CC BY
13УДК [51-76+004.9]:[576.535+61+636.2+615] О.В. Квитко, И.И. Конева, Я.И. Шейко, В.Д. Трусова, С.Н. Шевцова, Н.А. Балашенко, А.С. Сапун, С.Е. Дромашко
РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ КОМПЬЮТЕРНОЙ ВИДЕОМИКРОСКОПИИ ЖИВЫХ КЛЕТОК ДЛЯ МЕДИЦИНСКОЙ ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ, БИОТЕХНОЛОГИИ ЖИВОТНЫХ И ТОКСИКОЛОГИИ
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Компьютерная видеомикроскопия живых клеток является перспективным современным методом исследования таких фундаментальных биологических процессов как клеточное старение, дифференцировка и раковая трансформация. Кроме того, выполняемый с помощью этого метода детальный анализ процессов пролиферации, дифференцировки и гибели отдельных клеток и их клонового потомства важен для разработки клеточных технологий в медицинской трансплантологии, сельском хозяйстве и охране окружающей среды.
Нами разработаны высокоэффективные методы витального анализа эффектов внешних факторов на культивируемые клетки человека и животных, основанные на учете событий в клеточной популяции во времени, причем для получения детальной информации используется непрерывная круглосуточная компьютерная видеозапись одного участка культуры клеток в течение ряда дней. Видеозапись живых клеточных культур выполняется с помощью инвертированного микроскопа и видеокамеры, соединенной с компьютером.
Открытие явления старения клеток in vitro, т. е. затухания клеточного деления и последующей гибели клеток связано с работой Леонарда Хайфлика [1]. В работах немецких исследователей под руководством Клауса Байройтера [2] сообщалось, что в культурах фибробластов человека и животных, которые ранее считались гомогенными клеточными популяциями, происходят процессы семистадийной дифференци-ровки, приводящие к накоплению постмито-тических клеток. Если бы схема Байройтера была подтверждена, она могла бы служить
удобной моделью для изучения эпигенетических механизмов дифференцировки и старения, а также раковой трансформации клеток. С помощью прижизненной компьютерной видеомикроскопии мы исследовали вопрос о существовании поэтапного изменения клеточного морфотипа в культурах эмбриональных фибробластов человека и мыши. На основании полученных видеозаписей в течение ряда последовательных митотических делений нами были составлены клеточные генеалогии, напоминающие родословные в генетике человека. Клетки-родоначальницы и их потомки в течение ряда поколений изучались по многим признакам. Учитывалось до 20 параметров, таких как площадь и форма клетки, моменты митоза или клеточной гибели, аномальные митозы, размер и количество ядер, процессы клазма-тоза (отделения фрагментов цитоплазмы), скорость и характер перемещений клеток. Было установлено, что в популяциях фибробластов человека и мыши отсутствуют морфотипы, которые эпигенетически наследуются в клеточных поколениях [3].
Человек и мышь - виды млекопитающих, контрастные по продолжительности жизни, а также частоте возникновения онкологических заболеваний, которая у грызунов на несколько порядков выше, чем у человека [4]. Выяснение причин этих огромных межвидовых различий принципиально важно для познания механизмов старения и возникновения раковых заболеваний. В этой связи представляют интерес наши исследования взаимосвязи между клеточной пролиферацией и размером клетки в культурах фибробластов человека и мыши [5]. При изучении зависимости митотической
активности от площади клеток было отмечено, что у фибробластов человека не делятся наиболее крупные клетки, чья площадь превышала 2300 мкм2. В то же время в культуре фибробластов мыши крупные клетки делились так же активно, как клетки малых размеров. На наш взгляд, это явление объясняется тем, что в клетках человека имеется более надежная система регуляции пролиферации, ограничивающая деление крупных клеток. Среди больших клеток чаще встречаются постаревшие и полиплоидные клетки, которые при делении с большей вероятностью могут продуцировать дисфункциональные или трансформированные клетки. Тот факт, что крупные клетки человека не делятся, в отличие от крупных клеток мыши, может быть причиной резких различий данных видов млекопитающих в скорости старения и частоте раковой трансформации [5].
В соответствии с концепцией о неозисе, предложенной канадским исследователем Р. Раджараманом, от крупных полиплоидных клеток посредством немитотического цитокинеза могут отделяться мелкие клетки, обладающие высоким пролиферативным потенциалом [6]. Однако в нашей работе при анализе видеозаписей стареющих и иммортальной клеточных культур не встречалось ни одного случая образования клеток немитотическим путем [7-8]. Исследователи, описывающие такой тип клеточного деления, на самом деле могли наблюдать процесс клазматоза, т.е отделение участков безъядерных фрагментов цитоплазмы.
