CC BY
56
Методические положения
МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ ПО ДИАГНОСТИКЕ ТЕНУИ-КОЛЬНОГО ЦИСТИЦЕРКОЗА КЛЕТОЧНЫМ АНТИГЕНОМ
В.К. БЕРЕЖКО доктор биологических наук О.В. РУДНЕВА кандидат биологических наук А.А. ХАЙДАРОВА аспирант Л.А. НАПИСАНОВА кандидат биологических наук Е.И. МАЛАХОВА доктор ветеринарных наук
Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии
им. К.И. Скрябина,
117218, г. Москва, ул. Б.Черемушкинская, 28, e-mail: [email protected] (Одобрены секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии 27 сентября 2012 г., протокол № 3)
Введение
Необходимость разработки иммуноферментной диагностической тест-системы при тенуикольном цистицеркозе вызвана тем, что близкое антигенное родство возбудителя этой инвазии - Cysticercus tenuicollis с возбудителем ларвального эхинококкоза - Echinococcus granulosus - в большинстве случаев не позволяет дифференцировать эти инвазии. Имея же на вооружении имму-нодиагностические тесты при обоих гельминтозах можно по степени проявления реакции более объективно оценить зараженность животных и соответственно эпизоотическую ситуацию.
Близкое антигенное родство между C. tenuicollis и E. granulosus доказано многочисленными иммунохимическими исследованиями (Н.А. Мунтян, 1971; W. Yong, D.D. Heath, 1984; T.K. Varma et al., 1986; MD. Rickard, D.J. Jenkins, 1986; В.К. Бережко, 1994). Тем не менее, в антигенном спектре каждого паразита имеются видоспецифические комплексы, на которые на определенном этапе инвазионного процесса вырабатываются антитела, выявление которых иммунологическими реакциями дает возможность проводить дифференциальную диагностику.
Исходя из этих соображений и учитывая широкое распространение те-нуикольного цистицеркоза, была проведена работа по получению диагностического антигена из протосколексов C. tenuicollis клеточной технологией и разработке на его основе иммуноферментной диагностической тест-системы.
Диагностический антиген представляет собой комплекс иммунологиче-ски активных клеточных метаболитов (клеточный антиген), полученных путем культивирования клеток протосколексов C. tenuicollis, выделенных из тенуикольных пузырей зараженных овец.
Иммуноферментная диагностическая тест-система предназначена для проведения сероэпизоотологических исследований при тенуикольном цисти-церкозе и дифференциальной иммунодиагностике ларвального эхинококкоза.
Оборудование
Гомогенизатор стеклянный ручной; СО2-инкубатор; центрифуга лабораторная для осаждения клеток; спекторофотометр СФ-26 (ЛОМО); планшеты для культивирования клеток; центрифужные пробирки; пипетки автоматические переменного объема на 20, 200, 500 мл; полистироловые планшеты для
иммуноферментного анализа; термостат; анализатор колориметрический им-муноферментный (длина волны 492 нм).
Реактивы, оборудование
Искусственные питательные среды RPMI-1640; DMEM; Игла-МЕМ; эмбриональная сыворотка крупного рогатого скота; бычий сывороточный альбумин; ортофенилендиамин; твин 20, 40; перекись водорода (50%-ный раствор стабилизированный); серная кислота (водный раствор 1 : 1); 0,9%-ный раствор хлористого натрия; 0,01М карбонатно-бикарбонатный буфер, рН 9,6; 0,01 М фосфатно-солевой буфер, рН 7,2-7,4 (ФСБ); 0,5 М цитратный буфер, рН 4,7-5,0.
1. Описание процесса работы
Разработка иммуноферментной диагностической тест-системы включает следующие этапы:
1.1. Получение протосколексов C. tenuicollis и приготовление клеточной культуры.
1.2. Культивирование клеток протосколексов C. tenuicollis в искусственной питательной среде.
1.3. Получение клеточных метаболитов - клеточных антигенов.
1.4. Получение положительной контрольной сыворотки.
1.5. Получение нормальной сыворотки (отрицательный контроль).
1.6. Приготовление буферных растворов, конъюгата, субстрата.
1.7. Контроль диагностической активности «клеточного» антигена про-тосколексов C. tenuicollis.
