CC BY
54УДК 616-006.48:615.28
А.С. Сапун, О.В. Квитко, И.И. Конева, Я.И. Шейко, Н.А. Балашенко, С.Е. Дромашко
ИММОРТАЛИЗАЦИЯ И ОНКОТРАНСФОРМАЦИЯ В ПОПУЛЯЦИЯХ
СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Раковая трансформация - это сложный многостадийный процесс, протекающий на молекулярном, генетическом, клеточном, тканевом, органном и организменном уровнях в результате воздействия и взаимодействия различных по своей природе экзо- и эндогенных канцерогенных факторов, приводящий при неблагоприятных для организма условиях к развитию злокачественной опухоли [1]. Возможно, эта многоэтапность возникла вследствие того, что в эволюции вырабатывались все новые механизмы противодействия неконтролируемому размножению трансформированных клеток. Благодаря этому обеспечивалось замедление развития раковых заболеваний и тем самым гарантировалась увеличенная продолжительность жизни у сложных организмов с длительным периодом развития [1].
Главным достижением в исследовании рака в течение последних десятилетий явилось выявление многостадийности канцерогенеза на молекулярно-генетическом уровне при возникновении опухолей во многих тканях и органах [2-6].
Согласно современным представлениям в процессе онкотрансформации принято выделять 3 основные стадии: инициации, промоции и прогрессии.
Известно, что при прохождении различных стадий онкогенеза клетки приобретают такие признаки как морфологические изменения, уменьшение потребности в ростовых факторах, отсутствие контактного торможения (способность к многослойному росту), независимость роста от прикрепления к субстрату, прививаемость (способность образовывать опухоли у сингенных животных), способность к инвазии и метастазированию, развитие мно-
жественной лекарственной резистентности [79]. Однако до сих пор не сложилось четкого представления о последовательности приобретения перечисленных признаков злокачественного фенотипа в соответствии с протеканием различных этапов раковой трансформации.
Общепризнано, что опухолевая трансформация как доброкачественных, так злокачественных новообразований начинается стадией инициации [1,10-12].
На ранних этапах онкотрансформации индуцируется образование частично трансформированных (иммортализированных) клеток, которые приобретают как минимум три свойства:
1) Приобретение способности к неограниченной пролиферации, связанной с преодолением лимита Хайфлика [10-12];
2) В клетках блокируется процесс терминальной дифференцировки, что приводит к анаплазии, т. е. к утрате нормальной тканевой структуры (изменение размеров и формы отдельных тканевых образований, взаимного расположения клеток или полное отсутствие тканевых структур) [11];
3) Проявление субстратной независимости в способности иммортализированных клеток пролиферировать в жидкой и полужидкой средах, в то время как большинство типов нормальных клеток могут размножаться лишь при условии их прикрепления к определенному внеклеточному матриксу [12].
Различие между иммортализированными и раковыми клетками, культивируемыми in vitro, заключается в способности раковых клеток вызывать развитие злокачественных новообразований при трансплантации их восприимчивым животным [10]. Для проведения таких
исследований, как правило, используются им-мунодефицитные мыши линии SOD (severe combined immunodeficiency mice - мыши с тяжелой иммунологической недостаточностью, иммунодефицит определяется отсутствием Т- и В- лимфоцитов) и NOD-SCID (Nonobese Diabetic SCID - мыши SCID c диабетом без ожирения, иммунодефицит характеризуется отсутствием T-, B- и NK-лимфоцитов) [13].
Иммортализация является ключевой стадией канцерогенеза, но недостаточной для опухолевой прогрессии. Так, было показано, что мутация онкогена ras вызывает раковую трансформацию SV40-иммортализированных фи-бробластов, но не приводит к злокачественному перерождению нормальных фибробластов человека (не трансфецированных полиомави-русом SV40) [14]. При сходных экспериментах, связанных с изменением активностей генов опухолевых супрессоров, таких как p53 и p16 INK4a, онкотрансформация наблюдалась в культурах фибробластов человека, предварительно иммортализированных вирусом SV40 [15,16].
