CC BY
4СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЭКСТРАКТА МЯТЫ ПЕРЕЧНОЙ СУХОГО И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КОМПОЗИЦИИ НА ЕГО ОСНОВЕ И ДИПЕПТИДА
ИЗОЛЕЙЦИЛ-ТРИПТОФАН
НАВРУЗЗОДА ГАНДЖИНА ФУРКАТ
Кафедра фармацевтической и токсикологической химии ГОУ «ТГМУ им. Абуали ибни
Сино», г.Душанбе, Таджикистан
БОБИЗОДА ГУЛОМКОДИР МУКАММАЛ
Научно-исследовательский институт фундаментальной медицины при ГОУ «ТГМУ им. Абуали ибни Сино», г.Душанбе, Таджикистан
Аннотация: Показано, что для получения экстракта сухого из мяты перечной наиболее применим спирт этиловый в концентрации 70%. Экстракт был стандартизирован по показателям: описание, потеря в массе при высушивании, спирт этиловый, насыпной объем, тяжелые металлы, микробиологическая чистота, подлинность (аминокислоты, флавоноиды), количественное определение (аминокислоты, флавоноиды, гидроксикоричные кислоты). Для определения подлинности использовались качественные реакции: для аминокислот реакция с нингидрином, для флавоноидов реакция с алюминия хлоридом. Для количественного определения использовали спектрофотометрический метод: для аминокислот по поглощению при 760 нм после реакции с нингидрином, для флавоноидов - по поглощению при 410 нм после реакции с хлоридом алюминия, для гидроксикоричных кислот -по поглощению при 730 нм после реакции с реактивом Фолина-Чикольте. Композиция была практически нетоксичной и обладала иммуностимулирующими свойствами.
Ключевые слова: экстракт - мята перечная - стандартизация - аминокислоты -флавоноиды - гтдроксикоричные кислоты - токсичность_
Актуальность. В последние годы разрабатывается такое направление как создание новых препаратов на основе композиции из растительных экстрактов и синтетических препаратов, в том числе и пептидов [1, 2]. Уже была разработана композиция на основе экстрактов из мяты перечной и подорожника большого и дипептида изолейцил-триптофан [1]. Эта композиция обладала свойствами терапевтическим эффектом при лечении сахарного диабета, корректировать расстройства в иммунном ответе и кроветворении. Но у этой композиции есть один недостаток: при ее приготовлении используется только одно стандартизированное вещество - дипептид изолейцил-триптофан экстракты мяты и подорожника не стандартизированы и в них не исследованы подробно БАВ, входящие в их состав.
Из-за присутствия фенольных соединений, фитостеролов и ненасыщенных жирных кислот некоторые виды мяты обладают антиоксидантным и противораковым свойствами [35]. Выводы работы [6] предполагают, что мята является полезной при лечении болезни Альцгеймера из-за того что в ее состав входят фенолы, обеспечивающие антиоксидантную активность, ацетилхолинэстераза (АХЭ) и ингибирующей активности гистондеацетилазы (ГДАЦ). Было обнаружено [7] что в мяте содержится 45,25 мг-экв галловой кислоты на 100 г 1 сухого веса фенолов и 25,17 мг-экв кверцетина на 100 г 1 сухого веса флавоноидов в M. piperita. Согласно [6], общее содержание фенолов у мят, принадлежащих к секции Mentha, колебалось от 2,82 мг до 8 мг-экв галловой кислоты г-1 сухого веса. Лютеолин, нарингенин, апигенин, гесперитин и эриодиктиол и их гликозиды, а также розмариновая, кофейная, хлорогеновая и сальвианоловая кислоты являются основными фенольными соединениями в растения мяты [8]. Согласно Kivilompolo et al. [9] основные фенольные кислоты M. Spicata в Финляндии соствляют галловая, хлорогеновая, кофейная, ванилиновая, сиреневая, п-кумаровая, феруловая и розмариновая кислоты, а растения M. piperita из Хорватии включали
розмариновую, кофейную, галловую, сиреневую, п-гидроксибензойную, о-кумаровую и коричную кислоты [10]. Качество и количество биологически активных веществ в растениях зависят от генотипа, почвы, климатических условий, внесения удобрений и времени сбора урожая [11].
