CC BY
25НАНОТЕХНОЛОГИИ И НАНОМАТЕРИАЛЫ
УДК
СИНТЕЗ АМИНОКИСЛОТНЫХ И ПЕПТИДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ФУЛЛЕРЕНА Сбо И ИХ ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ В ОТНОШЕНИИ ВИРУСА ГЕПАТИТА С
Аннотация. Синтезированы новые композитные производные фуллерена С60 с аминокислотами и пептидами и исследованы их противовирусная активность в отношении вируса гепатита С (ВГС) in vitro. На клеточной культуре Vero(V) показано, что производные фуллерена С60 с аминокислотами и пептидами обладают свойством подавлять репликации ВГС.
Ключевые слова: вирус, гепатит, вакцина, аминокислота, птичий грипп, композит.
Существуют разные формы заболевания, вызываемые вирусом гепатитов А, В, G, D, Е, С. Кроме гепатита С, остальные наиболее распространённые и изученные. Гепатит А (BrA) менее опасен по сравнению с гепатитом В и для его лечения создана генноинженерная вакцина, а также удалось создать противовирусный препарат ламивудин. Гепатит D (BrD) не размножается в организме самостоятельно, а только в присутствии вируса гепатита В. Гепатит G (BrG) близок к гепатиту С. Он широко распространён среди наркоманов. Однако, для него не характерно присущее гепатиту С прогрессирование инфекционного процесса с развитием заболевания с труднопредсказуемым исходом. Основной путь лечения является приём альфа интерферона в сочетании с рибавирином. Гепатит Е (B^), возбудителем которого является вирус гепатита Е, неустойчив во внешней среде, но хорошо сохраняется в водной среде. Против вируса гепатита Е разработана специфическая вакцина.
В 1989 году обнаружили гепатит С. Сейчас известно основных генотипов ВГС: 1а, 1в, 1с, 2а, 2в, 2с, 3а, 3в, 4а, 4в, 4е^, 4е, 5а, 6а, 7а, 7в, 8а, 8в, 9а, 10а, 11а. Отличительной особенностью вируса гепатита С является существенная изменчивость с образованием множества одновременно существующих, иммунологически различающихся антигенных вариантов - квазивидов, возникающих в результате мутации. Он пока считается неизлечимым, против него не разработана вакцина. Исключительно важными становятся профилактические меры, требуется совершенствование и лечение гепатита С, существующие препараты (интерферон, виразол, рибавирин) малоэффективны. Опасность этого вируса заключается в том, что он вызывает цирроз и первичный рак печени. Ежегодно в мире от патологий, связанных с вирусными гепатитами, погибают более 2 миллионов человек. Количество инфицированных вирусом гепатита С достигает 130-200 млн. человека [1, 2, 3]. В большинстве развитых странах мира интенсивно ведется исследование относительно приготовления менее или нетоксичных препаратов и вакцин, с целью излечения или предотвращения гепатита С [4, 5]. Разработанная в Институте Вирусологии г. Москва модель экспериментальной инфекции, вызванной ВГС in vitro, позволила реализовать уникальную возможность оценки противовирусной активности различных соединений в отношении инфекции, вызванной ВГС, а именно, проводить доклинические испытания препарата in vitro ленкрометодом.
Ранее был предложен ряд синтезированных нами аминокислотных производных фуллерена С60 с высокими антивирусными свойствами, против вируса птичьего гриппа A/duck/Novosibirsk/56/05(H5N5) [6]. В этой связи, представляло интерес изучить противовирусную активность определённых образцов-аналогов фуллерена С60, синтезированных нами со следующими структурами:
Халиков Ш.Х. *, Зафаров С.З., Умархон М.
Научно-исследовательский институт, кафедра органической химии Таджикского Национального Университета, 734025. г. Душанбе, пр. Рудаки 17, тел. 907-11-55-13
Ъ
N(COOXa)CH(CH3)COOXa (Карб. Ala-ONa)
Н Gly-Glu-Tyr-ONa
Н Gly-Leu-Gly-Arg-Arg-Gly-ONa
Фрагмент Н - Gly - Leu - Gly - Arg - Arg - Gly - ОН брали из антигендетерминантной части (140-145) белка VP1 вируса ящура А22.
Для синтеза соединений 1-3 мы использовали схему синтеза, заключающуюся во взаимодействии фуллерена Сбо со свободными или натриевыми и калиевыми солями аминокислот, а также их композитных составов и свободных пептидов в щелочной среде диметилформамида (ДМФА) и галогенбензолов по схеме 1:
Схема 1
2 - аминокислота, пептид, композиты аминокислот с пептидами. При необходимости можно получить соединение , растворив соединением (3) в воде и подкислять HCl.