К генам иммортализации можно отнести myc [17], р16/р53 [15,16], bcl-2 [18], ras [19], fos [20] и др. Общим для этих генов является то, что они кодируют ядерные белки, связывающиеся с ДНК и ядерным матриксом. Кроме того, их активация осуществляется не только путем мутаций, при которых изменяется ну-клеотидная последовательность кодирующего участка гена, но и посредством амплификации и эпигенетической регуляции, одним из механизмов которой является метилирование ци-тозиновых оснований в ДНК [9, 21].
Согласно теории многоэтапности канцерогенеза полагают, что на стадии промоции им-мортализированные клетки под воздействием различных факторов начинают интенсивно размножаться, образуя колонии клеток, вытесняющие нормальные клетки в тканях. При этом идет процесс закрепления возникших генетических нарушений в новых клеточных поколениях. Кроме того, на данной стадии начинают выявляться молекулярно-генетические и морфологические отличия между клетками одной и той же опухоли, так называемая гетерогенность [22-24].
Стадия прогрессии сводится к перерождению частично трансформированных клеток
в опухолевые. Такое превращение осуществляется за счет накопления различных генетических и эпигенетических изменений, необходимых для окончательного становления злокачественного фенотипа клеток in vivo и in vitro. Четкого перехода между клетками разных стадий до сих пор не выявлено, поэтому деление на эти 3 этапа является условным [25].
Последние годы ознаменовались бурным развитием исследований в области стволовых клеток (СК). Благодаря накоплению новых данных о биологии соматических СК взрослого организма представления о механизмах раковой трансформации и иммортализации обогатились сведениями, которые позволяют утверждать, что в основе молекулярных событий и клеточных процессов лежат явления, связанные с возникновением и существованием раковых стволовых клеток (РСК). В соответствии с принятой в цитоонкологии концепции РСК раковые клеточные популяции как in vivo, так и in vitro состоят в основном из стареющих клеток, которые либо вообще не делятся и погибают, либо формируют небольшие клеточные клоны, также обреченные на гибель. Возможность неограниченного роста раковой клеточной популяции обеспечивается потенциально бессмертными РСК, которые не только воспроизводят сами себя, но также дифференцируются в стареющие клетки [26].
Существование стволовых клеток опухоли было продемонстировано впервые в 1994 году группой исследователей из Торонто (США) под руководством Джона Дика. Они показали, что только маленькая популяция клеток лейкемии, экспрессирующих поверхностные маркеры нормальных стволовых клеток (CD34+CD38-), была способна вызывать лейкемию у мышей. Кроме того, популяции раковых клеток, размножающиеся в организме мышей, имели те же характеристики, что и образцы, откуда они были взяты [27]. Подобные результаты на примере солидных опухолей были впервые получены в лаборатории Кларка из University of Michigan Medical School (США). Исследователи в 2003 году продемонстрировали, что в опухолях молочной железы существует субпопуляция стволовых клеток опухоли с поверхностными маркерами CD44+CD24- [28].
До сих пор в цитоонкологии остается ак-
туальным вопрос происхождения стволовых клеток, индуцирующих злокачественный рост, и существует множество гипотез о потенциальных клеточных механизмах канцерогенеза.
Большинство исследователей связывают происхождение РСК с перерождением соматических СК взрослого организма в результате накопления генетических мутаций или эпигенетических изменений под воздействием эндогенных и экзогенных факторов [29-31]. В этом плане уместно отметить, что впервые идея возникновения рака из эмбриональных клеток (когда еще не было известно о существовании СК) была предложена Рудольфом Вирховом в 1858 год. После этого Cohnheim и Durante сформулировали «эмбриональную теорию», где источником злокачественных и доброкачественных новообразований считались эмбриональные зачатки, содержащиеся во всех тканях и органах взрослого организма [32].