По нашему мнению, образование трансформированных клеток может происходить путем аномальных митотических делений, а не посредством процесса неозиса. При аномальных митозах, приводящих к нарушению хромосомного состава, может происходить амплификация онкогенов и потеря гетерозиготности генов - супрессоров клеточного деления, что ведет к образованию трансформированных клеток. Для анализа данного вопроса мы провели исследования на иммортализированной линии, полученной нами в процессе культивирования фибробластов из эмбрионов линейных мышей А£ Изучали роль аномальных митозов в образовании клеток с увеличенным пролиферативным потенциалом, а также суб-
клональную гетерогенность иммортальной культуры в отношении пролиферации и гибели клеток [7-8].
Был проведен эксперимент по продолжительной видеозаписи участка иммортальной культуры. С помощью специально разработанной компьютерной программы, позволяющей маркировать клетки и регистрировать различные клеточные параметры (данная программа включена в государственный регистр информационных ресурсов), была проанализирована видеозапись, соответствующая 15 суткам реального времени. В результате составлена клеточная генеалогия, включающая до 8 поколений клеток. Выяснилось, что клетки, возникшие в результате аномальных (трехполюс-ных и асимметричных биполярных) митозов, обычно не погибают, а напротив, способны к активному делению, что особенно ярко демонстрируется трехполюсными делениями. Возникающие в результате трехполюсного митоза три дочерние клетки, как правило, обладали высокой пролиферативной способностью и генерировали субклоны. Таким образом, аномалии митотического деления, с повышенной вероятностью приводящие к хромосомным нарушениям, могут вносить вклад в поддержание иммортализированного состояния и вести к прогрессии канцерогенеза.
В культурах полученной нами имморталь-ной линии образовывались очаги аномального многослойного роста клеток, которые отмечали другие исследователи на постоянных линиях [8]. Нами было запланировано изучить формирование многослойных клеточных очагов для проверки данных литературы о том, что такие очаги формируются путем клонального размножения единичных мутировавших клеток. Многослойные клеточные скопления образовывались в результате агрегации, а не за счет клонального размножения мутировавших клеток. Так было установлено, что свойство образовывать многослойные агрегаты из отдельных живых клеток характеризует всю иммортальную популяцию, а не обусловлено локальной пролиферацией мутировавших клеток.
Одним из подходов к исследованию эпигенетических механизмов старения и раковой трансформации является использование маркеров, характеризующих экспрессию генов. В
этой связи представляет интерес молекулярный маркер клеточного старения - экспрессия гена бета-галактозидазы. Результаты наших исследований свидетельствуют о целесообразности сочетания методов компьютерной видеомикроскопии живых клеток и данного теста.
Количество клеток, экспрессирующих бета-галактозидазу, повышается при старении в тканях организма и в клеточных культурах [9]. В литературе имеются также данные о проявлении этого маркера не только в стареющих, но и в иммортальных клеточных популяциях in vitro, а также в опухолях в организме. В нашей работе было выполнено сравнение экспрессии гена бета-галактозидазы в нормальных и иммортализированных клеточных культурах [9]. Полученные данные свидетельствовали о присутствии в иммортальных популяциях двух субпопуляций - стволовой линии и фракции стареющих клеток, чему соответствуют и результаты анализа клеточной генеалогии иммортальной культуры. Так, клоновое потомство одних клеток характеризовалось высокой пролиферативной активностью, в то время как другие клоны в основном были представлены медленно делящимися клетками. Следовательно, в иммортализированной популяции могут существовать субклоны, в которых ослабление пролиферативной активности наследуется и прогрессирует, что может положительно коррелировать с экспрессией маркера клеточного старения, каким является ген бета-галактозидазы.