Суть данного процесса заключается в следующем: к щелочному раствору ДМФА добавляют аминокислоту, пептида или смесь композитных составов аминокислот и пептидов, взятую от 4-до 10-кратного избытка, и при перемешивании по каплям при 70 - 800 С добавляют раствор фуллерена Сб0 в хлор или дихлорбензол, бромбензол или бромнафталин и перемешивают 7-8ч при установленной температуре. Основной продукт самопроизвольно из реакционной среды выпадает в осадок в виде натриевой соли. При этом выход N-0^ моно- или олигоаминокислот и пептидов и их аналогов составляет от 40 до 70%. Данный метод удобен тем, что, во-первых, он позволяет получать фуллероСб0 аминокислот и пептидов с достаточно хорошими выходами и чистый без применения трудоёмких способов очистки. Во-вторых, на корковую часть фуллерена Сб0 можно присоединить до шести остатков одинаковых или разных аминокислот и пептидов. Во-третьих, данным способом в реакцию с фуллереном одновременно можно вводить в виде композиции от двух до четырёх разных аминокислот или коротких пептидов. В результате аминокислоты и пептиды, входящие в композитный состав в разном количественном соотношении, могут присоединиться на корковой поверхности фуллерена, образуя N - фуллероСб0 - аминокислотный олигомерный композитный комплекс с разными количествами аминокислотных остатков или пептидных фрагментов с общей формулой N - фуллеро Сб0 (Н)т[МН-СН(К)-СООН]п или N - фуллеро Сб0 -(Н)т[-пептид]п.
При синтезе соединения (1) в виде композита были взяты ь-шб, Ь-8ег и пептид, Ь-Л1а-Л1а в щелочном растворе ДМФА, успешно присоединившиеся к молекуле фуллерена Сб0. Продукт (2) получили, исходя из трипептида 01у-Ь-01и-Ь-Туг и НООС-ЫН-СН(СНз)СООН (карбамил Ь-аланин в дмфа + №ОН) в виде композита, присоединяя к Сб0. Выход продукта в порошкообразном состоянии был количественным и после очистки хроматографически чистым.
Содинение (3) фуллеро Сб0(Н)[01у-Ьеи-01у-Л^-Л^-в1у-О№] было синтезировано, исходя из фуллерена Сб0 и свободного Н-01у-Ьеи-01у-Л^-Л^-в1у-ОН по осуществленной нами схеме 2 путем присоединения аминокислот по принципу поэтапного классического пептидного синтеза [7] с применением конденсирующих реагентов и защитных групп, для блокирования реакционноспособных функциональных групп, не участвую-щих в реакции пептидного синтеза, и снятия защитных групп после завершения синтеза гексапептида.
Схема 2
Синтез фрагмента 01у-Ьви-01у-Ащ-Ащ-01у 2 и ЫО2, защитные группы удаляли с помощью Н2/Рё. ВОС защитную группу снимали действием НС1/ СИзСООИ(лед.). Омыление метиловых эфиров проводили щёлочью.
Все синтезированные продукты растворимы в максимальном количестве диметилсульфоксида, воде и твине. В масс-спектре соединений (1) фуллеро Сбо (H)3[(His ONa) (Ser ONa)2 (Ala-Ala-ONa)] присутствовали пики молекулярных ионов с m/z 1308, 1285,1260, 1236, 1213, 1191, 1164, 1140, 1116, 1092, 1008, 721, 720, 699. Наиболее интенсивные пики фрагментов 1285, 1092 и 720 принадлежат фуллерену С60.
На рис. 1 показан масс-спектр натриевой соли Сб0-01у-Ьеи-01у-А^-А^-С1у-0№ с образованием протонированного кластера [Мп + Хт + Н]+ (п, т = 0, 1, 2...) молекул исследуемого вещества и матрицы Х. В при присутствии № в молекуле аддукта положительных ионов появляются кластеры типа [Мп+ Хт + №]+. В результате их сигналы располагаются через определённые интервалы с потерей ионов натрия.
Элементный состав синтезированных веществ соответствовал вычисленному. При температуре выше 4500С соединения 1-3 интенсивно разрушались с отщеплением остатков Сб0 и лигандов, претерпевших окисление, либо обугливание - продукты пиролиза. Для определения количества лигандов, присоединившихся к поверхности Сб0, использовали формулу молекулярной массы [5], полученную на основе масс-спектрограммы или рассчитанную молекулярную массу на основе элементного анализа:
ш1 - Ш2 = -1--
а ' Шп(1.2.3.4)
где W - количество аминокислот, присоединившихся к С60; m1 - общая масса вещества, взятая из спектрограммы; m2 - масса С60 (720); mn (1.2.3.4) - масса аминокислоты или пептида, взятая для реакции, где mn 1, 2, 3. количество аминокислотного композитного состава или пептидов, взятое в реакции присоединения к фуллерену, соответственно 1.2... а - количество аминокислоты или пептида, взятое в реакции присоединения к С60, для соединения (1) His, Ser, Ala-Ala a = 3. Для соединения (2) а = 2 и для соединения (3) а = 1.