Другим возможным источником возникновения РСК считаются прогениторные клетки или дифференцированные соматические клетки, которые вновь восстанавливают свойства стволовых клеток и становятся злокачественными [33, 34].
Альтернативный механизм основан на гипотезе возникновения РСК в результате слияния СК с дифференцированной соматической клеткой и образованием гибридных клеток со свойствами РСК или способными становится РСК в дальнейшем [35-36]. Имеется ряд данных о слиянии (cell fusion) кроветворных СК и мезенхимальных СК in vivo и in vitro с клетками различных тканей. Такие исследования, в частности, были выполнены в работах c трансгенными линиями мышей по генным системам Cre/loxP под руководством Manuel Alvarez-Dolado [37-38] и Sabrine Bonde [39]. Вместе с тем в литературе высказываются сомнения в том, что спонтанное слияние клеток является реальным механизмом возникновения РСК. На наш взгляд, для прояснения этого вопроса целесообразно использовать компьтерную видеомикроскопию на уровне единичных клеток.
Понимание клональной эволюции клеточной популяции опухоли на уровне отдельных клеток начиная от появления первых трансформированных клеток до становления инва-зивных карцином является важным условием разработки эффективных методов антираковой
терапии. Так, в работах Джордана Крэйга из медицинского центра университета Рочестера продемонстрировано, что стволовые клетки лейкемии гораздо более устойчивы к химиотерапии и радиотерапии, чем дифференцированные миелобластные клетки, составляющие большую часть клеточной популяции [40]. Уничтожение РСК - обязательное условие эффективной терапии опухолей различного ге-неза. Рецидив, возникающий после уничтожения основной массы опухоли и проведенной химио- или радиотерапии, может объясняться именно тем, что РСК не были полностью элиминированы. Таким образом, изучение клональной гетерогенности является принципиально важным аспектом в выявлении РСК, а значит и в разработке новых средств антираковой терапии [21-22, 41, 42].
Распознавание РСК и выявление этапов становления злокачественного фенотипа клеток является важным аспектом эпигенетической терапии, основанной на разработке антираковых средств, которые индуцируют направленную дифференцировку РСК если не в нормальные, то, по крайней мере, в стареющие раковые клетки, в конечном счете погибающие [42-44]. Разработка антираковых препаратов, направленно изменяющих дифференцировку РСК, находится в самом начале своего развития. Так, например, успехом эпигенетической терапии является применение для лечения промиелоцитарной лейкемии ретиноевой кислоты (метаболита витамина А), индуцирующего клеточную дифференцировку [42], найден ингибитор ДНК-метилтрансферазы 5-азацитидин [43]. Эндрю Файером и Крэгом Мелло открыто явление РНК-интерференции [44], на которое сейчас возлагаются большие надежды. К сожалению, еще не разработаны наиболее эффективные способы управления эпигенетической изменчивостью раковых стволовых клеток в направлении клеточного старения и гибели.
Возникающие сложности в поиске новых антираковых средств можно объяснить тем, что на сегодняшний день исследования выполняются, как правило, на большой совокупности клеток. Разрешающая способность существующих молекулярно-генетических методик не позволяет проследить весь путь клональной эволюции и многоэтапность ра-
ковой трансформации на уровне отдельных клеток, начиная с возникновения генетических изменений в индивидуальных клетках и заканчивая распространением этих изменений по всей клеточной популяции. Дальнейшее развитие цитоонкологии будет во многом связано с исследованием генетических процессов на
уровне отдельных клеток посредством компьютерной видеомикроскопии. В данной работе представлены результаты исследования процесса спонтанной иммортализации клеточной популяции эмбриональных фибробластов человека с помощью витальной компьютерной видеосъемки.
