СИНТЕЗ КОМПОЗИТЫ ФУЛЛЕРЕНА С60 НА ОСНОВЕ АМИНОКИСЛОТ И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

СИНТЕЗ КОМПОЗИТЫ ФУЛЛЕРЕНА Сбо НА ОСНОВЕ АМИНОКИСЛОТ И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВО

ЗАФАРОВ СОРБОН ЗАФАРОВИЧ

Кандидат химических наук, ст. преподаватель кафедры органической химии Таджикский национальный университет

КОДИРОВ МУРОД ЗОКИРОВИЧ

кандидат химических наук, доцент кафедры органической химии Таджикский

национальный университет

МАВЗУНАИ УМАРХОН

Ассистент кафедры органической химии Таджикский национальный университет

Аннотация. Острые респираторные вирусные инфекции(ОРВИ) и грипп являются актуальной проблемой здравоохранения. Вирусы гриппа в этиологической структуре ОРВИ занимают 10-15%. Во время эпидемических вспышек их доля достигает 50% и грипп занимает одно из первых мест среди инфекционных болезней по количеству биологических видов, вовлекаемых в инфекционный процесс. Непредсказуемость и не контролируемость гриппозной инфекции связана с необыкновенной изменчивостью возбудителя в естественных условиях. Новые штаммы вируса, попадая в человеческую популяцию, которая к ним не готова, приводят к развитию эпидемии или пандемии. Современные вакцины не могут решить проблему антигенного шифта вируса гриппа, связанного с механизмом реассортации фрагментов генома.

Каким бы высоким ни был уровень мониторинга заболеваемости гриппом, наступает момент, когда ситуация выходит из-под контроля, поскольку современные вакцины не способны решить проблему антигенного дрейфа вируса гриппа в процессе эволюции [1, 2, 3].

Целью настоящего исследования является изучение в культуре клеток цитотоксического действия и противовирусной активности химических веществ №1 (композита фуллерен Сво с аминокислотами (Gly, Ser, Gys, Lys, Pro, Ley, Met)) в отношении пандемического вируса гриппа А.

Ключевые слова: вирус, аминокислот, композит, фуллерн, клетка, хлорбензол, дихлорбензол, бромбензоле, бромнафталине.

Экспериментальный часть.

Суть данного процесса заключается в следующем: к щелочному раствору ДМФА добавляют смесь аминокислот взятую в 4-10-кратном избытке и при перемешивании по каплям добавляют раствор фуллерена С60 в хлорбензола или дихлорбензоле, бромбензоле или бромнафталине и перемешивают 7-8 ч. при температуре 70-800С.

Продукт самопроизвольно выпадает в виде темно-коричневого осадка. При этом выход композита фуллерен С60 с аминокислотами составляет до 70%. Данный метод удобен тем, что, во-первых, он позволяет получать композиты фуллеро С60 аминокислот с достаточно хорошими выходами и высокой степенью чистоты без применения трудоемких способов очистки.

Во-вторых, на корковую часть фуллерена С60 можно присоединить до семи остатков одинаковых или разных аминокислот. В-третьих, данным способом в реакцию с фуллереном одновременно можно вводить композиции до семи разных аминокислот. В результате аминокислоты, входящие в композитный состав в разном количественном соотношении, могут присоединиться на корковой поверхности фуллерена, образуя #-фуллеро С60 -аминокислотный композитный комплекс с разными количествами аминокислотных остатков с общей формулой N-фуллеро С60 (ff)m[NH-CH(R)-COOH] n .

ОФ "Международный научно-исследовательский центр "Endless Light in Science"

При синтезе соединения (1) в виде композита было взято Gly, Ser, Gys, Lys, Pro, Ley, Met успешно присоединившие к молекуле фуллерена С60.

Синтезированный продукт растворяют в максимальном количестве диметилсульфоксиде, воды и твине.

При хроматографическом исследовании кислотного гидролизата соединения (1) обнаружены аминокислоты Gly, Ser, Gys, Lys, Pro, Ley, Met.