При хроматографическом исследовании кислотного гидролизата в соединении (l) обнаружены аминокислоты серин, аланин и гистидин в соединении (2) глицин, аланин, глутаминовая кислота и тирозин, а в соединении (З) глицин, арганин и лейцин с Rf = 0.294.
Электрофорез гидролизата продуктов (2-З) проводили на влажной хроматографической бумаге, ватман №3, MM в буферной системе (Г) при рН 11-12, силе тока 20 мА (400В) в течение 3 ч, проявитель раствор нингидрина (рис.2).
Видимую электрофоретическую подвижность соединений (2-З) определяли по известной формуле:
d • l о
U = - см2 / вольт. сек.
v • t
d - путь, пройденный веществом от линии старта, l - длина полосы бумаги, t - время проведения электрофореза, v - напряжение.
Электрофоретический анализ кислотного гидролизата соединения (2) показал 4 окрашенных пятна, относящихся к аминокислотам - глицину, глутаминовой кислоте, тирозину и аланину. В качестве свидетелей на электрофоретическую бумагу рядом нанесли растворы Gly (2), Glu (3), Tyr (4), Ala (5), Leu (6), Arg (7). Все аминокислоты переместились на определённые расстояния по направлению к аноду (рис.2). В данном случае примесей свободных аминокислот при электрофорезе не обнаружено.
Продукт гидролизата соединения (3) на электрофореограмме показал три отдельные аминокислоты, относящиеся к глицину, лейцину и аргинину. Все аминокислоты тоже переместились по направлении к аноду.
+
г « »
в
в
о
Рис.2. Разделение аминокислот из гидролизатов фуллерен Сб0-{01у-01и-Туг), (КагЬ-А1а-ОЫа) (1) и С60-01у-Ьви-01у-А^-А^-С1у-ОЫа (8) методом электрофореза. Аминокислоты 2-7 приведены в качестве свидетелей. а а1 - линия старта. Гидролизат С60-(Gly-Glu-Tyr-ОNa), (Карбамил-Аланин-ОNa)
и1а=0.0021, Ик=0.00256, иь=0.0044, Иг= 0.00573 (1). Свидетели (и):
01у=0.00449(2), в1и=0.00568 (3), Туг=0.0256 (4), КагЬА1а=0.0022 (5),
Ьеи=0.00183(6), Агя=0.000458(7). Гидролизат С60-01у-Ьеи-01у-Аг§-Аг§-С1у-0№.
И8а =0.000422, И8б =0.00174, И8в=0.0043 (8).
Исследование противовирусных свойств соединений № (1), (2), (3) в отношении вируса гепатита С. Материалы и методы*: Вирус.
В работе использовали наиболее растространённый в Российской Федерации и наиболее патогенный генотип ВГС-1Ь, способный чаще, чем другие генотипы вируса, индуцировать в организме хроническую инфекцию, вызывать цирроз печени и гепатоцеллюлярную карциному. Как известно, это наиболее устойчивый к лечению препаратами интерферона, в том числе, и в сочетании с рибавирином генотип ВГС. Штамм ВГС (генотип 1Ь)
* Исследование проводили в институте Вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава Росии, г. Москва.
был выделен из сыворотки крови больной, хронически инфицированной вирусом гепатита С, в сыворотке крови которой обнаруживали антитела к ВГС, а методом РТ - ПЦР - РНК ВГС. Для выделения вируса использовали первичные культуры клеток головного мозга мышей-сосунков. Впоследствии вирус приобрёл способность размножаться в культурах клеток человека и животных, индуцируя цитопатогенный эффект в этих культурах клеток и накапливаясь в них в титрах до 7.5 lg ТЦИД50/мл. В настоящих опытах использовали вируссодержащую культуральную жидкость, собранную из инфицированных культур фибробластов куриного эмбриона, содержащую 7.0 lg ТЦИД5о/мл инфекционного ВГС (генотип Ib).
Соединения. Для исследования использовали вещества: фуллеро Сбо (H)3-[(-HisONa)(-SerONa)(-Ala-AlaONa)] в виде композита под номером (1); фуллеро C6o(H)2-[(-Gly-Glu-TyrONa)(N(COONa)CH(CH3)COONa)] в виде композита под номером (2); фуллероСбо (H)2-[(Gly-Leu-Gly-Arg-Arg-GlyONa)2] под номером (3).
В исследованиях использовали двукратные разведения на питательной среде «Игла МЭМ» всех 3 веществ, начиная с разведения 1:10. Обозначения веществ соответствовали их номерам, а именно: (1), (2), (3).
В качестве положительного контроля использовали активный в отношении инфекции, вызванной вирусом гепатита С, препарат, используемый в практическом здравоохранении - рибавирин (производство ИБХ РАН).