Важным аспектом антираковой терапии является гетерогенность популяции раковых клеток. Клеточная фракция, представленная раковыми стволовыми клетками, может отвечать за неограниченную пролиферацию опухоли. Нами разработаны методы анализа клоновой структуры клеточных популяций на основе
компьютерной видеомикроскопии живых клеток. Установлено, что часть клеток линии рака легкого А549 формирует клоны, которые после нескольких репликаций стареют и погибают, в то время как другие клетки (иногда небольшая часть) генерируют бесконечно растущие (потенциально бессмертные) клоны [11]. В этой связи особый интерес имеет поиск средств эпигенетической терапии, индуцирующих дифференцировку раковых стволовых клеток в направлении клеточного старения и гибели. Натуральные и синтетические полинуклео-тиды (ДНК и РНК) являются перспективным источником для создания антираковых препаратов. Нами обнаружен резко выраженный ин-гибирующий эффект ДНК эритроцитов цыплят (100 мкг/мл), добавляемой в среду для культивирования клеток НеЬа [12]. Представляется целесообразной разработка клеточных систем для подбора полинуклеотидных препаратов (варьирующих по нуклеотидной последовательности и размеру фрагментов), а также других средств, направляющих эпигенетическую изменчивость раковых клеток в сторону проли-феративного старения и гибели.
В настоящей работе представлены полученные с помощью компьютерной видеомикроскопии живых клеток результаты наших исследований, направленных на разработку клеточных технологий для медицинской трансплантологии, животноводства и токсикологии. Приведены данные о получении линии клеток из фолликулов волос человека, способных к нейральной дифференцировке, а также линии клеток гранулезы яичника коров. Кроме того, на примере клазматоза (процесса отделения фрагментов цитоплазмы) показано, что компьютерная микроскопия может способствовать выбору тестов для токсикологического мониторинга.
Материалы и методы
Получение и анализ культуры клеток из фолликулов волос человека. Несколько (1-5) волос на зытылочной части головы захватывали пинцетом (ближе к концам волос, а не к коже) и извлекали резким движением. При этом значительная часть волос извлекалась вместе с фолликулами. Фолликулы от 10 волос отрезали стерильными ножницами и помещали в
центрифужную пробирку с раствором Хэнкса с 10-кратной (по сравнению с обычной при культивировании клеток) концентрацией (5 мкг/мл) антибиотиков (пенициллина, стрептомицина, гентамицина и амфотерицина В). После 30 минут выдерживания в концентрате антибиотиков при комнтной температуре и центрифугирования (1000 об./мин, 10 мин.)
удаляли супернатант и для отмывания антибиотиков добавляли раствор Хэнкса, снова выполняли центрифугирование и удаляли су-пернатант.
Фолликулы помещали в небольшой культу-ральный сосуд и добавляли ростовую среду (1,5 мл), состоящую из среды Игла, 10% сыворотки эмбриона телят и 10% стерилизованной фильтрацией жидкости из фолликулов яичника коров, а также пенициллина и стрептомицина (0,5 мкг/мл). После добавления СО2 (5% от объема сосуда) с помощью шприца сосуд герметически закупоривали резиновой пробкой, и материал фолликулов культивировали при 37оС. В дальнейшем в процессе культивирования анализировали культуру с помощью инвертированного микроскопа, а при нахождении отдельных клеток и небольших клеточных групп выполняли их компьютерную видеосъемку с целью проверки их жизнеспособности и пролиферативной активности. После получения размножающейся культуры пересевы в новые каррели выполняли без применения трипсина, переносом культуральной среды, содержащей суспензию открепившихся от ростовой поверхности пролиферативно активных единичных клеток и клеточных агрегатов.
Для дифференцировки клеток использовали временное (в течение несколькх дней) культивирование при пониженной температуре (30оС). Обратный перенос культуры в норманые температурные условия производили после начала значительной гибели клеток, что регистрировали компьютерным фотографированием выбранных участков ростового субстрата с клетками в разные сроки культивирования. Таким же способом учитывали пролиферацию, гибель и дифференци-ровку клеток. Дополнительные процедуры изложены в разделе «Результаты и обсуждение». Для непрерывной компьютерной видеосъемки в термостатируемую (37оС) камеру инвертированного микроскопа. Видеосъемку живых клеток выполняли с частотой 1 кадр в минуту.
Получение и анализ культуры клеток гра-нулезы из фолликулов яичника коров. Яичники, полученные на Минском мясокомбинате, после транспортировки в растворе Хэнкса с десятикратной концентрацией антибиотиков
(см. выше) трижды промывали тем же раствором. Фолликулярную жидкость, содержащую клетки гранулезы, получали посредством аспирации фолликулов с помощью шприца. Фолликулярную жидкость центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин (для отделения клеток гранулезы) и фильтровали через милли-поровый бактериальный фильтр (0,2 мкм) для дальнейшего использования в качестве добавки к культуральной среде, а клетки гранулезы трижды отмывали от фолликулярной жидкости (суспендировали осадок клеток в растворе Хэнкса и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут). После суспендирования в культуральной среде (Среда RPMI + 10% сыворотки эмбриона телят + антибиотики) клетки помещали в культуральный сосуд, добавляли 5% СО2, сосуд герметически закупоривали и культивировали клетки при 37оС. В некоторых экспериментах осуществляли компьютерную видеозапись (см. выше).