1.8. Разработка твердофазной иммуноферментной реакции (ИФР «ELISA») при тенуикольном цистицеркозе с «клеточным» антигеном протосколексов C. tenuicollis.
1.8.1. Определение оптимальной концентрации «клеточного» антигена для иммобилизации на полистироловые планшеты.
1.8.2. Определение диагностического титра сывороток.
1.8.3. Инкубирование с образцами исследуемых сывороток.
1.8.4. Инкубирование с антивидовыми антителами, меченными пере-ксидазой (конъюгат).
1.8.5. Проявление и оценка результатов реакции.
1.8.6. Оценка диагностической эффективности иммуноферментной тест-системы при тенуикольном цистицеркозе.
1.9. Санитарные правила работы с исходным материалом, производственные отходы, методы их уничтожения и обеззараживания.
1.1. Получение протосколексов C. tenuicollis и приготовление клеточной
культуры
Для приготовления диагностического клеточного антигена используют протосколексы C. tenuicollis, выделенные из тенуикольных пузырей.
Тенуикольные пузыри получают от убойных естественно инвазирован-ных тенуикольными цистицерками животных. Накопленный биоматериал из протосколексов C. tenuicollis промывают не менее 3-5 раз стерильным физиологическим раствором с антибиотиками из расчета 2000 ЕД/мл пенициллина и 1 мг/мл стрептомицина. Отмытый материал подвергают измельчению в ручном стеклянном гомогенизаторе с добавлением 0,5-1,0 мл стерильного раствора Хэнкса до получения однородной массы или 0,25%-ного раствора трипсина. По окончании процедуры гомогенизации полученную массу пропускают через мельничный газ с диаметром ячеек до 1 мм для освобождения от крупных кусочков. В полученную массу добавляют 1-2 мл стерильного физраствора, клетки осаждают центрифугированием при 1000-1200 об/мин в течение 7-10 мин. Осадок ресуспендируют и промывают 3-5 раз, определяют
жизнеспособность клеток в камере Горяева после окрашивания 0,4%-ным раствором трипанового синего при увеличении микроскопа 20 х 10 общепринятым методом.
1.2. Культивирование клеток протосколексов C. tenuicollis в искусственной питательной среде
Полученную суспензию клеток протосколексов C. tenuicollis перед культивированием промывают не менее 5-7 раз стерильным физиологическим раствором посредством центрифугирования при 1000-1200 об/мин в течение 10 мин, доводят концентрацию клеток в суспензии до 600-800 тыс./мл и вносят в ростовые среды, основу которых составляют синтетические питательные среды такие, как RPMI-1640; DMEM или Игла-МЕМ. Ростовые среды представляют собой смесь синтетической питательной среды, 5-7 % эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 2 мл/100 мл среды альфа-глутамина и 8 г/100 мл гентамицина. Клеточную культуру помещают в СО2-инкубатор для культвирования при температуре 37 °С, влажности 70 % и содержания СО2 - 5 %. На 7-10-е сутки культивирования при оптимально подобранных условиях, как правило, регистрируют получение монослоя клеток в культуре.
1.3. Получение клеточных метаболитов - «клеточных» антигенов
В процессе культивирования клеток протосколексов C. tenuicollis с периодичностью 7-10 сут проводят отбор клеточных метаболитов и их проверку ИФР с использованием положительных и отрицательных контрольных сывороток для определения наличия в них антигеноактивных компонентов C. tenuicollis.
Серии клеточных метаболитов, содержащих антигеноактивные диагностически эффективные белковые компоненты, разливают по флаконам и хранят при - 20 °С и используют для разработки на их основе иммунофермент-ной диагностической тест-системы при тенуикольном цистицеркозе.
1.4. Получение положительной контрольной сыворотки
Положительную контрольную сыворотку, представляющую собой сыворотку естественно инвазированных C. tenuicollis овец, получают при убое.
Кровь собирают в стерильную стеклянную посуду в процессе полного обескровливания туш, оставляют на 1 ч при 37 °С, затем переносят в холодильник (4-6 °С) на 16-18 ч, стерильно отсасывают образовавшуюся сыворотку и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15-20 мин, осадок эритроцитов удаляют.