Материалы и методы
В качестве объекта исследования использовали культивируемые in vitro эмбриональные фибробласты человека (ИФЧ). Для получения клеточной линии кожно-мышечную ткань 8-12 недельных эмбрионов человека переводили в культуру клеток. Для этого измельченную ткань дезагрегировали 0,25%-ным раствором трипсина при 37°С в течение 30 мин. После удаления трипсина осадок суспендировали в ростовой среде, добавляли в культуральный сосуд СО2 (5% от объеме сосуда) с помощью шприца, герметически закупоривали сосуд и культивировали клетки при 37°С.
Для длительного поддержания ИФЧ использовались 2 способа. При первом - клеточный монослой периодически обрабатывали 0,25%-раствором трипсина или смесью растворов трипсина и версена (0,02%) в отношении 1:1, после чего отмывали ферменты средой Игла, суспендировали клетки и высе-
вали их в новые культуральные сосуды. При втором, менее трудоемком способе, культуру поддерживали путем еженедельной смены среды. Культуральная среда содержала среду Игла, 10% эмбриональной сыворотки телят (ЭТС) и антибиотики (0,01% пенициллина и стрептомицина).
Для анализа живых иммортализированных фибробластов человека был собран компьютерный видеокомплекс, включающий инвертированный микроскоп с термокамерой и цветную видеокамеру, подключенную к компьютеру. Для компьютерной видеосъемки сосуд Карреля с клетками помещали в термокамеру (37°С) инвертированного микроскопа. С помощью визуального просмотра выбирали участок культуры на дне культурального сосуда и выполняли автоматическое компьютерное фотографирование либо видеосъемку клеток.
Результаты и обсуждение
Постоянные (иммортализированные) клеточные линии человека являются перспективной экспериментальной моделью в изучении последовательности процессов малигнизации клеток. Однако частота раковой трансформации эмбриональных фибробластов человека in vitro происходит гораздо реже по сравнению с фибробластами мыши [45]. Таким образом, получение иммортализированной линии человека in vitro - это кропотливый трудоемкий процесс, требующий затраты большого коли -чества времени, но далеко не всегда заканчивающийся достижением желаемого. Именно по этой причине большинство лабораторий мира работают с культурами перевиваемых линий, источниками которых являются клетки опухолей человека, обладающие способностью к росту в течение неограниченного периода в
условиях продолжительного культивирования. В качестве примеров перевиваемых культур человека можно привести: НеЬа (из злокачественных новообразований шейки матки), Нер-1 (из опухоли печени), А549 (из рака легкого ) [46]. Следует отметить, что главным недостатком перевиваемых культур является то, что они не пригодны для наблюдения начальных этапов неопластической трансформации и постепенного становления злокачественного фенотипа.
В лаборатории моделирования генетических процессов ИГЦ НАН Беларуси была выделена спонтанно иммортализированная культура фибробластов эмбриона человека. Подробная схема получения постоянной линии фибробластов человека представлена на рисунке 1.
Рис. 1. Основные этапы получения иммортализированной культуры из эмбриона человека
100 мкм
Рис. 2. Аномально густой монослой культуры фибробластов человека, образованный клетками удлиненной
веретеновидной формы, на 104 сутки культивирования
Первый этап был зафиксирован на 104 сутки культивирования. В культуре фибробластов человека наблюдали аномально густой монослой, состоящий исключительно из веретено-видных клеток. В данной культуре клетки отличались от нормальных фибробластов тем, что обладали нетипичной сверхудлиненной формой (рис. 2).
По истечении следующих 7 суток на дне культурального сосуда зарегистрировали единичные многослойные агрегаты на фоне монослоя, состоящего из веретеновидных клеток (рис. 3). Ослабление контактного торможения, проявляющееся в образовании многоклеточных агрегатов, является признаком дальнейших изменений клеток в направлении ракового фенотипа. Кроме того, образование многослойных клеточных агрегатов свидетельствует о том, что в данной
культуре клетки сохраняют высокий про-лиферативный потенциал, но не переходят в состояние старения (senescence), которое характеризуется резким нарушением метаболизма и, прежде всего, прекращением репликации ДНК. Вслед за этим, по данным Л. Хайфлика, обычно вскоре наступает фаза гибели клеток [47].
