в фарфо-ровой ступке, многократному замораживанию и оттаиванию для получения однородной гомогенной массы.
Экстрагирование белков проводят в фосфатном буферном растворе pH 7,2-7,4 в соотношении 1 : 10 при 4 °С на магнитной мешалке в течение 24-48 ч. Полученную массу подвергают центрифугированию при частоте вращения 12000 мин-1. Надосадочную жидкость - экстракт используют в качестве антигена. Определение белка в полученном экстракте проводят на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 280 нм по калибровочной кривой на основании бычьего сывороточного альбумина (фракция 5) по методу Layne E. (1957). Приготовленный экстракт из половозрелых сетарий используют для разработки иммуноферментной диагностики дирофиляриоза.
Проведение твердофазной иммуноферментной реакции (ИФР - «ELISA»)
Постановку ИФР при дирофиляриозе проводят в непрямом варианте. Реакция основана на выявлении комплекса «антиген-антитело» при помощи вторичных антител, меченных разными ферментами, с последующим образованием легко обнаруживаемых хромогенных продуктов энзиматического превращения. ИФР обладает высокой чувствительностью, что позволяет обнаруживать антитела или антигены в исследуемых пробах в низких концентрациях. Достоинством ИФР является также возможность визуальной (по изменению цвета раствора) и инструментальной оценки результатов (по оптической плотности). Иммуноферментный анализ включает несколько этапов, каждый из которых завершается удалением из лунок полистиролового планшета продуктов реакции отмывкой дистиллированной водой с детергентом (твин 20, 40).
1. Иммобилизация антигена на поверхности полистироловых планшетов
1.1. Антиген - экстракт из половозрелых сетарий разводят комплекси-рующим карбонатно-бикарбонатным буфером pH 9,6 до оптимальной концентрации и вносят по 100 мкл в каждую лунку. Оптимальную концентрацию определяют в предварительных исследованиях различных доз антигена с использованием положительной сыворотки от зараженной дирофиляриями собаки и отрицательной контрольной сыворотки.
За оптимальную концентрацию антигена принимают ту, при которой регистрируют наибольшую разницу в окраске (при визуальной оценке) или в оптической плотности (при инструментальной оценке) между положительной и отрицательной контрольной сывороткой при отсутствии или наличии минимального фона в реакции между испытуемым антигеном и конъюгатом (антивидовые антитела, меченные пероксидазой).
Планшеты с иммобилизованным на их поверхности антигеном инкубируют в течение 45 мин при температуре +37 °С, а затем 18-20 ч при +4 °С.
По истечении этого времени планшеты отмывают дистиллированной водой, содержащей 0,05 % твина-20 (отмывочный раствор).
2. Инкубирование с образцами сывороток
2.1. Исследуемые образцы сывороток разводят 0,01 М фосфатно-солевым буфером (ФСБ) рН 7,2-7,4, содержащим 0,05 % бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,05 % твина-20 в соотношении 1 : 100 и вносят в лунки планшета в количестве 100 мкл.
2.2. Инкубирование сывороток проводят в термостате при +37 °С в течении 1 ч.
2.3. После инкубации содержимое лунок удаляют и промывают планшеты отмывочным раствором 3 раза по 5 мин (см. п. 1.3).
3. Инкубирование с антивидовыми антителами, меченными пероксидазой (конъюгатом)
3.1. Конъюгат используют в рабочем разведении, который определяют в предварительных испытаниях, используя положительную и отрицательную контрольные сыворотки и оптимальное разведение антигена. Конъюгат разбавляют ФСБ рН 7,2-7,4, содержащим 0,5 % БСА и 0,05 % твина-20, наносят в каждую лунку планшета по 100 мкл.
3.2. Инкубирование с конъюгатом проводят в термостате при +37 °С в течение 1 ч.
3.3. По окончании инкубирования с конъюгатом содержимое лунок удаляют и промывают планшетом 3 раза по 5 мин отмывочнымраствором (см. п. 1.3).
4. Проявление реакции
4.1. Готовят хромогенный субстрат, состоящий из 20 мл цитратного буфера, 10 мг ортофенилендиамина и 3,5 мкл 50%-ного водного раствора перекиси водорода. Перекись водорода добавляют в раствор непосредственно перед нанесением в лунки планшета.
4.2. Раствор субстратной смеси вносят в каждую лунку в количестве 100 мкл, планшеты помещают в темное место при комнатной температуре на 10-15 мин до проявления реакции, о которой судят по изменению цвета раствора в лунках, ориентируясь на положительный контроль.
4.3. После проявления реакцию останавливают добавлением в каждую лунку по 30 мкл останавливающего реагента, в качестве которого используют концентрированную серную кислоту, разбавленную дистиллированной водой в соотношении 1 : 1.
5. Оценка результатов реакции
Результаты реакции оценивают визуально по интенсивности окрашивания раствора в лунках в сравнении с контрольными сыворотками. Результат считают отрицательным, если окрашивание раствора отсутствует или наблюдают слабый фон, интенсивность окрашивания которого не превышает фона отрицательной контрольной сыворотки. Реакцию считают положительной, если раствор в лунках окрашен от светло-желтого до темно-желтого цвета.
Шкала визуальной оценки реакции
« + + + » цвет темно-желтый, сильноположительная;
« + + » цвет желтый, положительная;
« + » цвет светло-желтый, слабоположительная;
« - » слабый фон или его отсутствие, отрицательная.
При инструментальной оценке при длине волны 492 нм по разнице оптической плотности в сравнении с отрицательной контрольной сывороткой определяют положительно реагирующие сыворотки. Положительными считают сыворотки, превосходящие по оптической плотности отрицательный контроль на 0,1.
