CC BY
20А.С. Сапун, О.В. Квитко, И.И. Конева, Я.И. Шейко, Н.А. Балашенко, С.Е. Дромашко
СПОНТАННАЯ ИММОРТАЛИЗАЦИЯ ФИБРОБЛАСТОВ КРЫСЫ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ IN VITRO
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
В связи с неуклонным ростом частоты онкологических заболеваний, одной из ключевых проблем современной медицины и биологии является понимание закономерностей процессов иммортализации и онкотрансформации. Несмотря на впечатляющие достижения генетики соматических клеток в изучении малигнизации, во многом остается неизвестной последовательность событий, развивающихся в ходе этого процесса. До конца также не изучены причины приобретения потенциального бессмертия раковых клеток и преодоления ими так называемого лимита Хайфлика. Еще в 1961 году в работах Леонарда Хайфлика и Пауля Мурхеда было установлено, что репликативный потенциал нормальных диплоидных клеток млекопитающих ограничен. Они показали, что культуры диплоидных клеток проходят in vitro 3 стадии. I стадия - это период адаптации первичной культуры к условиям культивирования, II стадия представляет собой этап роста, когда клетки делятся определенное число раз, а на III стадии пролиферация прекращается и наступает репликативное старение (популяции клеток сохраняют жизнеспособность, но митоти-ческих делений не происходит), после чего наступает кризис - клетки дегенерируют и погибают. Пролиферативный потенциал клеток, культивируемых in vitro, коррелирует с видовой продолжительностью жизни: для эмбриональных фи-бробластов (ЭФ) человека он может составлять от 40 до 60 удвоений клеточных популяций, для ЭФ крысы - 14-28, для клеток мышей - 10-20 [1]. Однако существуют исключения из этого правила: иммортализированные и раковые клетки.
Иммортализированные и раковые культуры обладают способностью к неограниченной пролиферации и могут преодолевать клеточное старение. Различие между иммор-
тализированными и раковыми клетками, культивируемыми in vitro, заключается в способности раковых клеток вызывать развитие злокачественных новообразований при трансплантации их восприимчивым животным [2]. Для проведения таких исследований, как правило, используются иммунодефи-цитные мыши линии SCID (severe combined immunodeficiency mice) - мыши с тяжелой иммунологической недостаточностью, которая определяется отсутствием Т- и В-лимфо-цитов, а также мыши NOD-SCID (Nonobese Diabetic SCID), у которых развивается диабет без ожирения и иммунодефицит с отсутствием T-, B- и NK-лимфоцитов [3].
Иммортализация является ключевой стадией канцерогенеза, но недостаточной для опухолевой прогрессии. Так, было показано, что мутация онкогена ras вызывает раковую трансформацию SV40-иммортализирован-ных фибробластов, но не приводит к злокачественному перерождению нормальных фи-бробластов человека (не трансфецированных палиомавирусом SV40) [4]. При сходных экспериментах, связанных с изменением активностей генов опухолевых супрессоров, таких как p53 и p16 INK4a, онкотрансформация наблюдалась в культурах фибробластов человека, предварительно иммортализированных вирусом SV40 [5, 6].
К генам иммортализации можно отнести myc [7], р16/р53 [5, 6], bcl-2 [8], ras [9], fos [10] и др. Общим для этих генов является то, что они кодируют ядерные белки, связывающиеся с ДНК и ядерным матриксом. Кроме того, их активация осуществляется не только путем мутаций, при которых изменяется нуклеотид-ная последовательность кодирующего участка
гена, но и посредством амплификации и эпигенетической регуляции, одним из механизмов которой является метилирование цитозиновых оснований в ДНК [11, 12].
Иммортализация может быть спонтанной и индуцированной. Спонтанная иммортализация - редкое событие, которое происходит в культурах нормальных фибробластов человека с частотой 10-7-10-9 [13]. На рис. 1 приведена шкала, отражающая возможность клеток различного происхождения приобретать неогра-
ниченный пролиферативный потенциал [14]. В стареющих культурах фибробластов грызунов частота трансформации значительно выше, поэтому эмбриональные фибробласты крысы являются удобным объектом для изучения процессов иммортализации и онкотрансформации в процессе длительного культивирования [15, 16]. Их можно использовать для изучения разных этапов малигнизации, что является важным для разработки новых эффективных способов профилактики, диагностики и терапии рака.