Изучение цитогенетических эффектов диа-зиквона на клетки линии рака легкого А549. Клетки высевали при малой плотности (для удобства анализа под микроскопом) в культу-ральной среде (Среда RPMI + 10% сыворотки эмбриона телят + антибиотики) в культураль-ные сосуды с вкладышами, изготовленными из стандартных предметных стекол (slides) толщиной 1 мм. После добавления СО2 (5% объема) с помощью шприца сосуды герметически закупоривали и культивировали клетки при 37оС.
После 2 дней культивирования в опытные культуральные флаконы добавляли концентрат диазиквона (0,1 мг/мл в культуральной среде RPMI, растворение проводили с использованием водяной бани при 60оС), предварительно отбирая из флаконов соответствующие объемы культуральной среды. Затем клеточные культуры снова выращивали при 37оС в течение 2 дней, после чего клетки на стеклянных вкладышах фиксировали в восходящих растворах этанола (24, 48 и 96%) и окрашивали по Гимза. Стекла с окрашенными клетками высушивали на воздухе при комнатной температуре и анализировали препараты с помощью микроскопа.
Дополнительные детали методики приведены в следующем разделе статьи.
Результаты и обсуждение
Получение и анализ культуры клеток из фолликулов волос человека. Перспективы развития клеточных технологий для лечения ряда заболеваний во многом зависят от разработки нетравматичных и экономичных методов получения значительных количеств аутологичных (собственных) клеток, культивируемых in vitro. Применение именно аутоло-гичных клеток особенно важно, поскольку при этом устраняются проблемы, связанные с иммунными реакциями, вызываемыми введением в организм генетически инородного клеточного материала. В этом плане наиболее перспективным представляется продуцирование vitro клеток из фолликулов волос человека, которые являются источником мультипотентных стволовых клеток или клеток-предшественников, способных в подобранных условиях культивирования дифференцироваться в клетки различных типов, включая нервные [13]. Особый интерес с практической точки зрения вызывает возможность получения аутологичных клеток не обычнам методом, требующим хирургического иссечения участка скальпа [13], а из фолликулов выщипываемых волос [14]. При этом важно разработать методы культивирования, обеспечивающие массовую наработку клеток in vitro из небольшого количества фолликулов (в идеале из одного).
При получении культуры клеток из малого количества исходного материала тщательный мониторинг клеточных культур с помощью компьютерной видеомикроскопии значительно повышает эффективность работы, поскольку при отсутствии условий культивирования, оптимизированных для нового источника клеток, критически важным является обнаружение хотя бы одного небольшого пролифе-рирующего клона, из которого можно в дальнейшем получить клеточную линию.
В нашей работе после 1 дня культивирования фолликулов волос в культуре была обнаружена небольшой компактная группа округлых клеток (приблизительно 20), которая могла появиться за такой короткий срок не путем деления одной клетки на субстрате, а в результате прикрепления и распластывания клеточного агрегата, находящегося во взвеси в культуральной среде. Компьютерная виде-
осъемка этой группы клеток в течение 1 дня позволила зарегистрировать 2 митотических деления, а еще через 3 дня число клеток увеличилось почти в 3 раза.
В течение нескольких следующих дней в культуре было найдено еще несколько небольших групп клеток, которые, по-видимому, также прикрепились к субстрату из культуральной среды. Однако видеосъемка зарегистрировала постепенное затухание делений, а также медленную конденсацию и обездвиживание клеток.