Электрофорез гидролизата продукта (1) проводили на влажной хроматографической бумаге, ватмане №3, MM в буферной системе (триэтиламин: аммиак: метанол: вода -1:1:20:40) при рН 11-12, силе тока 20 мА (400В) в течение 3 ч, проявитель - раствор нингидрина.

Видимую электрофоретическую подвижность соединений (1) определяли по известной формуле [4,5,6,7]:

d • l

U = - см2 / вольт.сек.

v • t

d - Путь, пройденный веществом от линии старта, l - длина полосы бумаги, t - время проведение электрофореза, v - напряжение.

Электрофоретический анализ кислотного гидролизата соединений (1) показал семи окрашенных пятна, относящихся к аминокислотам Ser, Gly, Gys, Lys, Pro, Ley, Met. В качестве свидетелей на электрофоретическую бумагу рядом нанесли растворы Ser (2), Gly (3), Gys (4), Lys (5), Pro (6), Ley (7) Met (8). Все аминокислоты переместились на определенное расстояние по направлению к аноду (рис.1).

В данном случае примесей свободных аминокислот при электрофорезе не обнаружено.

Продукт гидролизата соединений (1) на электрофореограмме показал семи отдельные аминокислоты: Gly, Ser, Gys, Lys, Pro, Ley, Met. Все аминокислоты переместились по направлении к аноду.

Рис.1.

Разделение аминокислот из гидролизатов фуллеро C60(H)6[(Ser, Gly, Gys, Lys, Pro, Ley, Met)] (1) проводили методом электрофореза. Свободные аминокислоты 2-8 приведены в качестве свидетелей.

Гидролизат С60 - Ser, Gly, Gys, Lys, Pro, Ley, Met. Uia =0,00046, Ui6 =0,00137, Uib=0,00183, Uir = 0,00201, Ui, = 0,00247, Uie = 0,00311, Uië = 0,00403, (1). Свидетели (U):

Ser=0,00313 (2), Gly=0.00402(3), Gys=0,002014 (4), Lys =0.001S2 (5), Leu=0,0013S. (6), Pro =0.00045 (7) Met=0,002485 (8).

Биологический свойство композита фуллерен Сб0 с аминокислотами (Gly, Ser, Gys, Lys, Pro, Ley, Met).

В экспериментальной работе использовали клеточную культуру MDCK (Madin-Darby canine kidney) - почки собаки (Canisfamiliaris) породы кокер-спаниель - которая была предоставлена Всероссийской Коллекцией клеточных культур при ФГБУ «HHUpM им. Н.Ф. Гамалеи» Mинздрава России. Культивирование клеток осуществлялось на среде MEM (ИПВЭ РАЖН, РФ) с двойным набором аминокислот, 5 % фетальной телячьей сыворотки крови («HyClone», США), 10 hM глутамина и антибиотиков(4% гентамицин).

Препараты

Композита фуллерен Сб0 с аминокислотами (Gly, Ser, Gys, Lys, Pro, Ley, Met) растворяли в дистиллированной воде - №1;

В качестве препарата сравнения использовали разведенный на поддерживающей среде Озельтамивира карбоксилат (Sigma Algrich, кат. № Y0001340).

Вирусы.

В исследованиях использовали пандемический штамм вируса гриппа А человека, А/Калифорния/7/09 pdm из Государственной Коллекции вирусов РФ при ФГБУ «HHUßM им. Н.Ф. Гамалеи» Mинздрава России.

Вирус культивировали в аллантоисной полости 9-10-дневных куриных эмбрионов (КЭ) в течение 48 ч при 36 "С. Инфекционную и гемагглютинирующую активность вируса определяли согласно методам, рекомендованным ВОЗ [8].

Определение цитотоксического действия препаратов в культуре клеток.

Клетки MДСК, используемые в исследованиях, выращивали в 96- луночных панелях фирмы "Costar" в среде ИГЛА MEM с добавлением 5% фетальной сыворотки телят (HyClone), 10 mM глутамина и антибиотиков до полного монослоя в течение 48 часов. Затем из панелей удаляли надосадочную среду, промывали культуру клеток 2 раза средой MEM с антибиотиком. Кратные разведения растворов всех веществ готовили в 24-луночных планшетах путем раститровывания на 8 лунок, начиная с 10,00-20,00 мг/мл до 0,083-0,166 мг/мл с шагом х2,0 на среде MEM.