Предметом данной статьи является экстракт мяты сухой и его стандартизация.
Методом бумажной хроматографии показано, что в состав мяты входят изолейцин (0,19 мг/г), лейцин (0,18 мг/г), фенилаланин (0,12), валин (0,34), метионин (0,04), пролин (1,01), аланин (0,22), тирозин (0,06), треонин (0,09), глутамин/глутаминовая кислота (4,81), глицин (0,09), аспарагин/аспарагиновая кислота (1,28), серин (0,14) и лизин (0,1), орнитин (0,01).
В водно-этанольном экстракте из мяты были обнаружены флавоноиды. Также в водно-этанольном экстракте были обнаружены фенольные соединения.
Таким образом, сухой экстракт, получаемый из водно-этанольного, следует в первую очередь стандартизировать по содержанию аминокислот, флавоноидов и фенольных соедининий.
Материалы и методы
Определение аминокислот. Реакция с нинигидрином.
Определение флавоноидов реакцией с хлоридом алминия
Определение фенольных соединений метод Фолина-Чикольте.
Определение средней летальной дозы исследуемых комплексов осуществляли в соответствии с методиками «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (под ред. А.Н. Миронова.). Токсичность при повторном введении изучали на 40 кроликах. Композицию вводили перорально один раз в день в течение 10 дней. Наблюдение за животными осуществляли в течение 28 дней. В конце этого периода в крови животных определяли содержание гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов.
При определении хронической токсичности белым мышам первой, второй и третьей групп 0,01% водный раствор пептида вводили внутримышечно в дозах 5, 15 и 25 мл/кг, соответственно, один раз в день в течение 10 дней. Кроликам первой, второй и третьей групп 0,01% водный раствор пептида вводили в дозах 0,5, 1,5и 2 мл/кг соответственно, внутримышечно один раз в день в течение 10 дней. Животным контрольной группы вводили внутримышечно по 5 мл физиологического раствора с той же кратностью. При этом у подопытных животных учитывали следующие показатели: внешний вид и поведение, состояние шерстяного покрова и видимых слизистых оболочек, отношение к корму, подвижность, ритм и частоту дыхания, время возникновения и характер интоксикации, тяжесть, обратимость, срок гибели животных или их выздоровления. При определении хронической токсичности - в течение 30 дней, а также осуществляли контроль за подопытными животными на протяжение 60 дней после отмены препарата. Общий период наблюдения составлял 90 дней.
Обсуждение результатов
На первом этапе исследования было необходимо определить какой концентрации спирт лучше всего экстрагирует вещества. Для этого был приготовлен спирт в концентрации 40, 50, 60, 70 и 95% и он использовался для экстракции, которую вели в аппарате Сокслета в течение 30 минут и потом в экстракте определяли вес экстракта. Полученные результаты приведены в таблице 1.
Таблица 1
Выход экстракта в зависимости от концентрации спирта
Концентрация спирта Выход экстракта, г
40 1,25
50 1,30
60 1,37
70 1,53
95 1,48
Как показывают полученные результаты, наибольший выход экстракта отмечается при 70%-ном спирте.
Затем высушенный экстракт растворяли в воде и в растворе определяли с помощью качественных реакций наличие аминокислот и флавоноидов. Наличие аминокислот подтверждено качественной реакцией с нингидрином: при добавлении нингидрина развивалась фиолетовая окраска. Наличие флавоноидов определялось после добавления хлорида алюминия развивалась красная окраска.
В ГФ 14 есть фармстатья на экстракты 0ФС.1.4.1.0021.15 «Экстракты», которая была положена в основу нашей разработки (табл.2).