Культуры клеток. Для оценки цитотоксических и антивирусной активности веществ использовали свежеприготовленные суспензии пере-виваемых клеток почки эмбриона зеленой мартышки, вакцинный клон - Vero(v), полученный из коллекции клеточных культур лаборатории Госу-дарственной коллекции вирусов РФ. Концентрация клеток составляла око-ло 5х105 клеток/мл. Это позволяло получать в течении 24-часовой инкуба-ции клеток при 370С полный монослой в лунках. Культуры клеток Vero(v) выращивали в среде Игла с добавлением 10% сыворотки крови эмбрио-нальной сыворотки телят, глютамина и 100 ЕД/мл пеницилина и стрепто-мицина. В опытах использовали однодневный монослой клеток, выращенный в 96-луночных пластиковых культуральных панелях. Линия клеток Vero(v) является высокочувствительной для репликации генотипа Ib ВГС.
Исследование цитотоксических свойств аналогов фуллерена проводили путем воздействия различных концентраций соединений на монослой клеток Vero(v), выращенный в 96 луночных пластиковых культуральных панелях. Затем после формирования монослоя в лунки вносили по 25 мкл веществ в разных концентрациях: от 20 мкг до 0.31 мкг в 200 мкл. В качестве контроля служили лунки с клетками Vero(v) в питательной среде в том же объёме, но без соединений. Культуры клеток выдерживали в атмосфере СО2 при 37оС в течение 72 часов. Затем клетки из каждой лунки снимали раствором версена, окрашивали метиловым синим, подсчитывали количество и процент жизнеспособных клеток, используя слайдный цитометр (Cauntess) фирмы Invitrogen.
Рассчитывали цитотоксическую 50%-ю дозу (ТС50), которая соот-ветствовала концентрации соединения, приводящей к токсической гибели 50% клеток монослоя к 72 часам инкубации при 37оС после обработки клеток соединениями.
С целью изучения противовирусной активности веществ использовали цитопатогенный штамм вируса гепатита С, генотипа Ib. Противовирусную активность аналогов in vitro изучали микрометодом в соответствии с методом подавления цитопатогенного действия вируса гепатита С, согласно рекомендациям, изложенным в «Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств», Москва, 2012, утверждённом Министерством здравоохранения Российской Федерации. Суспензию клеток Vero(v) рассеивали по 200 мкл в 96-луночные пластиковые культуральные планшеты с использованием ростовой среды Игла МЭМ с добавлением глютамина, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина и 7% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, предварительно прогретой на водяной бане при 56оС в течение 20 мин. Затем в каждую лунку с формированным монослоем клеток по 20 мкл вносили вирусосодержащую жидкость (множественность заражения составляла 0.1 ТЦИД5о/клетка).
Разные не цитотоксические концентрации ингибиторов в объёмах 20-25 мкл на лунку добавляли за 6 часов до заряжения клеток вирусом, в момент инфицирования клеток и через 6 часов после заражения клеток. Продолжительность инкубации составляла 120 часов при 37оС в атмосфере 5% СО2, при этом в контроле вируса развивался 95-100% цитопатогенный эффект (ЦПЭ), т.е. ЦПЭ охватывал весь монослой клеток.
Антивирусный эффект веществ оценивали по их способности предотвращать развитие инфекционного процесса в клетках, а именно вирусиндуцированного цитопатогенного эффекта (ЦПЭ). Это позволяло определять: а) ЕС95 - эффективную концентрацию вещества, способствовавшего сохранению жизнеспособности не менее 95% зараженных ВГС клеток по сравнению с контрольными ВГС инфицированными, которые не обрабатывали веществами; б) ЕС50 - эффективную концентрацию вещества, способствовавшего сохранению жизнеспособности не менее 50% зараженных ВГС клеток по
сравнению с контрольными ВГС инфицированными культурами, где происходила гибель более 95% клеток монослоя. ЕС50 и ЕС95 устанавливали в опытах, в которых вещества в не цитотоксических дозах вносили за 24 часа до заражения монослоя клеток, в момент заражения и через 24 часа после заражения клеток. Результаты учитывали на 5-й и 7-й дни после заражения клеток. Расчитывали в) химио-терапевтический индекс (ХТИ) - показатель широты терапевтического действия химиотерапевтического средства, представляющий собой отношение его максимальной переносимой дозы (ТС50) к минимальной эффективной - ЕС50. Полученные результаты представлены в виде табл.1-2.
Результаты исследования цитотоксического действия веществ (ТС50). Как видно из табл. 1, 2, вещества, (1), (2), (3) в концентрациях, в которых они были использованы в настоящем исследовании, были нетоксичны для клеток Vero(v). Поэтому ТС50 для всех 3 веществ составляла больше чем 20.0 мкг/мл. В тоже время цитотоксическая активность 50 для референц-препарата рибавирин соответствовала 10мкг/мл, т.е. цитотоксические свойства рибавирина были выше, чем у изучаемых веществ. Это позволило нам использовать широкий диапазон концентраций веществ для изучения их противовирусной активности: от 20мкг/200 мкл до 031 мкг/ 200 мкл.