— фибробласты цыпленка
= фибробласты человека фибробласты теленка
— фибробласты кролика
— фибробласты хомячка
— фибробласты крысы фибробласты мыши
Рис. 1. Качественная шкала, демонстрирующая увеличение вероятности приобретения способности к неограниченной пролиферации клетками разной видовой принадлежности
Целью настоящей работы было исследование эта- нальных характеристик фибробластов крысы при пов спонтанной иммортализации и онкотрансфор- их длительном культивировании in vitro с помощью мации путем анализа морфологических и функцио- метода компьютерной видеомикроскопии.
Материалы и методы
В качестве объекта исследования использовали культивируемые in vitro эмбриональные фибробласты крысы. Для получения первичной клеточной линии кожно-мышечную ткань 8-14-дневных эмбрионов крысы переводили в культуру клеток. Для этого измельченную ткань дезагрегировали 0,25%-ным раствором трипсина при 37 °С в течение 30 мин. После удаления трипсина осадок ресуспендировали в ростовой среде, добавляли в культуральный сосуд СО2 (5% от объеме сосуда) с помощью шприца, герметически закупоривали сосуд и культивировали клетки при 37 °С.
Для длительного поддержания фибробла-стов крысы использовались 2 способа. При
первом клеточный монослой 1 раз в неделю обрабатывали последовательно раствором Версена, а затем 0,25%-ным раствором трипсина, после чего ферменты отмывали средой Игла, суспендировали клетки и высевали их в новые культуральные сосуды. При втором, менее трудоемком способе, культуру поддерживали путем еженедельной смены среды. Культуральная среда содержала среду DMEM, 10% эмбриональной сыворотки телят (ЭТС) и антибиотики (0,01% пенициллина и стрептомицина). Монослойные культуры, полученные из эмбрионов крысы, характеризуются фибробластоподобным типом роста.
Для анализа живых иммортализирован-ных фибробластов крысы использовали компьютерный видеокомплекс, включающий инвертированный микроскоп с термокамерой и цветную видеокамеру, подключенную к компьютеру. Для компьютерной видеосъемки сосуд Карреля с клетками помещали в термокамеру (37 °С) инвертированного микроскопа. С помощью визуального просмотра выбирали участок культуры на дне культурального сосуда и выполняли автоматическое компьютерное фотографирование либо видеосъемку клеток.
Для проведения детального анализа в некоторых экспериментах по видеомикроскопии живых клеток использовались специально изготовленные стеклянные вкладыши. Они имели размеры 25 х 10 х 1 мм и были разделены на квадратные (1 х 1 мм) участки бороздками шириной 0,2 мм и глубиной 0,05 мм. Бороздки препятствовали перемещению клеток из одного квадрата в другой, что обеспечивало удобство анализа роста культуры. При этом плотность посева составляла 1500-2000 клеток на 1 см2, что позволяло анализировать события на уровне отдельных фибробластов и их клеточных потомств.
Результаты и обсуждение
Впервые смену культуральной среды в сосуде с первичной культурой эмбриональных фибробла-стов крысы (ЭФК) осуществили на вторые сутки культивирования. Культура достигла состояния конфлуентности на седьмые сутки культивирования. Можно предположить, что в течение этого времени в клеточной культуре уже произошли процессы старения, сопровождающиеся уменьшением пролиферативной активности. По опубликованным данным, торможение клеточного деления первичных культур млекопитающих на ранних этапах культивирования может рассматриваться как проявление так называемого внешнего клеточного старения [17]. Внешнее, или преждевременное, старение в культуре клеток основано на механизме, который активируется при повышении содержания кислорода в газовой среде, и отличается от «внутреннего» репликативного старения. Так, для клеток человека репликативное старение коррелирует с укорочением теломер -концевых участков хромосом, состоящих из тысяч тандемных повторов (TTAGGG)n при каждом клеточном делении за счет выключения фермента теломеразы, которое происходит на ранних этапах эмбриогенеза [18]. Клетки грызунов отличаются длинными стабильными теломерами и снабжены системой воспроизведения концевых участков хромосом, что предохраняет их от реплика-тивного старения, но они, в то же время, более чувствительны к внешнему старению. В работе Симоны Паринелли и сотрудников показано, что феномен преждевременного старения в большей степени свойственен фибробластам мыши (ФМ), чем фибробластам человека (ФЧ). ФМ не проявляли ускоренного старения при физиологическом уровне кислорода (3%), а при атмосферном
содержании кислорода (20%) они либо приобретали способность к неограниченной пролиферации, либо переставали размножаться вовсе [17]. Механизм преждевременного старения связывают с работой ингибиторов циклин-зависимых киназ, причем их активация приводит к необратимой остановке клеточного цикла, и наоборот, их инактивация способствует малигнизации [19, 20]. ФЧ обладали меньшей чувствительностью к действию кислорода, что отражалось лишь в кратковременном снижении скорости пролиферации. Следовательно, у грызунов, в отличие от человека, вследствие относительно меньшей резистентности к стрессовым воздействиям пусковые механизмы спонтанной иммортализации могут срабатывать раньше, уже при переводе клеток в культуру, и проявляться в виде увеличения пролиферативного потенциала в части клеточной популяции, нарушения контактного ингибирова-ния и возникновения клональной гетерогенности.