После 12 дней культивирования была обнаружена относительно крупная компактная группа клеток (средний диаметр приблизительно 150 мкм), прикрепленная к фрагменту волоса (длиной приблизительно 1 мм). В дальнейшем эта группа клеток увеличивалась, занимая все большую площадь. Через 2 дня для стимулирования клеточных делений в куль-туральный сосуд была добавлена жидкость из фолликулов яичника коров, обладающая пролиферативным эффектом на клетках гранулезы (см. ниже). Для этого в культуральном флаконе третью часть среды заменили фолликулярной жидкостью. На 26 день клеточный агрегат значительно вырос (средний диаметр приблизительно 1 мм), причем увеличилась не только площадь, но и (судя по увеличению оптической плотности) толщина клеточного агрегата. Затем с увеличением клеточного агрегата на различных участках ростовой поверхности появились вторичные агрегаты и одиночные клетки, формирующие клоны. Это происходило в результате открепления в среду клеток и небольших клеточных скоплений от первого агрегата и последующего распластывания на субстрате. Таким образом, была получена характерная для линий стволовых клеток полусуспензионная клеточная культура, растущая как на субстрате, так и в среде. Такие культуры удобно размножать без использования трипсина (который используется для снятия клеток с ростового субстрата), путем перенесения среды с клетками в новый культуральный сосуд. Отдельные клетки или небольшие агрегаты, прикрепляясь к субстрату, быстро пролиферировали (рис. 1) и формировали новую культуру.
а. 0 дней
б. 2 дня
в. 4 дня
г. 6 дней
Рис. 1. Рост клона клеточной линии из фолликулов волос человека.
В дальнейшем (после 2 месяцев от начала культивирования фолликулов) посредством переноса среды с клетками в новые флаконы были получены культуры, поддерживаемые ежедневной сменой среды (включающей среду Игла, 10% эмбриональной сыворотки телят, 10% жидкости из фолликула яичника коров и антибиотики). Для экспериментов использовали культуры, полученные переносом среды с клетками.
Было отмечено, что в некоторых культурах, в которых среду длительно (в течение нескольких недель) не меняли, наряду с гибелью части клеток происходила дифферен-цировка, при которой появлялись клетки, морфологически сходные с нейральными (нейронами и олигодендроцитами), а также клетки с крупными вакуолями, занимающими большую часть клеточного объема. Видеозапись позволила заключить, что эти клетки являются постмитотическими, т.е. утрачивают способность к делению.
Для прекращения делений клеток и инду-
цирования дифференцировки предварительно выращенные при 37оС культуры переносили в термостат с пониженной температурой (30оС). Этот прием использован нами на основании сообщения о дифференцировке стволовых клеток тератокарциномы мыши при температуре 31 оС [15]. Культивирование клеток при пониженной температуре применяется также в производстве рекомбинантных белков [16].
В одном из экспериментов клетки были посеяны при малой плотности и культивиро-вались при 37оС. Через 6 дней из небольших клеточных агрегатов и отдельных клеток сформировалиь многоклеточные клоны, после чего культивирование продолжали при 30оС. Ежедневно выполняли компьютерное фотографирование 29 участков ростовой поверхности.
В течение первых 10 дней культивирования при 30оС на всех участках происходило массовое изменение клеток в направлении нейральной дифференцировки, что проявлялось в появлении тонких длинных выростов, характерных для нейральных клеток. Степень изменения клеток
увеличивалась день за днем, но к 16 дню количество клеток начало уменьшаться.
После 19 дней культивирование продолжали при 37оС. Дифференцированные клетки не делились и нередко достигали очень крупных размеров, существуя в культуре до нескольких десятков дней. При этом были установлены некоторые неизвестные ранее особенности процесса дифференцировки.
На рисунке 2 представлен процесс формирования дендритоподобных выростов на протяжении 6 дней.
Часто обнаруживались пары близко расположенных очень сходных по морфологии дифференцированных клеток, связанных друг с другом посредством межклеточных контактов. Это свидетельствует о симметричной диффе-ренцировке, при которой дифференцируются обе сестринские клетки (рис. 3). В этом плане следует отметить, что в последние годы
появились работы, демонстрирующие случаи симметричной дифференцировки стволовых клеток [17], хотя ранее полагали, что диффе-ренцировка происходит только асимметричным путем, когда дифференцируется одна из двух сестринских клеток.
Было также зарегистрировано слияние двух сестринских дифференцированных клеток в двуядерную клетку (сохранивших связь в виде тонкой нитевидной цитоплазматической перетяжки), причем оба ядра располагались рядом (рис. 4). Данное наблюдение демонстрирует один из механизмов образования постмито-тических полиплоидных клеток.
Таким образом, показана возможность получения перспективных для аутологичной трансплантации культур клеток, способных к дифференцировке, из небольшого количества фолликулов волос, легко извлекаемых без травматичных хирургических процедур.
Рис. 2. Нейральная дифференцировка в клеточной линии из фолликулов волос человека.