Результаты изучения противовирусной активности веществ. Фуллерен C60(H)3-[(-HisONa)(-SerONa)(-Ala-AlaONa)] (1), фуллерен Сб0 (H)2-[(Karb-AlaONa) (Gly-Glu-TyrONa)] (2), фуллерен Сб0 (H)2-[(-Gly-Leu-Gly-Arg-Arg-GlyONa)2] (3) отражены в виде данных таблиц 1 и 2, а именно, представлены данные исследования антивирусных свойств веществ на 5-й и 7-й дни после заражения монослоя клеток Vero(v) вирусом гепатита С. Как видно из данных, представленных в табл.1, на 5-й день после заражения клеток Vero(v), когда в контрольных, не обработанных веществами, культурах клеток произошла вирусиндуцированная гибель более 95% клеток, были обнаружены противовирусные свойства у всех веществ в отношении инфекции, вызванной вирусом гепатита С в культурах клеток Vero(v), однако прослеживались и определённые различия в проявлении противовирусной активности. В частности, было показано, что максимальная противовирусная активность вещества проявляется за 24 часа до заражения вирусом. В этом случае максимальной противовирусной активностью обладало вещество (3) (ХТИ составило >32, а ЕС95 - 1.25 мкг/200мкл). В 2 раза более низкой активностью характеризовались вещества фуллерена Сб0 (H)3-[(-HisONa)(-SerONa)2(-Ala-AlaONa)] (1) в виде композита и фуллеренаС6o(H)2-[(-Gly-Glu-TyrONa)(-N-COONa)CH(CH3)-COONa)] (2); в этих условиях (ХТИ составлял более 16, что совпадало с данными противовирусной активности препарата рибавирина в этих условиях. В случае внесения веществ сразу же после заражения клеток вирусом противовирусная активность снижалась и для ХТИ для двух веществ: фуллеренаСб0 (H)3-[(-HisONa)
(-SerONa)(-Ala-AlaONa)] и фуллеренаС6o(H)2-[(-Gly-Glu-TyrONa)(-N-COONa) CH(CHs)COONa)], для рибавирина составил 4, и выше для вещества фуллеро C60(H)-[(-Gly-Leu-Gly-Arg-Arg-GlyONa)2].
Аналогичная закономерность наблюдалась и в опытах, когда вещества вносили через 24 часа после заражения клеток (табл.2). Несмотря на более низкие показатели противовирусной активности веществ в этих условиях, ЕС95 для вещества фуллерен С60 (H)-[(-Gly-Leu-Gly-Arg-Arg-GlyONa)2] составил 10 мкг/200 мкл против 20 мкг/200 мкл, для вещества фуллерен С60 (H)3-[(HisONa)(-SerONa)(-Ala-AlaONa)] и фуллерен С60 (H)2-[(-Gly-Glu-TyrONa)(-N-COONa)CH(CH3)COONa)], что повлияло и на показатели ХТИ (>4 и более 2 соответственно).
Представляло интерес выяснить, сохраняются ли противовирусные свойства веществ в течение 7 суток наблюдения за инфекцией, вызванной ВГС в культурах клеток. Данные этих исследований представлены в табл.2. В случае внесения веществ в лунки с монослоем клеток за 24 часа до заражения также наблюдали максимальное проявление противовирусной активности веществ в отношении инфекции, вызванной ВГС в культурах клеток Vero(v). В меньшей степени противовирусные свойства аналогов фуллерена были обнаружены в опытах, когда вещества вносили в лунки сразу же после заражения вирусом клетки, и практически и статически не значимые данные снижения продукции вируса гепатита С инфицированными клетками были получены в экспериментах, когда вещества добавляли через 24 часа после заражения монослоя клеток. В условиях профилактического применения вещества наибольшей активностью характеризовались вещества: ФуллеренС6o(H)2-[(-Gly-Glu-TyrONa)(-N-COONa)CH-(CH3)COONa)], фуллерен С60 (H)-[(-Gly-Leu-Gly-Arg-Arg-GlyONa)2]; ЕС50 и ХТИ у этих веществ превышали данные этих показателей для вещества рибавирина в 2 раза. Аналогичная закономерность наблюдалась и в опытах при немедленном внесении веществ после заражения вирусом, хотя и показатели противовирусной активности были ниже, чем при профилактическом применении веществ. Исключение составил в этом случае препарат рибавирин. ХТИ и ЕС95 препарата в 2 раза превышали эти значения для 3-х веществ. В то же время следует отметить, что противовирусная активность рибавирина в отношении инфекции, вызванной вирусом гепатита С в культурах клеток Vero (v), не намного превышала таковую для веществ-аналогов фуллерена, исследованных в данной работе.