Полученные серийные разведения переносили в «глубоколуночный» 96-л планшет (на 1 мл) в соответствии со схемой опыта, и уже оттуда переносили по 100 мкл многоканальной пипеткой в лунки тест-планшетов с клетками. Каждая точка тестировалась в 4 параллельных лунках.

После инкубации клеток с препаратами в течение 48 часов при температуре 37оС визуально оценивали состояние клеточного монослоя. Далее удаляли культуральную среду из планшетов и в каждую лунку к монослою культуры клеток добавляли по 100 мкл РС и 20 мкл раствора тетразолиевого красителя MTS (Promega, кат. № G3581) для определения цитотоксичности клеток. После инкубации в течении 3 часов при 37оС результаты просчитывали на автоматическом ридере BIO-RAD при длине волны 490 нм. Референс фильтр 630 нм. Концентрация препаратов, уменьшающая значение ОП450 на 50% по сравнению с контролем клеток, принималась за 50% цитотоксическую дозу (ЦТД50). Mаксимальная концентрация препаратов, не изменяющая значение ОП450 по сравнению с контролем клеток, принималась за максимально переносимую концентрацию (MH^.

Изучение противовирусной активности препаратов в культуре клеток МДСК.

Изучение действия нетоксичных для клеток MДСК концентраций веществ №1, на репродукцию вирусов гриппа человека А/Калифорния/7/09 pdm было проведено с использованием 2 методов.

В первом методе оценку противовирусной активности препаратов учитывали по снижению инфекционного титра вируса гриппа в культуре клеток MДСК по цитопатическому действию (ЦПД) и в реакции гемагглютинации(РГА). В реакции гемагглютинации

ОФ "Международный научно-исследовательский центр "Endless Light in Science"

использовали 0,5% взвесь эритроцитов из кур, которую получали из 14 -дневных куриных эмбрионов.

Профилактическая схема. Перед заражением вирусом клетки МДСК 2 раза промывали средой без сыворотки и добавляли 2-х кратные концентрации изучаемых препаратов в 100 мкл РС с добавлением трипсина (TPCK treated, Sigma) в концентрации 2 мкг/мл за 24 часа до инфицирования. Через 24 часа инкубирования культуры клеток с препаратами добавляли 10-кратные разведения вируса на РС с добавлением трипсина (TPCK treated, Sigma) в концентрации 2 мкг/мл.

Лечебно-профилактическая схема. Препараты добавляли к культуре клеток МДСК одновременно с вирусом в РС с добавлением трипсина (TPCK treated, Sigma) в концентрации 2 мкг/мл.

Лечебная схема. Перед заражением вирусом клетки МДСК 2 раза промывали средой без сыворотки и добавляли 10-кратные разведения вируса гриппа на РС с добавлением трипсина (TPCK treated, Sigma) в концентрации 2 мкг/мл в объёме 100 мкл. Через 24 часа инкубирования вируса гриппа с культурой клеток МДСК добавляли изучаемые препараты в различных концентрациях в 100 мкл РС с добавлением трипсина (TPCK treated, Sigma) в концентрации 2 мкг/мл.

Во всех экспериментах контроли вирусов и клеток культивировали в этой же среде в СО2 термостате в течение 48 часов при 37 С. Учёт результатов проводили через 48 часов по ЦПД и в РГА.

Во втором методе было изучено вирулицидное действие веществ в культуре клеток MDCK

Вирулицидную активность веществ изучали при их непосредственном контакте с вирусом гриппа человека А/Калифорния/7/2009 (H1N1) pdm 09. Предварительно были приготовлены различные концентрации препарата и заражающая доза вируса. В стерильные пробирки наливали по 0,5 мл соответствующих разведений испытуемых препаратов и вируса. В контрольную пробирку к 0,5 мл соответствующего разведения вируса добавили 0,5 мл среды МЕМ. После тщательного встряхивания штатива с пробирками смесь инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем опредяли геммаглютинирующий титр в данных смесях в сравнении с контролем вируса. Также через 48 часов определяли инфекционный титр вируса в культуре клеток МДСК в контрольном и опытных образцах.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Цитотоксическое действие веществ.