После 21 суток культивирования (III пассаж) конфлуентный монослой из фибробла-стоподобных клеток трипсинизировали. Клетки подсчитывали в камере Горяева и высевали при плотности 10 000 клеток на 1 см2 в два стеклянных культуральных сосуда (культуры 1 и 2) (IV пассаж). В сосуд с культурой 1 помещали стеклянный вкладыш для последующего эксперимента по компьютерной видеосъемке (подробнее эксперимент описан ниже).
На 28-й день в обеих культурах образовался плотный монослой, состоящий из веретеновид-ных клеток. В культуре 1 сменили отработанную культуральную среду, одновременно в культуре 2 был осуществлен трипсиновый пересев клеточного монослоя (пассаж V). На 30-е сутки экспе-
римента в культуре 1 зарегистрировали единичные многослойные агрегаты на фоне монослоя, состоящего из веретеновидных клеток (рис. 2а), в то время как в культуре 2 единичные клетки лишь начинали формировать разреженный монослой
(рис. 2б). Формирование многослойных клеточных агрегатов свидетельствует о нарушении способности клеток к контактному торможению, что может быть одним из признаков иммортализации фибробластов крысы.
. - i/M, ■ «КУМ»
" Ш
А , .1 г L ä
■ N ■'
ш
100 мкм
• —. 1 ■ * ф "
(
1 ¿У'
;<. t у '
-i
* - • ' г.' I
У.
г J ' idAf '
100 мкм
.. 4
а)
л
б)
В культуре 1 на 30-е сутки в сплошном монослое вере- В культуре 2 на 30-е сутки наблюдается формирова-теновидных клеток формируются участки загущения ние разреженного монослоя
Рис. 2. Культуры фибробластов крысы после 30 суток культивирования
По истечении 36 дней в культуре 1 сменили культуральную среду, а в культуре 2 осуществили трипсиновый пересев (пассаж VI). На 41-й день культивирования в культуре 2 отметили снижение скорости пролиферации фибробластов крысы, местами наблюдали группы погибших клеток, т.е. культура вступила в стадию кризиса и старения, в то время как в культуре 1 плотность монослоя увеличивалась, количество многослойных агрегатов возрастало.
На 43-й день эксперимента в культуре 2 зарегистрировали появление клеток атипичной морфологии (округлой формы) на фоне разреженного монослоя веретеновидных клеток (рис. 3а и 3б). Для проверки того, появились ли клетки измененной морфологии в культуре 1, выращиваемой без пересевов, на 48-й день культивирования из флакона 2 извлекли стеклянный вкладыш и поместили его в новый культуральный сосуд 3 и подвергли клетки на вкладыше трипсинизации. Клетки ресуспендировали в среде в течение 5 минут, после чего во флакон с оставшимся вкладышем добавили 5% СО2. Плотность посева культуры не превышала 3000 клеток на 1 см2, что являлось приемлемым для проведения
эксперимента по непрерывной видеосъемке клеточной культуры при частоте видеозаписи 1 кадр в 24 секунды.
Анализ видеофильма показал, что в культуре 1 и 3, так же как и в культуре 2, присутствовали округлые клетки, которые обладали более активной пролиферацией (по сравнению с популяцией веретеновидных клеток) и постепенно вытесняли последние (рис. 4). На рис. 4а видно, что через 24 часа 24 минуты на субстратной пластинке адгезировались группы веретеновидных клеток. Анализ видеозаписей показал, что некоторые клетки были погибшими. По истечении 80 часов 40 минут начали появляться группы морфологически измененных (округлых) клеток (рис. 4б). По прошествии еще 3 часов количество округлых и веретеновидных клеток в пределах одного участка субстратной пластинки стало приблизительно одинаковым (рис. 4в), но после 111 часов 40 минут от начала культивирования веретеновидные клетки начали укрупняться в размерах, причем количество их делений резко сократилось (рис. 4г), в то время как округлые клетки продолжали размножаться и постепенно полностью вытеснили веретеновидные (рис. 4 д-е).