Сыворотку проверяют на наличие антител к антигенам C. tenuicollis им-мунопреципитационным тестом и на активность в ИФР.
Для определения активности положительной контрольной сыворотки ее разводят в соотношении 1 : 20 до 1 : 1600 и исследуют ИФР с антигеном C. tenuicollis. Сыворотку считают активной, если она дает положительный ответ в минимальном диагностическом титре 1 : 100 и выше.
Положительно реагирующие с антигеном C. tenuicollis сыворотки, удовлетворяющие требованиям контроля, в стерильных условиях разливают по ампулам в объеме 1 мл, замораживают и хранят при - 20 °С. Сыворотку эти-кетируют.
1.5. Получение нормальной сыворотки (отрицательный контроль)
В качестве нормальной сыворотки используют сыворотки крови, полученные от убойных овец, при вскрытии которых не обнаружены тенуиколь-ные и эхинококковые пузыри, и после проверки в ИФР антитела к антигенам C. tenuicollis и E. granulosus не регистрировали.
Сыворотку считают нормальной и используют в дальнейшем как отрицательный контроль, если с антигеном C. tenuicollis она дает положительную реакцию не выше титра 1 : 40.
Такие сыворотки расфасовывают по флаконам, этикетируют и хранят при - 20 °С.
1.6. Приготовление буферных растворов, конъюгата и субстрата
Карбонатно-бикарбонатный буфер (0,01 М; рН 9,6) - в 1 л дистиллированной воды растворяют 1,06 г углекислого натрия (Na2CO3) и 1,95 г натрия двууглекислого (NaHCO3).
Фосфатно-солевой буфер (0,01 М; рН 7,2) - 8,5 г хлористого натрия (NaCl); 1,42 г двузамещенного фосфорнокислого натрия (Na2HPO4); 0,2 г хлористого калия (KCl) и 0,2 г однозамещенного фосфорнокислого натрия (NaH2PO4) растворяют в 1 л дистиллированной воды, добавляют 0,5 мл тви-на-20 или твина-40.
Цитратный буфер (0,05 М; рН 4,7-5,0) - готовят растворы А и Б.
Раствор А. При молекулярной массе цитрата натрия, равной 294,1, необходимо 14,7 г растворяют в 1 л дистиллированной воды.
Раствор Б. 7,2 г лимонной кислоты растворяют в 0,5 л дистиллированной воды.
Рабочий буферный раствор готовят смешиванием 500 мл раствора А и 180 мл раствора Б (рН 4,7-5,0)
Конъюгат представляет собой глобулиновую фракцию, выделенную из антисыворотки, полученной иммунизацией животных-продуцентов глобулинами сыворотки соответствующего вида животного, меченную пероксидазой. Каждую партию конъюгата перед употреблением необходимо титровать для подбора оптимального разведения.
Приготовление субстратной смеси: 10 мг ортофенилендиамина растворяют в 20 мл цитратного буфера. Перед внесением субстрата в лунки полистиролового планшета к нему добавляют 10 мл стабилизированной перекиси водорода.
1.7. Контроль диагностической активности «клеточного» антигена протосколексов C. tenuicollis
Активность «клеточного» антигена определяют в ИФР с использованием 2-3 положительных сывороток (животных, зараженных C. tenuicollis), 2-3 нормальных и 2-3 сывороток животных с гетерологичной инвазией. Сыворотки доводят титрованием фосфатно-солевым буфером с твином-20 с добавлением 0,05%-ного бычьего сывороточного альбумина до диагностического титра 1 : 100. Разведенные в диагностическом титре сыворотки вносят по 0,1 мл в каждую лунку, предварительно сенсибилизированную антигеном и инкубируют 60 мин при температуре 37 °С. По окончании инкубации не прореагировавшие компоненты удаляют из лунок путем 3-кратного промывания дистиллированной водой с 0,05%-ным твином-20. Оставшуюся часть воды в лунках удаляют встряхиванием планшетов. В каждую лунку вносят по 0,1 мл конъюгата, доведенного фосфатно-солевым буфером с 0,5%-ным альбумином до нужного титра. Планшеты с конъюгатом инкубируют 60 мин при 37 °С, после инкубации планшеты промывают как указано выше и вносят в лунки по 0,1 мл субстратной смеси.