Если сравнивать результаты изучения противовирусных свойств предоставленных веществ в течение 5 и 7 дней их воздействия на инфицированные клетки, то следует отметить, что в опытах, когда вещества вносили за 24 часа до заражения клеток, активность веществ была одинаковой как в течение 5, так и 7 дней течения инфекционного процесса. Однако, в случае применения веществ сразу же после заражения или через 24 часа после заражения их, противовирусные свойства заметно снижались (приблизительно в 2 раза). Полученные результаты свидетельствуют, скорее всего, о необходимости многократного введения
веществ в этих условиях, чтобы достичь эффекта сравнимого с активностью при профилактическом применении препарата. Следует также отметить наблюдения, свидетельствующие о том, что при снижении концентрации вносимых веществ ниже привёденных в табл. 1 и 2 значений ЕС50 часто регистрировали защитные свойства веществ, однако, определить истинное значение ЕС95 или ЕС50 не представлялось возможным из-за отсутствия зависимого от дозы эффекта.
Таблица 1.
Противовирусная активность соединений в отношении инфекции, вызванной вирусом гепатита С
в культурах клеток УегоЕб
- Время внесения соединений - Наименование соединения - ТС50 - (мкг/200мкл) - ЕС95 - (мкг/200мкл) - ЕС50 - (мкг/200мкл) - ХТИ
- За 24 часа до зараже-ния виру-сом - 1 > 20.0 - 2.5 - 1.25 - >16.0
- 2 > 20.0 - 2.5 - 1.25 >16.0
- 3 > 20.0 - 2.5 - 1.25 16.0
- Рибавирин 10.0 - 1.25 - 0.62 - 16.0
- Немедленно после заражения вирусом - 1 > 20.0 - 10.0 - 5.0 - >4.0
- 2 > 20.0 - 10.0 - 5.0 - >4.0
- 3 > 20.0 - 5.0 - >2.5 - >8.0
- Рибавирин 10.0 - 5.0 >2.5 >4.0
- Через 24 после заражения вирусом - 1 > 20.0 - 20.0 - 10.0 - >2.0
- 2 > 20.0 - 20.0 - 10.0 - >2.0
- 3 > 20.0 - 10.0 - 5.0 >4.0
- Рибавирин 10.0 - 5.0 - >2.5 >4.0
Таблица 2.
Противовирусная активность соединений в отношении инфекции, вызванной вирусом гепатита С
в культурах клеток Уего-Еб _(7-й день после заражения вирусом гепатита С в дозе 0.1 ТЦИД5о/клетка)_
- Время внесения соединений - Наименование соединения - ТС50 - (мкг/200мкл) - ЕС95 - (мкг/200мкл) - ЕС50 - (мкг/200мкл) - ХТИ
- За 24 часа до заражения вирусом - 1 > 20.0 - 2.5 - 1.25 - >16
- 2 > 20.0 - 1.25 - 0.62 >32
- 3 > 20.0 - 1.25 - 0.62 >32
- Рибавирин 10.0 - 1.25 - 0.62 - 16
- 1 - 2 3 - 4 - 5 - 6
- Немедленно после заражения вирусом - 1 > 20.0 - 20.0 10.0 - >2.0
- 2 > 20.0 - 20.0 10.0 - >2.0
- 3 > 20.0 - 10.0 - 5.0 - >4.0
- Рибавирин 10.0 - 2.5 1.25 8.0
- Через 24 после заражения вирусом - 1 > 20.0 - > 20.0 - > 20.0 - >1.0
- 2 > 20.0 >20.0 - >10.0 - >2.0
- 3 > 20.0 > 20.0 20.0 >1.0
- Рибавирин 10.0 - 10.0 - 5.0 2.0
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали L-аминокислоты L-His, L-Ser и готовые пептиды L-Ala-L-Ala и Gly-L-Glu-L-Tyr фирмы Reanal (Венгрия). ТСХ проводили на хроматографических пластинках Silufol (ЧСФР) и Kiesegel - 60 на стекляной подложке №5724 (Merk, Германия) в следующих системах растворителей: бутанол - уксусная кислота - вода, 4:1:5; (А); толуол-бромбензол-уксусная кислота, 60:40:50 (Б); хлороформ-метанол-аммиак 20:12:14 (В); триэтиламин-аммиак-метанол-вода, 10:10:200:400 (Г); уксусная кислота-хлороформ, 50:25 (Д); электрофорез проводился на бумаге Ватман ММ в системе (Г) при рН 1112, 400В. Вещество обнаруживали на хроматограммах и электрофореограммах с помощью нингидрина и паров йода. ИК-спектры записывали на приборе SHIMADRU FTIR Measurement. Данные элементного анализа соединений соответст-вуют расчётным.