На 187 сутки культивирования был произведен трипсиновый рассев культуры 2 (VI пассаж), представленной в основном клетками веретеновидной формы, на две культуры (2 и 21). В обеих этих культурах после недельного культивирования было отмечено появление редко расположенных клонов, состоящих из мелких округлых клеток. Такая форма клеток атипична для эмбриональных фибробла-стов человека, зато является характерной для трансформированных клеток.
Рис. 3. Появление многоклеточных фокусов на фоне веретеновидных клеток как свидетельство спонтанной
иммортализации
Монослой верете-новидных клеток
а) 201 сутки
Экспансия
клеток округлой
ЬА
формы
\ч 5 ? ■..■ у. .у,- D .'. • ■ V :
шт и . • -. ■ v
Появление в центре единичных редко
расположенных округлых клеток
б) 203 сутки
Вытеснение округлыми клетками
веретено-видных
в) 205 сутки
г) 212 сутки
Рис. 4. Возникновение и экспансия аномальных округлых клеток на фоне веретеновидного монослоя.
По истечении 201 суток образовался густой монослой, состоящий из клеток веретеновид-ной формы. После этого культуру 21 рассеяли на два пластиковых матраца (1 и 2 ). Куль -
туру поместили на непрерывную видеосъемку (рис. 4).
Анализ видеозаписи продемонстрировал, что клетки округлой формы обладают более
высоким пролиферативным потенциалом, чем клетки веретеновидной формы, которые были практически полностью вытеснены в обоих пластиковых флаконах к 256 суткам культивирования. Можно было предположить, что появление фокусов округлых клеток связано с переводом культуры из стеклянных сосудов Карреля в пластиковые культуральные флаконы. Однако в дальнейшем этот процесс был зарегистрирован и при продолжительном культивировании клеток в стеклянных сосудах.
В ходе данного эксперимента на разреженных участках культуры были зарегистриро-
ваны процессы округления веретеновидных клеток (рис. 5-6). Эти события, в соответствии с полученными ранее данными сотрудников ИГЦ НАН Беларуси по непрерывной видеосъемке клеточных культур, могут быть интерпретированы либо как клеточная гибель, либо округление клеток перед митозом [48-51]. Однако не исключено, что в данном случае происходили процессы возникновения округлых клеточных морфотипов из веретеновидных. Для однозначного выбора из этих возможностей планируется проведение дополнительных исследований.
Рис. 5. Динамика изменения формы клетки на одном участке субстратной пластинки (квадрат 05-2).
Рис. 6. Изменение клеточной формы в процессе митотического деления, в результате которого из веретеновидной клетки образуются две округлые, что может свидетельствовать о симметричной дифференцировке. На 6 сутки произошло временное «обратное слияние» двух дочерних клеток (квадрат 12-7).
Заключение
С помощью компьютерной микроскопии впервые описаны закономерности спонтанной иммортализации и дальнейших изменений клеточной популяции в направлении ракового фенотипа в культурах фибробластов, полученных из эмбриона человека. При длительном культивировании эмбриональных фи-бробластов человека in vitro на первом этапе иммортализации наблюдалось образование чрезвычайно густого монослоя из атипично удлиненных веретеновидных клеток. На втором этапе в веретеновидном монослое образовывались многослойные агрегаты (фокусы). Третий этап заключался в появлении единичных округлых клеток, несвойственных стареющим культурам фибробластов. На четвертом этапе округлые клетки полностью вытесняли веретеновидные. Полученные данные демонстрируют, что веретеновидные клетки являются ранним этапом эволюции фенотипа раковых
клеток. Дифференцировка веретеновидных клеток в округлые происходит не массово, а в некоторых местах ростового субстрата, что свидетельствует в пользу невысокой частоты морфотипических изменений, количественная оценка которой может быть выполнена с помощью параллельной автоматизированной видеосъемки многих участков культуры.