■
Pf
■1 V 1 ■
• а
100 мкм
а)
На 43-й день в культуре 2 появилась небольшая субпопуляция клеток более округлой формы (по сравнению с веретеновидными клетками окружающего монослоя)
■W
л '
. ' _ .. \ ' -
я '•Vlrt <pis>t
-у."- •
Я
а ■
- о h
.е1
> *1 j
. ...
; h
I , ' г * У
" v, -.■ f.
. Л ... .
■■V
J00 мкм
-
б)
В культуре 2 на 43-е сутки зарегистрированы участки с клетками более округлой формы (по сравнению с окружающими участками монослоя веретеновидных клеток)
Рис. 3. Клональная гетерогенность в культуре фибробластов крысы как один из признаков иммортализации
в) 83 ч 40 мин
V :• 1 * ' W^jWV Ы , *»*тП У у *»
4 ю -v. ' •' " V
V 1Ä 'i с, t ъ > ■ м 1 / - r: % 1
100 мкм
г) 111 ч 40 мин
д) 171 ч 40 мин
е) 196 ч 20 мин
Сплошной стрелкой отмечена группа погибших клеток, стрелками с пунктиром указаны разрастающиеся группы морфологически измененных (округлых) клеток, утолщенные стрелки указывают на оставшиеся единичные веретеновидные клетки, которые прекратили делиться и постепенно погибают
Рис. 4. Экспансия аномальных округлых клеток в культуре 1 (пояснения в тексте)
Полученные данные демонстрируют, что веретеновидные клетки обладают ограниченным пролиферативным потенциалом и не могут преодолевать механизмов клеточного старения, в то время как округлые клетки являются иммортализированными, т.е. приобретают способность к неограниченной пролиферации. Кроме того, впервые показано, что трансформированные клетки могут возникать не на поздних стадиях клеточного старения (кризиса), а на более ранних этапах культивирования.
В целом результаты данной работы показали многостадийность спонтанной им-мортализации фибробластов крысы при их длительном культивировании in vitro. Причем первый этап спонтанного и необратимого перерождения эмбриональных фибро-бластов крысы в сторону злокачественного фенотипа связан с нарушением контактного ингибирования, а значит, и межклеточных взаимодействий, что проявляется в формировании многослойных фокусов из верете-
новидных клеток. На втором этапе появляются клетки атипичной формы (округлые), несвойственные стареющим культурам фибробластов. Третий этап заключается в экспансии веретеновидных клеток округлыми.
Для более детализированной регистрации событий, ведущих к генерации иммортали-зированных округлых клеток в клоновых по-томствах веретеновидных клеток требуются дополнительные исследования по непрерывной видеозаписи при разреженных посевах фибробластов на более ранних пассажах. При этом важно учитывать, что частота процессов дифференцировки веретеновид-ных клеток в клетки округлой формы может быть невысокой, особенно в культурах клеток человека. Поэтому целесообразно использовать параллельную (одновременную) видеозапись многих участков клеточных культур с помощью автоматизированных видеокомплексов, в частности, видеокомплекса «Цитомир», разработанного нами совместно ГНПО «Планар» [21].
Заключение
С помощью компьютерной микроскопии были описаны закономерности спонтанной иммортализации и дальнейших изменений клеточной популяции в направлении ракового фенотипа в культурах фибробластов, полу-
ченных из эмбриона крысы. При длительном культивировании эмбриональных фибробла-стов крысы in vitro на первом этапе имморта-лизации наблюдалось образование монослоя с многослойными агрегатами (фокусами) из ве-
ретеновидных клеток. Второй этап заключался в появлении единичных округлых клеток, несвойственных стареющим культурам фибробластов. На третьем этапе округлые клетки полностью вытесняли веретеновидные. Установлено, что веретеновидные клетки обладают ограниченным пролиферативным потенциалом,
в то время как округлые клетки являются им-мортализированными, т.е. приобретают способность к неограниченной пролиферации. Кроме того, впервые показано, что трансформированные клетки могут возникать не на поздних стадиях клеточного старения (кризиса), а на более ранних этапах культивирования.