Оценку реакции проводят спектрофотометрически. По результатам реакции определяют наличие в испытуемом антигене диагностически активных компонентов, способных выявлять антипаразитарные антитела в сыворотке зараженных животных. Антиген считают диагностически активным, если с положительными контрольными сыворотками в разведении 1 : 100 и выше получен положительный результат, а с нормальными и гетерологичными в этом же разведении - отрицательный.
1.8. Разрабока твердофазной иммуноферментной реакции (ИФР -«ELISA») при тенуикольном цистицеркозе с «клеточным» антигеном
протосколексов C. tenuicollis 1.8.1. Определение оптимальной концентрации «клеточного» антигена для иммобилизации на полистироловые
планшеты
Оптимальную концентрацию антигена определяют путем внесения в лунки планшета «клеточного» антигена протосколексов C. tenuicollis от не-разведенного до разведения 1 : 64 при кратности разведения равной двум. Для разведения используют комплексирующий буфер (карбонатно-бикарбо-натный, рН 9,6; 0,01 М). Каждое разведение антигена проверяют с положительной сывороткой от естественно инвазированного C. tenuicollis животного и нормальной сывороткой (отрицательный контроль) и напрямую с конъюга-том без сыворотки.
Оптимальным считают такое разведение антигена, при котором регистрируют максимальную разницу в оптической плотности между положительным и отрицательным контрольными сыворотками и минимальную фоновую реакцию с конъюгатом (антивидовые антитела, меченные пероксидазой) без сыворотки.
В подобранном оптимальном разведении антигена определяют содержание белка. Используемый нами «клеточный» антиген протосколексов C. tenuicollis показал наилучшие диагностические качества в разведении 1 : 4 (концентрация белка 40 мкг). Планшеты с иммобилизованным на их поверхности антигеном в оптимальной концентрации инкубируют в течение 30 мин при температуре 37 °С, а затем 18-20 ч при 4 °С.
По истечении этого времени планшеты отмывают трехкратно с интервалом 5 мин дистиллированной водой, содержащей 0,05% твина-20 (отмывоч-ный раствор). Оставшуюся в лунках часть воды удаляют встряхиванием планшетов.
1.8.2. Определение диагностического титра сывороток
Для определения диагностического титра сывороток проводят сенсибилизацию полистироловых планшетов «клеточным» антигеном протосколек-сов C. tenuicollis в оптимально подобранном разведении и исследуют в ИФР не менее 15-20 сывороток от зараженных тенуикольными цистицерками животных с разным уровнем антител, а также нормальные сыворотки от незара-женных животных.
Сыворотки титруют кратно двум от 1 : 20 до 1 : 800 фосфатно-солевым буфером (ФСБ) рН 7,2-7,4 с 0,05 % бычьего сывороточного альбумина и 0,05 % твина-20. По результатам реакции (показатели оптической плотности) определяют диагностический титр, который в нашем случае составил 1 : 100.
1.8.3. Инкубирование с образцами исследуемых сывороток
Исследуемые образцы сывороток разводят ФСБ рН 7,2-7,4 с 0,05% тви-на-20 и 0,05 % бычьего сывороточного альбумина в соотношении 1 : 100 и вносят в лунки планшета, сенсибилизированного «клеточным» антигеном протосколексов C. tenuicollis в оптимальной концентрации в количестве 100 мкл.
Инкубирование сывороток проводят в термостате при 37°С в течение 60 минут. После инкубации содержимое лунок удаляют и промывают планшеты отмывочным раствором 3 раза по 5 минут (см. пункт 1.8.1.).
1.8.4. Инкубирование с антивидовыми антителами, мече нными пе р о кс ид азо й (ко нъ ю гат)
Конъюгат используют в рабочем разведении, который определяют в предварительных испытаниях, используя положительную и отрицательную контрольные сыворотки и оптимальное разведение антигена. Конъюгат раз-
бавляют ФСБ рН 7,2-7,4, содержащим 0,5 % бычьего сывороточного альбумина и 0,05 % твина-20 до разведения 1 : 6000 и вносят в каждую лунку планшета по 100 мкл.
