CC BY
54
УДК 577.18 615.33
СТРУКТУРА И СТАБИЛЬНОСТЬ КОМПЛЕКСОВ ФТОРХИНОЛОНОВ С ГИДРОКСИПРОПИЛ-Р-ЦИКЛОДЕКСТРИНОМ ДЛЯ СОЗДАНИЯ НОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ И.М. Дейген1, А.М. Егоров1'2, Е.В. Кудряшова1
(1 кафедра энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова; Российская медицинская академия последипломного образования Министерства здравоохранения Российской Федерации (РМАПО) e-mail: Helena [email protected])
Исследованы физико-химические свойства, структура и стабильность комплексов фторхинолонов (левофлоксацина, офлоксацина и моксифлоксацина с 2-гидроксипропил-Р-циклодекстрином (ГПЦД)) методом ИК-спектроскопии. Определены оптимальные условия образования комплексов (рН 4, избыток ГПЦД (2:1)). Методом УФ-спектроскопии продемонстрировано, что комплексообразование с ГПЦД позволяет повысить растворимость фторхинолонов в 2-5 раз в зависимости от препарата. Полученные результаты открывают перспективы разработки новых лекарственных форм фторхинолонов.
Ключевые слова: фторхинолоны, циклодекстрин, комплексы «гость-хозяин», ИК-спектрокопия.
Список сокращений: фтохинолоны - ФХ, левофлоксацин - ЛФ, офлоксацин - ОФ, мок-сифлоксацин - МФ, циклодекстрины - ЦД, 2-гидроксипропил-Р-циклодекстрин - ГПЦД.
Фторхинолоны - высокоэффективные антибактериальные препараты, нашедшие широкое применение в терапии инфекций, в том числе резистентных форм туберкулеза [1-5]. При лечении острых резистентных форм туберкулеза требуется длительная медикаментозная терапия с многократным применением высоких доз. Один из наиболее перспективных методов создания новых лекарственных форм пролонгированного действия - применение сверхкритических флюидных технологий (СКФ) для проведения инкапсуляции лекарственных компонентов с использованием биодеградируемых полимеров, в первую очередь, полимолочной кислоты с применением добавок, необходимых для оптимизации биофармацевтических свойств микрочастиц, получаемых методом СКФ. В качестве таких добавок наиболее перспективными представляются циклодекстрины - природные циклические олиго-сахариды с варьируемым диаметром пор, а также их производные [6]. ЦД широко применяются в фармацевтике в качестве комплексообразующих агентов, которые повышают растворимость лекарственных субстанций в воде, а также увеличивают их биодоступность и стабильность [7]. Благодаря наличию гидрофобной полости и полярной поверхности ЦД могут образовывать в водных растворах комплексы включения «гость-хозяин» с лекарственными субстанциями, которые представляют
собой амфифильные органические молекулы. В том случае, когда «гость» обладает положительным или отрицательным зарядом, прочность комплекса ЦД-субстрат уменьшается в 2-30 раз по сравнению с нейтральной формой того же лиганда [8-10].
Цель представленной работы - исследование физико-химических свойств комплексов ряда клинически значимых фторхинолонов: ОФ, ЛФ и МФ с 2-гидроксипропил^-циклодекстрином, который разрешен FDA для использования в фармацевтике [11]. Для решения поставленной задачи нами применен метод ИК-спектроскопии Фурье как удобный и высокоинформативный метод анализа структуры и свойств надмолекулярных ансамблей [12].
Экспериментальная часть
Материалы
В работе использовали 2-гидроксипропил-ß-циклодекстрин («Sigma», США), ЛФ и ОФ («Zhejiang Kangyu Pharm Co Ltd.», Китай), МФ («Sansh Biotech Pvt Ltd.», Индия).
Методы
Получение комплексов ФХ-ГПЦД. Раствор ФХ (2 мг/мл, pH 2-7) смешивали с раствором ГПЦД (pH 2-7). Концентрация ФХ во всех образцах составляла 1 мг/мл. Мольный избыток ГПЦД относительно ФХ варьировали в интерва-
ле 0,25-10,00. Комплексы инкубировали в течение 15 мин при перемешивании при комнатной температуре.