Рис. 3. Симметричная нейральная дифференцировка в клеточной линии из фолликулов волос человека. Дифференцированные сестринские клетки часто удерживаются рядом
дентритоподобными выростами цитоплазмы.
а. 0 дней
б. 1 день
в. 2 день
г. 3 день
Рис. 4. Слияние двух сестринских симметрично дифференцированных клеток из фолликулов волос человека с образованием двуядерной клетки. Две одноядерные сестринские дифференцированные клетки сохраняют связь посредством тонкого тяжа цитоплазмы (а), а затем сливаются в одну клетку с двумя ядрами (б - г), причем на третий день (г) ядра с ядрышками (светлые зоны с темными точками) находятся рядом (на снимке они расположены вверху слева от вакуолей). Стрелками указаны ядра.
Получение и анализ культуры клеток гра-нулезы из фолликулов яичника коров. Важнейшим ресурсом повышения эффективности производства животноводческой продукции являются технологии продукции in vitro эмбрионов для последующей трансплантации животным-реципиентам. Этот подход направлен на максимальное использование генетического потенциала отдельных, наиболее высокопродуктивных доноров яйцеклеток. Практическая реализация данного метода в значительной степени тормозится недостаточно высоким выходом зародышей, достигших стадии бластоцисты и пригодных для трансплантации. Для преодоления раннего блока дробления и развития эмбрионов до стадии бластоцисты представляется перспективным использование совместного культивирования зародышей с культурами соматических клеток, получаемых из репродуктивного тракта животных того же вида, что и яйцеклетки -например, клеток яйцевода, кумулюса или гранулезы, находящихся в фолликулярной жидкости, окружающей ооцит-кумулюсные комплексы. «Поддерживающие» культуры могут создавать благоприятный для развития зародышей сигнально-информационный фон путем продукции ростовых факторов. Это определяет актуальность разработки методов культивирования клеток гранулезы для использования в технологии продукции эмбрионов животных.
Для получения культуры клеток гранулезы коров нами был принят модифицированный метод Langhout et al. [18]. Существенной особенностью использованного нами подхода является добавление в культуральную среду фолликулярной жидкости (стерилизованной фильтрацией через бактериальный фильтр). Этот прием был использован на основании данных швейцарского исследователя Мишеля Хорисбергера (M. Horisberger) о том, что в фолликулярной жидкости содержатся вещества, ингибирующие апоптоз и стимулирующие пролиферацию клеток [19], несмотря на то, что Хорисбергер работал с фолликулами свиней, а не крупного рогатого скота.
Культуры гранулезных клеток анализировали с помощью компьютерной видеосъемки. Было обнаружено, что добавление фолликулярной жидкости к культуральной среде
обеспечивает интенсивную пролиферацию клеток и возможность их продолжительного культивирования без признаков клеточного старения. Так, в течение первых 10 дней культивирования при добавлении к среде трети фолликулярной жидкости образовался густой клеточный монослой, а затем были получены длительно культивируемые культуры, поддерживаемые не только с помощью трипсино-вых пересевов, но и менее трудоемким приемом - еженедельной сменой среды в одном и том же культуральном сосуде. В то же время без применения фолликулярной жидкости клетки сначала размножаются, но затем быстро стареют, то есть увеличиваются в размерах и прекращают делиться.
Особенно интересно, что фолликулярная жидкость оказалась эффективной не только при ее исходном добавлении в культуральную среду. Добавление одной трети фолликулярной жидкости обеспечивало ярко выраженный омолаживающий эффект на постаревшие клетки. Так, в одном из экспериментов клетки гранулезы после 13 дней культивирования без добавлении фолликулярной жидкости прекратили пролиферацию и приобрели увеличенный размер и морфологию, характерную для постаревших клеток. Однако добавление среды с содержанием третьей части фолликулярной жидкости после очередных 8 дней культивирования привело к возобновлению пролиферации, и количество клеток увеличилось. На компьютерных видеозаписях было обнаружено много митотических делений, причем в деление вступали не только мелкие, но и крупные постаревшие клетки (рис. 5). В дальнейшем (наблюдение до 40 дней) в данную культуру при еженедельной смене среды добавляли 10% фолликулярной жидкости. В течение этого срока в культуре увеличивалось количество густых монослойных участков.
Таким образом, разработан способ получения долговременной культуры клеток гра-нулезы из фолликулов яичника крупного рогатого скота на основе использование стерилизованной фильтрацией жидкости из фолликулов яичника коров.