Представляется целесообразным применение продолжительной компьютерной видеомикроскопии живых клеточных культур для исследования закономерностей формирования опухолевого фенотипа клеток и для разработки технологий антираковой терапии, которые направляют генетическую изменчивость раковых стволовых клеток в сторону пролиферативного ограничения и гибели. Полученные данные целесообразно учитывать для разработки методологии поиска новых высокоэффективных средств онкологической терапии и диагностики.
Список использованных источников
1. Шейко, Я.И. Генетически детерминированные изменения фенотипа клеток млекопитающих в стареющих и иммортализи-рованных клеточных популяциях: дис. на соискание ученой степени канд. биол. наук: 13.00.15 / Я.И. Шейко. - Минск, 2007. - 118 с.
2. Molecular Analysis of a Multistep Lung Cancer Model Induced by Chronic Inflammation Reveals Epigenetic Regulation of p16 and Activation of the DNA Damage Response Pathway / D. Blanco [et al.] // Neoplasia. - 2007. - Vol. 9, № 10. - Р. 840.
3. Sunitinib Prolongs Survival in Genetically Engineered Mouse Models of Multistep Lung Carcinogenesis / L. Gandhi [et al.] // Cancer Prevention Research. - 2009. - Vol. 4, № 2. - Р. 330-337.
4. Multistep pathogenesis of leukemia via the MLL-AF4 chimeric gene/Flt3 gene tyrosine kinase domain (TKD) mutation-related enhancement of S100A6 expression / H. Yamaguchi [et al.] // Experimental hemantology. - 2009. -Vol. 37, № 6. - Р. 701-705.
5. Hepatocarcinogenesis: multistep changes of drainage vessels at CT during arterial por-tography and hepatic arteriography-radiologic-pathologic correlation / A. Kitao [et al.] // Radiology. - 2009. - № 2. - Р. 605-614.
6. Hino, O. Multistep renal carcinogenesis in the Eker (Tsc 2 gene mutant) rat model / O.Nino // Current molecular medicine. - 2004. - № 8. - Р. 807.
7. Vincent, T.L. An evolutionary model for initiation, promotion, and progression in carci-nogenesis / T.L.Vincent, R.A. Gatenby // International Journal of Oncology. - 2008. - Vol. 32, № 4. - Р. 729-737.
8. Hanahan, D. The hallmarks of cancer / D. Hanahan, R.A. Weinberg // Cell. - 2000. -Vol. 100. - P. 57-63.
9. Агеенко, А.И. Новая диагностика рака: теория, диагностика, лечение, реабилитация / А.И. Агеенко. - Москва: Медицина XX, -2004. - 408 с.
10. Troshko, J.E. Cancer stem cells and cancer nonstem cells: from adult stem cells or from reprogramming of differentiated somatic cells // Veterinary Pathology. - 2009. - Vol. 46, № 2. - Р. 180.
11. Frank, S.A. Dynamics of сancer: incidence, inheritance, and evolution / S.A. Frank. - Princeton: Princeton University Press; 2007. - Р. 36-58.
12. Reddel, R. The role of senescence and immortalization in carcinogenesis / R. Reddel // Carcinogenesis. - 2000. - Vol. 21, № 3. - Р. 477.
13. Perryman, L.E. Animal models: Molecular
pathology of severe combined immunodeficiency in mice, horses, and dogs / L.E. Perryman // Veterinary Pathology. - 2004. - Vol. 41, № 2. - P. 95-97.
14. Expression profiles of SV40-immortaliza-tion-associated genes upregulated in various human cancers / H.M. Jung [et al.] // Journal of Cellular Biochemistry. - Vol. 106, № 4. - P. 703-705.