Исследование высвобождения компонентов комплекса. Диализ исследуемых комплексов ЛФ-ГПЦД проводили с использованием диализной мембраны (Serva, М¥ cut-off 3 кДа). Систему инкубировали в течение 3 ч при температуре 37°С, отбирая аликвоты по 30 мкл для регистрации ИК-спектров.
Исследование растворимости комплексов. К 3 мг сухого МФ, ЛФ, ОФ добавляли ГПЦД из расчета 1:1, М/М. Смеси растворяли в 200 мкл соляной кислоты (pH 4). В качестве контроля готовили аналогичные суспензии ФХ без ГПЦД. Образцы инкубировали при перемешивании при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего проводили центрифугирование 10 мин при 8000 rpm. Для регистрации УФ-спектров ФХ-содержащих растворов отбирали по 5 мкл супернатанта и разбавляли соляной кислотой (pH 4).
Волновое число, см"1
А
0,004 0,003 0,002 0,001 0,000
ИК-спектроскопия. ИК-спектры регистрировали на ИК-спектрометре Фурье «Tensor 27» («Bruker», Германия), оснащенного термостатом «Huber» (США) при 22°С [12].
Обсуждение результатов
ИК-спектры фторхинолонов. В работе изучали спектральные свойства трех лекарственных препаратов - МФ, ОФ и его левовращающего изомера (ЛФ). Молекулы ФХ содержат множество функциональных групп, способных поглощать в ИК-области: карбоксильную группу, карбонильную группу хинолона, ароматическую хиноло-новую группировку, пиперазольное кольцо и ряд других групп. ИК-спектры растворов ЛФ и ОФ обладают сходной структурой, что согласуется с их идентичным строением (рис. 1, А).
Анализ ИК-спектров, полученных при разных значениях рН (рис. 1, Б, В), позволил провести соотнесение основных полос поглощения ЛФ с использованием литературных данных
А
Волновое число, см"1
А
Волновое число, см"1 Волновое число, см"1
Рис. 1. ИК-спектры: А - ОФ (1) и ЛФ (2) (5 мг/мл, pH 4); Б - МФ (1 мг/мл, pH 4); В, Г - ЛФ при pH 7 (1), рН 4 (2),
рН 2 (3), область поглощения 1650-1450 см-1
Основные полосы поглощения в ИК-спектре левофлоксацина
Группа Положение пика, см-1 Группа Положение пика, см-1
СО в СООН 1730-1720 С-Ы 1390-1350, 1339, 1208
СО 1630-1620 С-0 в СООН 1280-1270
С=С хинолон 1606-1549 СОС 1100
СОО-(только в рН 4,7) 1580 СБ 1050-1040
С-С ароматического остова 1500-1400 СЫ, СН пиперазол 979
[13-16]. Наиболее интенсивные полосы поглощения в ИК-спектрах ЛФ и ОФ (полосы 1456 и 979 см-1) относятся к ароматической структуре хинолона и пиперазольной группе соответственно, которые являются аналитически значимыми и могут быть использованы для определения содержания ЛФ и ОФ в системе. Полное соотнесение полос поглощения в спектрах левофлоксацина и офлоксацина представлено в таблице. В ИК-спектре МФ (рис. 1, Б) присутствуют наиболее интенсивные полосы поглощения: 1445 см 1 (соответствует колебаниям связи С=С в ароматической структуре хинолона) и 1045 см-1 (соответствует колебаниям связи С-Б). Следует отметить сходство спектров левофлоксацина и моксифлоксаци-на, однако в спектре последнего отсутствуют полосы 1100 и 979 см-1 ввиду различий в структуре молекул.