Инкубирование с конъюгатом проводят в термостате при температуре 37 °С в течение 45 мин. По окончании инкубирования с конъюгатом содержимое лунок удаляют и промывают планшет 3 раза по 5 мин (см. пункт 1.8.1.).
1.8.5. Проявление и оценка результатов реакции
Для проявления реакции готовят хромогенный субстрат, включающий 20 мл цитратного буфера, 10 мг ортофенилендиамина и 3,5 мкл 50%-ного водного раствора перекиси водорода. Перекись водорода добавляют в раствор непосредственно перед нанесением в лунки планшета.
Раствор субстратной смеси вносят в лунки планшета в количестве 100 мкл, планшет помещают в темное место на 10-15 мин при комнатной температуре до проявления реакции, о которой судят по изменению цвета раствора в лунках, ориентируясь на положительный контроль.
После проявления реакцию останавливают добавлением в каждую лунку по 30 мкл стоп-реагента, в качестве которого используют концентрированную серную кислоту (H2SO4), разбавленную дистиллированной водой в соотношении 1 : 1.
Результаты реакции оценивают визуально по интенсивности окрашивания раствора в лунках в сравнении с контрольными сыворотками. Результат считают отрицательным, если окрашивание раствора отсутствует или наблюдается слабый фон, по интенсивности не превышающий фон с отрицательной контрольной сывороткой. Реакцию считают положительной, если раствор в лунках окрашен от светло-желтого до темно-желтого цвета.
Шкала визуальной оценки реакции «+++» Цвет темно-желтый - сильноположительная
«++» Цвет желтый - положительная
«+» Цвет светло-желтый - слабоположительная
«-» Слабый фон или его отсутствие - отрицательная
При инструментальной оценке при длине волны 492 нм по разнице оптической плотности в сравнении с отрицательной контрольной сывороткой определяют положительно реагирующие сыворотки.
Положительными считают сыворотки, превосходящие по оптической плотности отрицательный контроль на 0,1.
1.8.6. Оценка диагностической эффективности иммуно-фе рме нтной те ст-систе мы пр и те нуико льно м цис тице рк озе
Для проверки диагностической эффективности иммуноферментной тест-системы при тенуикольном цистицеркозе проводят сенсибилизацию планшета «клеточным» антигеном протосколексов C. tenuicollis в оптимальной концентрации (40 мкг белка) и вносят в 4 лунки по 0,1 мл положительной сыворотки в диагностическом титре 1 : 100, в 4 лунки по 0,1 мл нормальной сыворотки (отрицательный контроль) и в 4 лунки - сыворотки с гетерологичной инвазией по 0,1 мл в том же титре. Остальные лунки планшета заполняют сыворотками убойных животных с подтвержденным диагнозом тенуикольно-го цистицеркоза и других гельминтозов, а также клинически здоровых. Постановку и учет результатов реакции проводят, как указано в пункте 1.8. Им-муноферментный тест считают диагностически эффективным, если с сыворотками животных, инвазированных тенуикольными цистицерками, реакция
положительная, а с гетерологичными и нормальными сыворотками в большинстве случаев - отрицательная. Возможен слабоположительный результат (ложноположительная реакция) с сыворотками животных, больных эхино-коккозом и другими ларвальными цестодозами, что влияет на чувствительность и специфичность реакции. Чувствительность теста была в пределах 79,3-81,7 %, специфичность 73,5-77,6 %.
1.9. Санитарные правила работы с исходным материалом, производственные отходы, методы их уничтожения и обеззараживания
Работу по получению «клеточного» антигена из протосколексов C. tenuicollis необходимо проводить в оборудованном боксовом помещении. С паразитарным материалом должны работать лица, хорошо владеющие техникой работы, предварительно получившие специальный инструктаж по методам обработки гельминтозного материала.
Работа в условиях повышенной влажности в резиновых перчатках. При работе с центрифугами необходимо тщательно уравновесить содержимое центрифужных стаканов, соблюдать осторожность при разгоне и торможении ротора.
Производственные безвредные отходы технологического порядка, не являющиеся источником патогенной для людей инвазии, не токсичные, не выделяющие ядовитых газов и паров, к которым относятся все виды выбракованных при контроле препаратов, дистиллированная и водопроводная вода, используемая для отмывания планшетов, удаляются через канализационную систему.