Цитотоксическое действие веществ №1 определяли при инкубации веществ с клетками MDCK в течение 48 часов с использованием красителя MTS и визуальной оценки клеточного монослоя. В экспериментах были использованы вещества в следующих концентрациях: №1 -от 0,156 до 20,0 мг/мл.

На основании данных 3 независимых опытов, полученных при изучении цитотоксического действия исследуемых веществ в культуре клеток МДСК для каждого из исследованных веществ были построены типичные кривые, из которых были определены ЦТД50 (Рис. 2)

120 т

| 0 -I-1-1-1-1-1-1-1—

® 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0,062 0,031

-н

концентрация препарата 1

Рисунок 2. Цитотоксичность вещества 1 для линии клеток MDCK.

Определение цитотоксического действия препаратов в культуре клеток MDCK с использованием MTS показало, что для веществ №1 ЦТД50 составила 12,91мг/мл, 1,51 мг/мл, 1,18 мг/мл, 0,95 мг/мл, 1,52 мг/мл соответственно через 48 часов инкубирования веществ с клетками (Табл.1).

Максимальная концентрация препаратов (МПК), не изменяющая значение ОП450 по сравнению с контролем клеток при концентрации для вещества №1 составили 0,5 мг/мл и ниже. При визуальной оценке состояния монослоя культуры клеток МДСК под инвертированным микроскопом при этих концентрациях также не выявлено значительных изменений в их морфологии (Табл.1).

Таблица 1. Результаты изучения цитотоксичесого действия веществ №1 в культуре _клеток MДCK._

Препараты ЦТД 50 ( мг/мл/), 48 часов

Метод визуального определения Метод с использованием MTS

№1 0,50 1,18

В данной серии экспериментов не определялось цитотоксическое действие озельтамивира карбоксилата, однако согласно литературным данным она близка цитотоксичности озельтамивира фосфата и находится в диапазоне 500-700 мкг/мл.

Изучение вирулицидного действия веществ №1 в отношении вируса гриппа человека А/НШ1 pdm в культуре клеток МДСК.

Для определения вирулицидных свойств вещества №1 были изучены в различных концентрациях. В таблице 2 представлены данные действия веществ на вирус гриппа А/Калифорния/7/2009 (НШ) pdm 09.

Вещество №1 в концентрациях 0,2 и 0,1 мг/мл в 64 и 8 раз соответственно снижало гемагглютинтрующую активность вируса и на 6,0 и 3,0 ^ инфекционную активность вируса гриппа А/Калифорния/7/2009 (Н1Ш) pdm 09. Концентрация вещества №3 0,01 мг/мл не оказывала инактивирующего действия на вирус гриппа А/Калифорния /7/2009 (Н1Ш) pdm 09.

Таблица 2. Вирулицидное действие веществ №1 на вирус гриппа человека А/Калифорния/7/2009 (н1Ш) pdm 09.

Вещество Концентрация Гемагглютинирующая Инфекционная

препарата, мг/мл активность вирусов гриппа А активность вируса (^ТЦИД50/кл. )

№1 0,2 1:1 2,5

0,1 1:8 5,5

0,01 1:64 8,0

Вирусный 1:64 8,5

контроль

ОБСУЖДЕНИЕ результатов

В течение последних лет быстро развивающейся областью медицинской химии является химия фуллеренов и соединений на их основе. Эти соединения обладают различной биологической активностью: антиоксидантными свойствами, нейтрализуя токсичных форм кислорода, антибактериальной активностью. Большой интерес вызывают производные фуллерена в качестве антивирусных агентов [9].

В данном исследовании было изучено противовирусная активность производного фуллерена №1 в отношении пандемического вируса гриппа человека А/Калифорния/7/09 pdm

в сравнении с широко применяемым для лечения гриппозной инфекции коммерческим препаратом Тамифлю.