Изучение цитогенетических эффектов диа-зиквона на клетки линии рака легкого А549. Культуры клеток человека находят широкое применение в практике токсикологических
испытаний по выявлению способности ряда ксенобиотиков оказывать цитопатические и генотоксические эффекты. С помощью компьютерной видеомикроскопии, при условии отработанных методических приемов, можно с высокой количественной точностью изучать воздействие химических веществ на пролиферацию, апоптоз, дифференцировку
и характер локомоторной активности клеток. Все эти характеристики связаны с рядом важных физиологических процессов. Например, локомоторная активность важна в иммунном ответе, карциногенезе и метастазировании, заживлении ран и тканевой регенерации, а также в ряде процессов, происходящих при индивидуальном развитии организма.
а. 0ч. 0м.
б. 1ч. 12 м.
в. 2ч. 0м.
г. 4ч. 17м.
Рис. 5. Митотическое деление крупной постаревшей клетки гранулезы из фолликулов яичника коров после добавления третьей части фолликулярной жидкости к культуральной среде. Клетка в центре (а) принимает шаровидную форму (б) и делится на две дочерние клетки (в), которые затем распластываются на ростовом субстрате (г). Соседняя (справа) крупная клетка с высокой оптической плотностью не перемещается, не меняет форму и является погибшей. Стрелками указаны материнская и сестринские клетки.
Прижизненный анализ клеточных популяций может быть высокоээфективным подходом в токсикологическом и фармакологическом тестировании. Так, с помощью разработанной нами методики витального анализа клеток были исследованы эффекты 24-эпибрассинолида на пролиферацию эмбриональных фибробластов человека и мыши [20].
С помощью компьютерной видеомикроскопии мы обнаружили, что в изучении им-мортализированной линии из эмбриона мыши мы обнаружили процесс клазматоза - отделения безъядерных фрагментов цитоплазмы [7-8]. Этот процесс происходил регулярно и при анализе разреженных клеточных культур регистрировался почти в каждом межмитотическом интервале. Функциональное значение клазматоза неизвестно. Выдвинуто предположение о том, что отделение участков цитоплазмы может быть механизмом регуляции клеточного объема и эвакуации шлаков [7].
Полученные нами результаты изучения клазматоза в клеточных культурах позво-
лили обратить особое внимание на один из эффектов, вызываемых антиопухолевым агентом диазиквоном на клетки линии рака легкого А549 (рис. 6). Было обнаружено, что диазиквон в концентрации 1 мкг/мл при воздействии течение 2 суток резко увеличивает долю клеток, находящихся в процессе клазма-тоза. После двухдневного воздействия на клеточную культуру диазиквон в концентрации 0,1 мкг/мл в 7 раз повышал уровень микроядер и в 11 раз - число клеток на стадии клазматоза, а в концентрации 1 мг/мл происходило только резкое увеличение доли клаз-матозных клеток (в 70 раз). Следовательно, количественный учет клазматоза может применяться в токсикологическом тестировании на клеточных культурах.
Перспективы использования компьютерной видеомикроскопии живых клеток в фундаментальных и прикладных исследованиях во многом определяются все более полной автоматизацией как процесса компьютерной видеозаписи, так и обработки компьютерных имиджей [21].
Рис. 6. Диазиквон в концентрации 1мкг/мл при воздействии на клеточную культуру линии А549 в течение 2 суток резко увеличивает долю клеток, находящихся в процессе клазматоза - отделения фрагментов цитоплазмы. Стрелками указаны отделяющиеся от клеток удлиненные выросты цитоплазмы.
Список использованных источников
1. Hayflick L., Moorhead, P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains // Exp. Cell. Res. - 1961. - Vol. 25. - P. 177-185.
2. Bayreuther K., Francz P.I., Gogol J., Hapke C., Maier M., Meinrath H.G. Differentiation of primary and secondary fibroblasts in cell culture systems// Mutation Research. - 1991. -Vol. 256, № 2-6. -P. 233-242.
3. Шейко Я.И., Квитко О.В., Конева И.И., Тюриков А.П. // Доклады НАН Беларуси. -2002. - Т. 46, - № 1. - С. 90-94.
4. Simons, J.W. Genetic, epigenetic, dysge-netic, and non-genetic mechanisms in tumo-ri-genesis // Critical Reviews in Oncogenesis. -1995. - Vol. 6, № 3-6. - P. 261-273.