Список использов
1. Hayflick, L. The serial cultivation of human diploid cell strains / L. Hayflick, P.S. Moorhead // Experimental Cell Research. - 1961. - Vol. 25. - P. 177-185.
2. Troshko, J.E. Cancer stem cells and cancer nonstem cells: from adult stem cells or from reprogramming of differentiated somatic cells // Veterinary Pathology. - 2009. -Vol. 46, №2. - Р. 180.
3. Perryman, L.E. Animal models: Molecular pathology of severe combined immunodeficiency in mice, horses, and dogs / L.E. Perryman // Veterinary Pathology. -2004. - Vol. 41, №2. - P. 95-97.
4. Expression profiles of SV40-immor-talization-associated genes upregulated in various human cancers / H.M. Jung [et al.] // Journal of Cellular Biochemistry. - Vol. 106, №4. - P. 703-705.
5. Jorgensen, M.K. The Influence of SV40 Immortalization of Human Fibroblasts on p53-Dependent Radiation Responses / M.K. Jorgensen, J. Timothy // Biochemical and Biophysical Research Communications. -2002. - Vol. 257, №1. - P. 168.
6. Knockdown of p53 combined with expression of the catalytic subunit of telomer-ase is sufficient to immortalize primary human ovarian surface epithelial cells / G. Yong [et al.] // Carcinogenesis. - 2006. - Vol. 28, №1. - P. 174.
7. C-myc Overexpression Causes Anapla-sia in Medulloblastoma / D. Stearns [et al.] // Cancer Research. - 2006. - Vol. 66, №2. -P. 673.
8. Suri, C. The Immunohistochemical Evaluation Of The Expression Of Bcl-2 In Different Histological Grades Of Squamous Cell Carcinoma / C. Suri // Journal of Clinical and Diagnostic Research. - 2009. - №3. -P. 189.
нных источников
9. Expression of activated M-Ras in he-mopoietic stem cells initiates leukemogenic transformation, immortalization and preferential generation of mast cells / X.Guo [et al.] // Oncogene. - 2006. - Vol. 25, №30. - P. 441.
10. The expression and significance of proto-oncogene c-fos in viral myocarditis / S.Zhang [et al.] // Virology Journal. - 2010. -Vol. 7, №1. - P. 285.
11. Агеенко, А.И. Новая диагностика рака: теория, диагностика, лечение, реабилитация / А.И. Агеенко. - Москва: Медицина XX, 2004. - 408 с.
12. Lele, R.D. Epigenetics - gene silencing / R.D. Lele // The Journal of association of physicians of India. - 2009. - Vol. 60. -P. 60.
13. Перестройки хромосом и их роль в спонтанной иммортализации и трансформации эмбриональных клеток крысы / Н.М. Ярцева [и др.] // Цитология. - 2007. -Т. 49, №4. - С. 311-321.
14. Macierra-Caelho, A. Comparative biology of cell immortalization / A. Macierra-Caelho. - Berlin: Springler, 2000. - С. 51-80.
15. Simons J.W. Genetic, epigenetic, dys-genetic, and non-genetic mechanisms in tumorigenesis / J.W. Simons // Critical Reviews in Oncogenesis. - 1995. - Vol. 6, №3. -P. 261-273.
16. Carcinogenesis in mouse and human cells: parallels and paradoxes / A. Balmain [et al.]//Carcinogenesis.- 1999.-Vol. 21, №3.-P. 371-377.
17. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts / S. Parrinello [et al.] // Nature. - 2003. - Vol. 5, №3. - Р. 740-749.
18. Oeseburg, H. Telomere biology in healthy aging and disease / H. Oeseburg. -Berlin: Springler, 2009. - P. 259-268.
19. Gorbunova, V. Cellular Senescence and Tumor Suppression / V. Gorbunova. - Berlin: Springler, 2010. - P. 175-197.
20. Aging mechanisms / Y. Takahashi [et al.] // PNAS. - 2000. - Vol. 97, №23. -Р. 12 407-12 408.
21. Каталог приборов, комплексов и
научных установок, разработанных по подпрограмме «Научные приборы» Государственной научно-технической программы «Эталоны и научные приборы» (2006-2010 гг.) / под ред. В.Б. Ладо, А.Д. Широканова. - Минск: Институт физики НАН Беларуси, 2011. - С. 75-76.
Дата поступления статьи 19 декабря 2011 г.