Для идентификации аминокислотных остатков в полученных соеди-нениях проводили кислотный гидролиз в 6н и 12н HCl в запаянной ампуле при 1200С в течение 22ч. Образующиеся свободные аминокислоты и Сб0 идентифицировали с помощью ТСХ, БХ и электрофореза в системах (А и Г).
Растворители удаляли на роторном испарителе при 40-600С (если указана температура). Температуру плавления определяли на приборе Boetus (Германия).
Гидролиз С60-гексапептида для аминокислотного анализа проводили в стандартных условиях 6н. HCl (1200С 24 ч). Аминокислотный анализ осуществляли на аминокислотном анализаторе LC 2000 (Германия).
N-фуллероСбo(Н)4[(-HisONa)(-SerONa)2(-Ala-AlaONa](1). В маленькой конической колбочке, снабжённой обратным холодильником, капельной воронкой, установленной на магнитной мешалке, в композитную смесь помешают 0.088г (0.00056моль) L-Ala-L-Ala в 8-кратном избытке, 0.056г (0.00052 моль) серина в 7 кратном избытке, 0.088г (0.00056 моль) гистидина в 4.8 кратном избытке, 6 мл диметилформамида, содержащего 0.4 мл 6н NaOH (рН 10). При интенсивном перемешивании при 70-800С из капельной воронки прикапывают раствор 0.050г (0.0000694 моль) фуллерена С60 в 3 мл 1.2-дихлорбензоле. Перемешивание при показаной температуре продолжают в течение 5 ч.
После трёхчасового перемешивания происходит помутнение реакционной среды, наблюдается переход окраски из фиолетового цвета в тёмно-коричневый и постепенное выпадение из раствора тёмно-коричневого осадка, по окончание реакции (через 8ч) выпавший осадок фильтруют. Осадок промывают толуолом до исчезнования фиолетовой окраски, содержащей непрореагировавший фуллерен С60, и щелочным метанолом для удаления невступивших в реакцию натриевых солей лигандов, и в конце промывают метанолом. Осадок фильтруя, удаляют, высушивают и получают 0.059г чистого (21%) продукта (1), соответствующего фуллерену С60 и композитному составу соединение (1). R/ 0.49 (Г), проявители пары йода и УФ-лучи и R/ 0.38 (B) пары йода. Продукт растворяется в ДСО, воде и тмине в максимальном количестве. Найдено %: С 74.71; Н 3.15; N 8.60 С8lН4lN8Oll(1301). Вычислено %: С 75.06; Н 3.28; N 7.81.
ИК- спектр КВг, см-1: 3400 (ОН), 2740 (С60 NH), 365 (NH), 1720-1740 (С=О), 820(С=С), 1430 (С60), 1180 (С60).
m/z: 1308, 1285, 1260, 1236, 1213, 1191, 1164, 1140, 1116, 1092, 1008, 721, 720, 699.
Количество аминокислот в соединении (1) определяют по формуле [6].
mi _ ш2 5SS 5SS , „
W = —l-2 = - = - = l,76 ~ 2 остатка Ser
a■ mn З• lll ЗЗЗ
W = 5SS = l.lO остатка His W = 5SS = 5SS = l.06 остатка Ala-Ala 5З1 З4S4 552
Кислотный гидролиз соединения (l) для идентификации аминокислотных остатков проводится в 12н. HCl в течение 22 ч при 1220С. Освобожденные аминокислоты идентифицируют с помощью БХ в системе (А). На хроматограмме обнаруживают три аминокислоты Ser с R/ 0.68; His с R/ 0.62; Ala с R/ 0.44, проявитель раствор нингидрина.
N-фуллероСбo(Н)2-[-N(COONa)CH(CHз)(COONa)(-Gly-Glu-TyrONa)](2). Получают аналогично
(1), исходя из композитной смеси 0.030г (0.000085 моль) в 1.34-кратном избытке трипептида Gly-Glu-Tyr и 0.050г (0.00037 моль) в 5.38 кратном избытке карбамилаланина, 6 мл ДМФА, содержащего 2мл 6н NaOH, с добавлением 0.070г (0.000097 моль) фуллерена С60 в 4 мл 1.2 - дихлорбензоле. Далее реакцию продолжают согласно методике (l). После очистки выделившегося осадка из реакционной среды последовательно промыванием толуолом, щелочным метанолом и чистым метанолом получают 0.055г (37%) продукта (2) в виде натриевой соли, ТСХ с R/ 0.155 (Г), проявитель пары йода. Продукт в максимальном количестве растворяется в воде и ДМСО. Определенное количество соединения (2) растворяют в воде и подкисляют 0.1 н HCl до рН 5. Выпавший осадок фильтруют и высушивают, получают соединении (3) в свободном виде. Выход 0.087г (70%).