Таблица 2
Параметры стандартизации экстракта мяты сухого
Параметр Метод определения Количественные характеристики
Описание
Потеря в массе при высушивании, % 0ФС.1.2.1.0010.15 «Потеря в массе при высушивании», ГФ 14, т.1. С.567-569 Не более 5%
Спирт этиловый 0ФС.1.2.1.0016.15 «Определение спирта этилового в лекарственных средствах», ГФ 14, т.1. С.610-614 Не более 0,5%
Тяжелые металлы Не более 0,01%
Микробиологическая чистота 0ФС.1.2.4.0002.18 «Микробиологическая чистота», ГФ 14, т.1. С.1128 • Общее число аэробных микроорганизмов - не более 105 КОЕ в 1 г • Общее число дрожжевых и плесневых грибов - не более 104 КОЕ в 1г • Энтеробактерий, устойчивых к желчи, - не более 103 КОЕ в 1 г • Отсутствие Escherichia coli в 1 г • Отсутствие бактерий рода Salmonella в 25 г
Насыпной объем ОФС «Определение насыпного объема» ОФС «Степень сыпучести порошков»
Подлинность Аминокислоты Флавоноиды Качественная реакция с нингидрином Качественная реакция с алюминия хлоридом Должна развиваться фиолетовая окраска После добавления алюминия хлорида развивается красная окраска
Количественное определение Аминокислоты Не менее 9 мг/г сухого
Спектрофотометрически вещества
Флавоноиды после реакции с нингидрином Спектрофотометрически после реакции с алюминия Не выше 25 г-экв Кв на 100 г сухого вещества
Гидроксикоричные хлоридом при 410 нм Спектрофотометрически по Не выше 45 г-экв ГК на
кислоты поглощению при 730 ни в пересчете на галловую кислоту 100 г сухого вещества
Таким образом на экстракт сухой мяты перечной была разработана нормативная документация.
Соединение с дипептидом изолейцил-триптофан позволит экстракту мяты обладать иммуномодулирующими свойствами.
Состав композиции экстракт мяты-дипептид изолейцил-триптофан 400 мг: 100 мкг на одну дозу.
Результаты проверки иммуностимулирующей активности полученной композиции следующие.
Для установления напряженности иммунитета у телят после применения коммерческой вакцины были отобраны по принципу аналогов 20 телят 30-ти дневного возраста, которых разделили на 4 группы по 5 голов в каждой. Животных первой группы не вакцинировали. Животным второй группы внутримышечно вводили вакцину в дозе 2 см3/гол, животным третьей группы дополнительно с вакциной перорально вводили композицию в дозе 0,1 мг на 100 кг живого веса по дипептиду. Телятам четвертой группы внутримышечно вводили тимогар в дозе 1 мл на 100 кг. Ревакцинировали животных через 20 дней, согласно инструкции по применению вакцины. Кровь для серологических исследований брали на 20, 60, 120 и 180 день после вакцинации.
Результаты определения напряженности иммунитета у телят после вакцинации приведены в таблице 3.
Таблица 3
Напряженность иммунитета у телят при применении
коммерческой вакцины (М±т), п=20
Группа животных Сроки исседования
20 дней 60 дней 120 дней 180 дней
Титр антител в РИ на ИРТ, log2
1 группа 0,2±0,01 0,2±0,01 0,2±0,01 0,2±0,01
2 группа 2,6±0,24 5,2±0,31 4,0±0,25 2,6±0,22
3 группа 6,0±0,68 10,2±1,01 9,2±0,91 6,4±0,66
4 группа 4,7±0,41 8,9±0,51 7,0±0,56 5,0±0,41
Как видно из таблицы 2, до вакцинации против инфекционного ринотрахеита в крови животных антител практически не наблюдалось. Через 20 дней после первичной вакцинации титр антител составил во второй группе 2,60±0,24 log2, в третьей - в 2,26 раза выше, в четвертой - в 1,75 раза выше, чем во второй. Через 60 дней после первичной вакцинации и через 40 дней после вторичной, титр антител увеличился во второй группе в 1,9 раза по сравнению с таковым через 20 дней после первичной вакцинации, в третьей - в 1,93, в четвертой - в 1,91 раза.