Суммируя полученные данные, можно сделать заключение, что все изученные соединения оказывают незначительное цитотоксическое действие на клеточную культуру MDCK (Madin-Darby canine kidney) - почки собаки (Canis familiaris) породы кокер-спаниель.

Установлено, что изученная вещества обладают противовирусным действием в отношении пандемического вируса гриппа. Его эффективность носит дозозависимый эффект, с увеличением концентрации вещества увеличивается их противовирусная активность. Также следует отметить, что противовирусные свойства изученных веществ значительно различаются по антивирусному действию в различных схемах воздействия.

Наибольшая противовирусная активность выявлена для вещества №1. Оно практически одинаково эффективно при добавлении за 24 часа до инфицирования, одновременно с вирусом, через 24 часа после инфицирования и вирулицидной схемах воздействия на пандемический вирус человека А/Калифорния/7/09 pdm.

ВЫВОДЫ

При экспериментальном изучении действия веществ №1 в культуре клеток МДСК на репликацию вируса гриппа человека А/Калифорния/7/09 pdm были получены следующие результаты:

Вещество № 1 обладает выраженной противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа А А/Калифорния/7/09 pdm. Достоверно снижает инфекционный титр вируса при добавлении его за 24 часа до инфицирования, одновременно с вирусом и через 24 часа после инфицирования. Также вещество №1 оказывает вирулицидное действие на вирус гриппа А/Калифорния/7/09 pdm, значительно снижая гемагглютинирующую и инфекционную активность.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bellanti J.A. Recurent respiratory tract infections in pediatric patients// Drugs. 2007. Vol. 54. № 1юР.1-4.

2. Garten R.J., Davis C.T., Russel C.A. et. al. Antigenic and genetic characteristics of swine-origin 2009 A(H1N1) influenza viruses circulating in humans// Science. 2009. Vol. 325. №5937. P. 197201.

3. Details of Influenza Transmission Zones available at: http://www.who.int/influenza/surveillance_monitoring/updates/EN_GIP_Influenza_transmissio n zones.pdf

4. Лобзин, Ю.В. Вирусные гепатиты: / К.В. Жданов, В.М. Волжанин, Д.А. Гусев // клиника, диагностика, лечение. - СПб: «Фолиант», - 2006. - 183 с.

5. Холиков, Ш.Х. Синтез аминокислотных и пептидных производных фуллерена Сбо и их противовирусная активность в отношении вируса гепатита С / Ш.Х. Халиков, С.З. Зафаров, С.В. Алиева, М. Умархон // Журнал«Globus» «Технические науки». - Санкт-Петербург. -2019. Выпуск 7 (31). - С. 27-36.

6. Холиков, Ш.Х. Синтез и идентификация фуллеро Сбо а-аминокислот с антивирусными свойствами / Ш.Х. Халиков, С.З. Зафаров, С.В. Алиева, М. Умархон, Д.А. Шарипова // Хими я природных соединений. - 2017. - №1. - С.102-108.

7. Халиков, Ш.Х. Синтез аминокислотных и пептидных производных фуллерена Сбо и противовирусная активность в отношении вируса гепатита С / Ш.Х. Халиков, С.В. Алиева, С.З. Зафаров, М. Умархон, Ж. Олифтаева // Материалах конференции ХГУ Нумановских чтениях. «Вклад молодых ученых в развитие химической науки». Академия Наук Республики Таджикистан, Институт Химии им. В. И. Никитина, - Душанбе. - 2017. - С.11-17.

8. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. Update: drug susceptibility of swine-origin influenza A (H1N1) viruses, April 2009 // Centers for Disease Control and Prevention (CDC). - 2009. - Vol. 58. - P. 433-435.

9. Пиотровский Л.Б., Козелецкая К.Н., Медведева И.А. и др. Влияние комплекса фуллерена Сб0 с поливинилпирролидоном на репродукцию вирусов гриппа. Вопросы вирусологии.-2001.-Т.46, №3.-С.38-42.