5. Квитко О.В., Шейко Я.И., Конева И.И., МезенН.И., Тюриков А.П. Исследование причин различной предрасположенности к раковой трансформации клеток человека и
мыши // Известия НАН Беларуси, сер. биол. наук. - 2002, № 2. - С. 61-64.
6. Sundaram M., Guernsey D.L., Rajaraman M.M., Rajaraman R. Neosis: a novel type of cell division in cancer // Cancer Biol. Ther. - 2004. -Vol. 3. - № 2. - P. 207-218.
7. Квитко О.В., Шейко Я.И., Конева ИИ. Анализ неограниченной пролиферации им-мортализированной линии клеток с помощью прижизненной микроскопии. // Доклады НАН Беларуси. - 2005. - Т. 49, № 5. -С. 89-93.
8. Kvitko O.V., Koneva I.I., Sheiko Y.I., Anisovich M.V. Hunting the mechanisms of self-renewal of immortal cell populations by means of real-time imaging of living cells // Cell Biology International. - 2005. - Vol. 29. -P. 1019-imri G.P., Lee X., Basile G., Acosta M., Scott G., Roskelley C., Medrano E.E., Lin-skens M.,
Rubelj I., Pereira-Smith O. e.a. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1995. - Vol. 92. - P. 9363-9367.
9. Квитко О.В., Шейко Я.И., Конева И.И., Анисович М.В. Активность бета-галактозидазы в стареющей и иммортализированной клеточных популяциях // Известия НАН Беларуси, сер. биол. наук. - 2006, № 4. - С. 53-57.
10. Квитко О.В., Шейко Я.И., Конева И.И., Дромашко С.Е. Разработка клеточных тест-систем для создания полинуклеотидных антираковых препаратов // Молекулярная и прикладная генетика. - 2008. - Т. 7. -С. 18-24.
11. Квитко О.В., Жукова Л.Н., Конева ИИ. Антираковый эффект экзогенных нуклеиновых кислот // Доклады АН Беларуси. -1992. - Т. 36, № 7-8. - С. 652-655.
12. Hong Yu, Dong Fang, Kumar S.M., Ling Li, Nguyen T.K., Acs G., Herlyn M., Xiaowei Xu. Isolation of a novel population of multipotent adult stem cells from human hair folli-cles // American Journal of Pathology. -2006. - Vol. 168. - P. 1879-1888.
13. Gho C.G., Braun J.E., Tilli C.M., Neumann H.A., Ramaekers F.C. Human follicular stem cells: their presence in plucked hair and follicular cell culture // Br. J. Dermatol. - 2004. - Vol. 150. -P. 860-868.
14. Cremisi C., Duprey P. Spontaneous differentiation of murine teratocarcinoma stem
cells at low temperature // J. Cell Physiol. -1986. - Vol. 129. - P. 230-236.
15. Kumar N., Gammell P., Meleady P., Henry M., Clynes M. Differential protein expression following low temperature culture of suspension CHO-K1 cells // BMC Biotechnol. - 2008. -Vol. 8. - P. 42.
16. Zwaka T.P., Thomson J.A. Differentiation of human embryonic stem cells occurs through symmetric cell division // Stem Cells. - 2005. -Vol. 23. - P. 146-149.
17. Langhout D.J, Spice L.J., Geisert R. D. Development of a culture system for bovine granulose cells: effects of growth hormone, estradiol, and gonadotropins on cell proliferation, steroidogenesis, and protein synthesis // J. Anim. Sri. - 1991. - Vol. 6. - P. 3321-3334.
18. Horisberger M. A method for prolonged survival of primary cell lines // In Vitro Cellular and Developmental Biology. - 2006. - Vol. 42, № 5-6. - P. 143-148.
19. Конева И.И., Войтович А.М., Наджарян Л.А., Афонин В.Ю., Котеленец А.И., Квит-ко О.В. Эпибрассинолид модифицирует пролиферацию и апоптоз эмбриональных фибро-бластов // Новости медико-биологических наук. - 2005. - № 2. - С. 112-117.
20. Bahnson A., Athanassiou C., Koebler D., Shun T., Shields D., Yu H., Wang H., Goff J., Cheng T., Houck R., Cowsert L. Automated measurement of cell motility and prolifera-tion// BMC Cell Biol. - 2005. - Vol. 6. - P. 19.
Дата поступления статьи 10 апреля 2009 г.