Комплексообразование ФХ с ГПЦД при рН 4
приводит к увеличению интенсивности основных полос поглощения ЛФ. На рис. 2, А приведены спектры несвязанного ЛФ и ЛФ-ГПЦД (1:10) при рН 4. Происходят изменения в области 1620-1520 см-1, соответствующей поглощению С=О-группы и ароматической структуры хи-нолона. Интересно отметить, что полоса поглощения 1270 см-1, соответствующая колебанию связи С-О карбоксилат-иона, претерпевает небольшое смещение (1272-1274 см-1), и происходит заметное повышение интенсивности пика. Изменения в спектрах при рН 4 наблюдаются и в области колебаний связей С-О-С и С-Е Наблюдаемые изменения указывают на смену микроокружения вышеуказанных функциональных групп за счет комплек-сообразования. Изменений в структуре полос пи-перазольного кольца, включая связь С-Ы, которая соединяет пиперазольное кольцо с ароматической структурой хинолона, практически не наблюдает-
ся Это указывает на отсутствие участия данных групп в комплексообразовании, что подтверждается квантово-химическими расчетами [17].
Комплексообразование МФ с ГПЦД при рН 4 приводит к аналогичным изменениям в спектре (рис. 2, В). В первую очередь следует отметить изменение в области поглощения карбонильной и карбоксильной групп (1720-1600 см-1), а также в области поглощения С=С-связей ароматической структуры МФ (1455см-1). Полосы поглощения связи С-Ы (ароматический третичный амин) (1360 см-1) и связи С-Б (1050 см-1) также претерпевают изменения. Указанные изменения в ИК-спектрах МФ усиливаются при увеличении содержания ГПЦД в системе.
Таким образом, комплексообразование происходит за счет взаимодействия ароматической части молекулы ФХ с ЦД. Полученные результаты согласуются с литературными данными [18]. Применение комплексов как лекарственных форм требует решения вопроса о их стабильности при смене рН, поскольку переход от кислых растворов к физиологическим щелочным может привести к диссоциации комплекса.
Устойчивость комплекса ЛФ-ГПЦД при переходе от кислых растворов (рН 4) к щелочным средам (рН 7) изучена на примере комплекса ЛФ-ГПЦД. На рис. 2, Б приведен ИК-спектр левофлок-сацина в комплексе с ГПЦД при рН 7. При смене рН системы с 4 до 7 в спектре эквимолярного комплекса ЛФ-ГПЦД обнаруживается ряд изменений (рис. 2, Г). В первую очередь различия в спектрах проявляются в повышении интенсивности полос поглощения, задействованных в комплексообра-зовании, в меньшей степени наблюдаются изменения в структуре полос. Это свидетельствует более о влиянии рН на спектр ЛФ, находящегося в комплексе, нежели о диссоциации комплекса.
0,005 0,004 0,003 0,002
0,001 0,000
1800 1600 1400 1200 1000
Волновое число, см"1
Волновое число, см"1
0,000
1800 1600 1400 1200 1000
Волновое число, см"1
Волновое число, см"1
0,001
Рис. 2. ИК-спектры: ЛФ (7), комплекс ЛФ-ГПЦД (1:10) (2) при рН 4 (А) и при рН 7 (Б); В: ИК-спектры комплекса МФ-ГПЦД (1:1) (1) и (1:10) (2) в сравнении со спектром несвязанного МФ (3) при pH 4; Г: ИК-спектры комплекса ЛФ-ГПЦД (1:1) в pH 4 (1); после изменения pH от 4 до 7 (2), несвязанного в комплекс ЛФ при pH 7 (3)
Более того, сравнивая спектр комплекса ЛФ-ГПЦД при рН 7 со спектром несвязанного ЛФ при том же рН 7, нельзя не отметить серьезную разницу в спектрах, свидетельствующую о сохранении ЛФ в связанном с ГПЦД состоянии при смене рН системы (рис. 2, Г). Необходимо учесть тот факт, что образование комплекса приводит к повышению интенсивности полос поглощения ЛФ как при рН 4, так и при рН 7 (рис. 2, А, Б). Таким образом, можно заключить, что комплекс, образованный при рН 4, не диссоциирует при изменении рН среды до 7, что делает его перспективным для дальнейших исследований в целях разработки на его основе лекарственного препарата.