15. Jorgensen, M.K. The Influence of SV40 Immortalization of Human Fibroblasts on p53-Dependent Radiation Responses / M.K. Jorgensen, J. Timothy // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2002. -Vol. 257, № 1. - P. 168.
16. Knockdown of p53 combined with expression of the catalytic subunit of telomerase is sufficient to immortalize primary human ovarian surface epithelial cells / G. Yong [et al.] // Carcinogenesis. - 2006. - Vol. 28, № 1. - P. 174.
17. C-myc Overexpression Causes Anaplasia in Medulloblastoma / D. Stearns [et al.] // Cancer Research. - 2006. - Vol. 66, № 2. - P. 673.
18. Suri, C. The Immunohistochemical Evaluation Of The Expression Of Bcl-2 In Different Histological Grades Of Squamous Cell Carcinoma / C. Suri // Journal of Clinical and Diagnostic Research. - 2009. - № 3. - P. 189.
19. Expression of activated M-Ras in hemopoietic stem cells initiates leukemogenic transformation, immortalization and preferential generation of mast cells / X.Guo [et al.] // Oncogene.
- 2006. - Vol. 25, № 30. - P. 441.
20. The expression and significance of proto-oncogene c-fos in viral myocarditis / S.Zhang [et al.] // Virology Journal. - 2010. - Vol. 7, № 1. - P. 285.
21. Lele, R.D. Epigenetics - gene silencing / R.D. Lele // The Journal of association of physicians of India. - 2009. - Vol. 60. - P. 60.
22. Marusyk A. Tumor heterogeneity: Causes and consequences / A. Marushak, K. Polyak // Biochimica et Biophysica Acta. - 2010. -Vol. 1805, № 1. - P. 105-117.
23. Genetic and epigenetic heterogeneity in cancer: the ultimate challenge for drug therapy / H.H. Heng [et al.] // Current drug target. - 2010.
- № 10. - P. 304.
24. Cellular and genetic diversity in the progression of in situ human breast carcinomas to an invasive phenotype / K. Polyak [et al.] // The Journal of Clinical Investigation. - 2010. -Vol. 120, № 2. - R 636-644.
25. Rubin, H. Cell-cell contact interactions conditionally determine suppression and selection of the neoplastic phenotype / H. Rubin // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2008. - Vol. 105, № 17. - P. 6215-6221.
26. Разработка клеточных тест-систем для создания полинуклеотидных антираковых препаратов / О.В. Квитко [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика. - 2008. - Т. 7.
- С. 18-19.
27. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice / J.Dick E. [et al.] // Nature. - 1994. - Vol. 367.
- P. 645-648.
28. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells / M.F. Clarke [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences.
- 2003. - Vol. 100-107. - P. 3983-3988.
29. Cancer stem cells: the theory and perspectives in cancer therapy / J. Gil [et al.] // Journal of Applied Genetics. - 2008. - Vol. 49, № 2. -Р. 193-199.
30. Beyond tumorigenesis: cancer stem cells in metastasis / Li Feng [et al.] // Cell Research. -2006.- P. 1-12.
31. Cancer stem cells - old concepts, new insights / L. Vermeulen // Nature: Cell Death and Differentiation. - 2008. - Vol. 15. - P. 947-958.
32. Reprogramming metastatic tumour cells with embryonic microenvironments / M.J.C. Han-drix [et al.] // Nature. - 2007. - Vol. 7 - P. 248.
33. Биология стволовых клеток и клеточные технологии в 2 т. / под ред. М.А. Пальцева.
- М.: ОАО «Издательство «Медицина», издательство «Шико», 2009. - Т. 1. - С. 212.
34. Bypass of senescence, immortalization, and transformation of human hematopoetic progenitor cells / S.S. Akimov [et al.] // Stem Cells.