В течение последующих наблюдений (120 дней) отмечалось уменьшение титра антител по сравнению с титром антител через 60 дней: во второй группе - в 1,21 раза, в третьей группе
- в 1,23 раза, в четвертой - в 1,25 раза. Через 180 дней после первичной вакцинации титр антител незначительно превышал таковой через 20 дней (3,5-4,1%).
Таким образом, применение разработанной композиции и тимогара при вакцинации телят против инфекционного ринотрахеита способствовало увеличению титра антител в 2,26 и 1,75 раза, то есть иммуностимулирующая активность композиции превышала таковую для тимогара в 1,3 раза.
После проверки наличия специфической активности возникла необходимость в проверке токсичности данной композиции. Проверка токсических свойств композиции была проведена в 2 этапа. На первом этапе бала проверена общая токсичность, на втором - хроническая.
Для определения острой токсичности полученной композиции были выбраны 48 беспородных мышей обоего пола массой 18-22 г. Для исследования готовили композицию и вводили ее путем скармливания в следующих дозах: 500, 1500, 2500, 5000 мг/кг. Животным контрольной группы композицию не вводили. Каждая доза вводилась группе из 6 животных (3 самца и 3 самки). всего 8 групп. наблюдение за животными вели на протяжении 14 дней. Регистрировали следующие клинические показатели: общее состояние подопытных мышей, подвижность, поведение, состояние дыхательной системы, кожи и шерсти, потребление пищи, воды и др. Для расчета параметров острой токсичности был применен метод пробит-анализа по Литчфильду и Уилкоксону, основаный на учете смертности животных. Класс опасности препарата определяли согласно ГОСТ 12.1.007-76. Установлено, что композиция соответствует 6-му классу опасности (относительно безвредно) по степени токсичности - ЬБ50 > 5000 мг/кг.
Динамика принятия корма и воды у мышей не имела заметного различия по сравнению с контрольной группой. Динамика веса мышей, получавших композицию, тоже не имела заметного различия от показателей у животных в контрольной группе.
Подопытные животные выглядели обычно, не было обнаружено мест выпадения шерсти. Активность и подвижность, координация движений были в норме, на внешние раздражители была стандартная реакция. Дыхание было обычным. Консистенция фекальных масс, повторность мочеиспускания и окраска мочи были в норме. За период контроля у подопытных и контрольных мышей были замечены хороший аппетит и прибавление в весе (табл.3).
Таблица 4
Динамика изменения массы тела подопытных мышей (г) при установлении острой токсичности
Доза, Самцы Самки
мкг/кг Исход. Спустя Спустя Исход. Спустя Спустя
7 дней 14 дней 7 дней 14 дней
500 20,1 ±0,15 21,2 ±0,14 22,3 ±0,15 20,8 ±0,14 22,3 ±0,23 23,1 ±0,14
1500 20,6 ±0,14 22,0 ±0,18 22,6 ±0,13 20,0 ±0,13 20,7 ±0,17 22,1 ±0,18
2500 20,2 ±0,15 21,3 ±0,14 22,4 ±0,15 20,9 ±0,14 22,4 ±0,23 23,2 ±0,14
5000 20,8 ±0,14 22,1 ±0,18 22,8 ±0,13 20,4 ±0,13 21,3 ±0,17 22,7 ±0,18
Конт 20,7 22,2 23,1 20,8 22,0 23,2
роль ±0,17 ±0,27 ±0,22 ±0,14 ±0,25 ±0,16
Примечание: разница несущественная (Р>0,05).