Исследование кинетики высвобождения ФХ из комплексов с ГПЦД. Кинетику высвобождения ЛФ из комплекса с ГПЦД, а также стехиоме-трический состав комплекса исследовали методом равновесного диализа при рН 4. Предполагается, что на первой стадии будет высвобождаться ЛФ, не включенный в комплекс с ГПЦД, а ЛФ,
связанный с ГПЦД, будет высвобождаться более медленно. Сравнение с кинетической кривой высвобождения свободного ЛФ позволит определить количество ФХ, связанного в комплекс с ГПЦД. Для слежения за накоплением препарата во внешнем растворе была использована полоса 1270 см-1 в ИК-спектре ЛФ, которая соответствует колебаниям связи С-О в карбоксильной группе. Данная полоса удалена от основной полосы циклодекстрина (1035 см-1) и малочувствительна к комплексообразованию. На рис. 3 представлены кинетические кривые высвобождения ЛФ из экви-молярного комплекса ЛФ-ГПЦД по сравнению с системой в отсутствие ГПЦД при рН 4. Из рис. 3, А следует, что комплексообразование с ГПЦД приводит к существенному изменению профиля высвобождения ЛФ. Первые 20 мин происходит высвобождение не связанного в комплекс ЛФ: кривые накопления препарата во внешнем растворе идут параллельно. Далее наблюдается существенное расхождение в профиле высвобождения ЛФ в при-
Рис. 3. Кинетические кривые высвобождения ЛФ (А) и ГПЦД (Б) из комплекса ГПЦД-ЛФ(1:1) (2 и 4) в сравнении со свободным ЛФ (А) (1) и ГПЦД (Б) (3) при рН 4, 37°С; УФ-спектры супернатантов свободных фторхинолов (1)
и в комплексе с ГПЦД (2) при рН 4; В - ЛФ; Г- МФ; Д - ОФ
сутствии ГПЦД: высвобождение оставшейся части препарата ЛФ замедлено по сравнению с контрольной системой, что связано, очевидно, с включением определенного количества ЛФ в состав комплекса с ГПЦД. Количество ЛФ, включенного в комплекс, составляет 35% от общего количества ЛФ.
Комплексообразование замедляет также и высвобождение ГПЦД, как следует из сравнения кинетических кривых высвобождения ГПЦД в отсутствие и в присутствии ЛФ (рис. 3, Б). Данный факт подтверждает существование прочного комплекса ЛФ-ГПЦД при данных условиях. По-видимому, диализ позволяет отделить компоненты комплекса, не связавшиеся на начальном этапе процесса, а далее происходит медленное высвобождение ЛФ за счет диссоциации комплекса. Состав системы ЛФ:ГПЦД = 1:2, установленный в результате анализа различия кинетических кривых высвобождения ЛФ и ГПЦД, указывает на то, что помимо стехиометрического комплекса ЛФ:ГПЦД = 1:1 в системе удерживается избыток ГПЦД, возможно, за счет образования водородных связей с ЛФ.
Влияние комплексообразования с ГПЦД на растворимость ЛФ, ОФ и МФ. При разработке лекарственных форм фторхинолонов с использованием ГПЦД в качестве носителя важным аспек-
том является влияние комплексообразования с ГПЦД на растворимость ФХ. На рис. 3, В-Д приведены УФ-спектры супернатантов, полученных в результате центрифугирования суспензии фторхи-нолонов при рН 4 в отсутствие и в присутствии ГПЦД. Наблюдаемое увеличение интенсивности УФ-спектров в присутствии ГПЦД соответствует большему количеству растворенного ФХ. В результате установлено, что комплексообразование с ГПЦД приводит к значительному увеличению растворимости всех изученных препаратов ФХ. Анализ представленных спектров показал, что растворимость ЛФ, МФ и ОФ увеличивается примерно в 5; 2 и 1,5 раза соответственно.
Таким образом, исследованы физико-химические свойства, структура и стабильность комплексов ЛФ, ОФ и МФ с ГПЦД. С применением метода ИК-спектроскопии получена информация об изменении микроокружения функциональных групп компонентов комплекса ФХ с ГПЦД. На этой основе определены сайты взаимодействия молекул в исследуемых надмолекулярных структурах. Обнаружено, что комплексы ФХ с ГПЦД эффективно образуются в кислых средах. Методом УФ-спектроскопии продемонстрировано, что комплексообразование с ГПЦД позволяет повы-
сить растворимость ФХ в 2-5 раз в зависимости перспективы разработки новых высокоэффектив-от препарата. Полученные результаты открывают ных лекарственных форм ЛФ, ОФ и МФ.