- 2005. - Vol. 23. - P. 1423-1433.
35. Recurrence cancer stem cells - made by cell fusion? / T. Dittmar [et al.] // Medical hypothesis. - 2009. - Vol. 73, № 4. - P. 542.
36. Wurmser, A.E. Cell fusion causes confusion / A.E. Wurmser, F.H. Gage // Nature. -2002. - Vol. 416. - P. 485-487.
37. Alvarez-Dolado, M. Cell fusion: biological perspectives and potential for regenerative medicine/ M. Alvarez-Dolado // Frontiers in Bioscience. - 2007. - Vol. 12. - P. 1-12.
38. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and he-
patocytes / M. Alvarez-Dolado[et al.] // Nature.
- 2003. - Vol. 425. - P. 968-973.
39. Cell fusion of bone marrow cells and somatic cell reprogramming by embryonic stem cells / S. Bonde [et al.] // The Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. - 2010. - Vol. 24. - P. 364-365.
40. Jordan, C.T. Mechanisms controlling pathogenesis and survival of leukemic stem cells / C.T. Jordan, M.L. Guzman // Oncogene.
- 2004. - Vol. 23. - P. 7178-7187.
41. Epigenetic codes in stem cells and cancer stem cells / Y. Yamada [et al.] // Advances in genetics. - 2010, Vol. 70. - P. 77-83.
42. Исследование роли аномальных митозов в процессе раковой трансформации / Я.И. Шейко [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика. - 2008. - Т. 7. - С. 143-147.
43. Sell, S. Stem cell origin of cancer and differentiation therapy / S. Sell // Critical Reviews in Oncology / Hematology. - 2004. - Vol. 51.
- P. 1-28.
44. Differentiation therapy of human cancer: basic science and clinical applications / M. Leszczyniecka [et al.] // Pharmacology and Therapeutics. - 2010. - Vol. 90. - P. 105-115.
45. Simons J.W. Genetic, epigenetic, dysge-netic, and non-genetic mechanisms in tumori-genesis / J.W. Simons // Critical Reviews in Oncogenesis. - 1995. - Vol. 6, № 3-6. - P. 261-273.
46. Сапун, А.С. Витальная видеомикроскопия живых клеточных культур как метод анализа процессов иммортализации и раковой транс-
формации / А.С. Сапун // Биология: от молекулы до биосферы: материалы V Международной конференции молодых ученых, Харьков, 22-25 ноября, 2010 г / Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина; редкол: Л.И. Воробьева [и др.]. - Х.: «Оперативная полиграфия», 2010. - C. 64-66.
47. Hayflick, L. The serial cultivation of human diploid cell strains / L. Hayflick, P.S. Moor-head // Experimental Cell Research - 1961. -Vol. 25. - P. 177-185.
48. Компьютерная видеомикроскопия живых клеток / под ред. С.Е. Дромашко [и др.].
- Мн.: ИПНК, 2010. - 37 с.
49. Разработка методов компьютерной видеомикроскопии живых клеток для медицинской трансплантологии, биотехнологии животных и токсикологии / О.В.Квитко [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика. - 2009.
- Т. 10. - C. 89.
50. Hunting the mechanisms of self-renewal of immortal cell populations by means of realtime imaging of living cells / O.V. Kvitko [et al.] // Cell Biology International. - 2005. - Vol. 29.
- P. 1019-1024.
51. Kvitko, O.V. Time-lapse microscopy of living cells in vitro / O.V. Kvitko, I.I. Koneva, YI. Sheiko // Optical Techniques and Nanotools for Material and Life Sciences: Proceedings of the International Conference, Minsk, 15-19 June 2010. / B.I. Stepanov Institute of Physics Natioanal Academy of Sciences of Belarus; editorial board: N.S. Kazak, Ch. Boller [et al.] - P. 220-223.
Дата поступления статьи 21 февраля 2011 г.