На протяжении 14 суток смертности среди исследуемых мышей не наблюдалось, поэтому определить ЬБ50 не удалось. Поскольку при дозе 5000 мг/кг не отмечалось летального исхода среди мышей, то по ГОСТ 12.1.007-76 следует присвоить композиции 6 класс опасности (относительно безвредно) [Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности: ГОСТ 12.1.007-76,2]
Результаты исследований показали, что композиция в исследованных дозах не оказывает токсического воздействия на подопытных мышей и показывает возможность выполнения исследований по определению иммуностимулирующих свойств выбранной композиции.
При определении хронической токсичности было показано, что животные опытной и контрольной групп не отличались друг от друга, что свидетельствует, об отсутствии у композиции токсических свойств.
Таким образом, разработанная композиция на основе экстракта мяты и дипептида изолейцил-триптофан является нетоксичной и обладает иммуностимулирующей активностью.
ЛИТЕРАТУРА
1. Хусейнов У.М. разработка композиции на основе иммуномодулирующего препарата тимогар, лекарственных растений подорожника большого (Plantago major L.) и мяты перечной (MenthapiperitaL.). дисс..канд.биол.наук - Душанбе, 2019, - 110 С.
2. Попова О.А. Разработка фармацевтической композиции на основе низкомолекулярных иммуноактивных пептидов и ферулы вонючей. Автореф. Дис. Канд.фарм.наук.-Пятигорск, 2022. - 24 с.
3. Hussain, A.I.; Anwar, F.; Nigam, P.S.; Ashraf, M.; Gilani, A.H. Seasonal variation in content, chemical composition and antimicrobial and cytotoxic activities of essential oils from four Mentha species. J. Sci. Food Agric. 2010, 90, 1827-1836.
4. Nazem, V.; Sabzalian, R.M.; Saeidi, G.; Rahimmalek, M. Essential oil yield and composition and secondary metabolites in selfand open-pollinated populations of mint (Mentha spp.). Ind. Crops Prod. 2019, 130, 332-340.
5. Benabdallah, A.; Rahmoune, C.; Boumendjel, M.; Aissi, O.; Messaoud, C. Total phenolic content and antioxidant activity of six wild Mentha species (Lamiaceae) from northeast of Algeria. Asian Pac. J. Trop. Biomed. 2016, 6, 760-766.
6. Hanafy, D.M.; Prenzler, P.D.; Burrows, G.E.; Ryan, D.; Nielsen, S.; El Sawi, S.A.; El Alfy, T.S.; Abdelrahman, E.H.; Obied, H.K. Biophenols of mints: Antioxidant, acetylcholinesterase, butyrylcholinesterase and histone deacetylase inhibition activities targeting Alzheimer's disease treatment. J. Funct. Foods. 2017, 33, 345-362.
7. Atanassova, M.; Georgieva, S.; Ivancheva, K. Total phenolic and total flavonoids contents, antioxidant capacity and biological contaminants in medicinal herbs. J. Univ. Chem. Technol. Metall. 2011, 46, 81-88.
8. Kapp, K. Polyphenolic and Essential Oil Composition of Mentha and Their Antimicrobial Effect. Ph.D. Thesis, University of Helsinki, Helsinki, Finland, 2015
9. Kivilompolo, M.; Hyotylainen, T. Comprehensive two-dimensional liquid chromatography in analysis of Lamiaceae herbs: Characterisation and quantification of antioxidant phenolic acids. J. Chromatogr. 2007, 1145, 155-164.
10. Mekinic, I.G.; Skroza, D.; Ljubenkov, I.; Simat, V.; Mozina, S.S.; Katalinic, V. In vitro antioxidant and antibacterial activity of Lamiaceae phenolic extracts: A correlation study. Food Technol. Biotechnol. 2014, 52, 119-127.
11. Yang, L.;Wen, K.S.; Ruan, X.; Zhao, Y.X.;Wei, F.;Wang, Q. Response of Plant Secondary Metabolites to Environmental Factors. Molecules 2018, 23, 762.