Данная работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ 15-13-00063; в работе использовалось оборудование закупленное по программе развития МГУ в 2011г.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Wolfson J.S., HooperD.C. // Clinical Microbiology Reviews. 1989. Vol. 2. P. 378
2. Willmott C.J. R., MaxwelA. // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1993. Vol. 37. P. 126.
3. Киричек Л. Т. // Клиническая фармакология. 2003. Т. 3. С. 116.
4. Падейская Е.Н., Яковлев В.П. Антимикробные препараты группы фторхинолонов в клинической практике. М., 1998.
5. Деревянко И.И. // Фарматека. 2003. Т. 1. С. 20.
6. Challa R. etal. // AAPS PharmSciTech. 2005. Vol. 6. P. 329.
7. Valentino J.S., He Q. // Toxicologic Pathology. 2008. Vol. 36. P. 30.
8. Boogaard M. Cyclodextrin-containing supramolecular structures. Ph.D.: Thesis. Groningen, 2003.
9. Saenger W. // Angewandte Chemie International Edition in English. 1980. Vol. 19. P. 344.
10. Szejtli J. Cyclodextrins and their inclusion compounds. Budapest, 1982.
11. Eifler A.C., Shad Thaxton C.S. // Biomedical Nano-technology. 2011. Vol. 726. P. 325.
12. Deygen I.M.,Kudryashova E.V.// Russian Journal of Bioorganic Chemistry. 2014. Vol. 40. P. 547.
13. Gunasekaran S., Rajalakshmi K., Kumaresan S. // Spectrochim. Acta. Part A Mol. Biomol. Spectrosc. 2013. Vol. 112. P. 351.
14. Goyne K.W., Chorover J., Kubicki J.D., Zimmerman A.R, Brantley S.L. // J. Colloid Interface Sci. 2005. Vol. 283. P. 160.
15. Pandey S., Pandey P., Tiwari G., Tiwari R., Rai A.K. // Indian J. Pharm. Sci. 2009. Vol. 71. P. 359.
16. Sahoo S., Chakraborti C.K., Mishra S.C., Naik S., Nanda U.N. // Int. J. Pharm. Sci. Res. 2011. Vol. 2. P. 268.
17. Yu L., Han B., Chen Y. // The Journal of Physical Chemistry B. 2002. Vol. 106. P. 4678.
18. Misiuk W., JozefowiczM. // Journal of Molecular Liquids. 2015. Vol. 202. P. 101.
Поступила в редакцию 01.08.15
STRUCTURE AND STABILITY OF FLUOROQUINOLONS -2-HYDROXYPROPYL-CYCLODEXTRIN, PERSPECTIVE ANTI-TUBERCULOSIS FORMULATIONS
I.M. Deygen1, A.M. Egorov12, E.V. Kudryashova1
(Division of chemical enzymology, Department of Chemistry, Lomonosov Moscow State University; Russian Academy ofpostgraduate education, Russian Ministry of health care)
The host-guest complex formation of fluoroquinolons (FQ), levofloxacin, ofloxacin and moxifloxacin with HP-P-CD was studied by spectroscopy methods. Stoichiometry and dissociation constant of the inclusion complexes were determined. The complex formation of FQ with HP-pCD was confirmed by solubility studies, UV, FT-IR spectra and equilibrium dialysis. By complex formation with HP-p-CD, the prolonged release of levofloxacin was observed in dialysis experiments. The solubility of fluoroquinolons was enhanced by two-five -fold after inclusion complex formation. The research may provide basis for the development of new drug formulations of FQ based on HP-p-CD as a nanocarrier system.
Key words: fluoroquinolons, 2-hydroxypropyl-P-cyclodextrin, guest-host complex, FTIR.
Сведения об авторах: Дейген Ирина Михайловна - аспирант химического факультета МГУ ([email protected]); Егоров Алексей Михайлович - академик РАН, глав. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, зав. кафедрой микробиологии Российской медицинской академии последипломного образования Министерства здравоохранения Российской Федерации (РМАПО) (alex.m.egorov@gmail. com); Кудряшова Елена Вадимовна - доцент кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, докт. хим. наук ([email protected]).