Кислотный гидролиз вещества (2) для идентификации аминокислот-ных остатков проводят в 12н НО в течение 22 часов при 120-1220С. Освобождённые аминокислоты идентифицируют с помощью БХ в системе (А) Rfl = 0.155 (Karb Ala), Rß = 0.53 (Gly), Rß = 0.42 (Glu),), Rf4 = 0.51 (Tyr).
Электрофорез гидролизата продукта (2) проводили в системе (Г), при 400 В и 120 мин. На рис.2 приводится электрофореограмма гидро-лизата. Найдено %: С 84.18; Н 2.41; N3.56 С76Н22NзO7l(М 1088). Вычис-лено %: С 83,82; Н 2.02; N 3.86. ИК-спектр КВг, см-1: 3420 (ОН), 3264 (Qjo-NH), 3138(NH), 1740 (СООН), 1600(NH), 1473 (œ2), 1055-1041 ^oNH-C), 750-740 (аг).
Фуллеро Сб0 (н)-[-Gly-Leu-Gly-Arg-Arg-GlyONa]2 (3). Получают ана-логично (1) из 0.07г (0.0000972 моль) фуллерена С60 в 4мл 1.2 дихлорбен-золе и 0.03г (0.0000228моль) Gly-Leu-Gly-Arg-Arg-GlyOН в 4мл ДМФА, содержащем 0.5мл 6н NaOH (pHl2). Получают 0.041г (51.25%) аморфной натриевой соли фуллеро гексапептида (3), Rfl 0.37 (Е), R/2=0.535 (СН3СООН : НСООН : СН3ОН: Н2О)(15:5:30:50), R/3=0.238 (ДМФА : СН3ОН : КН4ОН : НОЩ (3:4:2:1), пары йода, часть которого растворят в воде подкисляют 5% HCl до рН 5, получают С6o(Н)2[(-Gly-Leu-Gly-Arg-Arg-Gly O^]. Найдено %: С 75.91; Н 3.50; N 12.80 С8зН42Nl2O7(М 1447). Вычислено %: С 75.95; Н 3.53; N 12.76. Аминокислотный анализ: Gly 2.92 (3), Leu 0.9 (1), Arg 1.96
(2). Кислотный гидролиз вещества (З) проводят в 12н HCl в течение 22ч при 1220 С, освобожденные аминокислоты иденти-фицируют БХ; в системе (А) и (Г) обнаруживают три аминокислоты Gly-OН R/ 0.11, Leu R/ 0.57, Arg R/ 0.18, проявитель раствор нингидрина. На рис. 2 приводится электрофореограмма гидролизата соединения (З). Количество гексапептида в соединении (З) на основе молекулярной массы, вычисленной согласно формуле, приведённой в методике (1), соответствуют двум остаткам гексапептида на молекулу фуллерена С60. Согласно расчёту:
m, - m I975 - 720 1255 -, m о _ mi m2 _ _ ^ = 2.02. 2 - остатка гексапептида
а • mn 1 • 621 621 присоединены на поверхности
фуллерена С60
ЛИТЕРАТУРА:
1. Лобзин Ю.В., Лихопоенко В.П. Воздушно - капельные инфекции/ Ю.В. Лобзин, В.П.Лихопоенко // СПб.Фолиант. -2006. -С.184.
2. Жданов К.В., Лобзин Ю.В., Гусев Д.А., Козлов К.В. Вирусный гепатит / К.В. Жданов, Ю.В. Лобзин, Д.А.Гусев, К.В. Козлов // СПб. Фолиант. -2012. - С.304.
3. Lozano R., Naqhavi M., Foreman K., Lim S., Shibuya K., Aboyans V. Глобальная и региональная смертность от 235 причин смерти для 20 возрастных групп в 1990 и 2010 годах: систематический анализ для Глобального исследования бремени болезней 2010 года / R. Lozano, M.Naqhavi, K.Foreman, S.Lim, K.Shibuya, V.Aboyans // - Lencet. -2012. - С.380.
4. Мукомолов С.Л., Левакова И.А., Сулягина Л.Г., Синайская Е.В., Болсун Д.Д., Иванова Н.В. Современная эпидемиология гепатита С в России / С. Л. Мукомолов, И.А. Левакова, Л.Г. Сулягина, Е.В. Синайская, Д.Д. Болсун, Н.В. Иванова // Эпидемиология и инфекционные болезни. Санкт-Петергбург. -№6. -2012. -С.21-25.
5. Соболева Н.В., Карлсен А.А., Кожанова Т.В., Кичатова В.С., Клушкина В.В., Исаева О.В., Игнатьева М.Е., Романенко В.В., Ооржак Н.Д., Малинникова Е. Ю., Кюрегян К.К., Михайлов М.И. Распространенность вируса гепатита С среди условно здорового населения Российской Федерации / Н.В.Соболева, А.А.Карлсен, Т.В.Кожанова, В.С.Кичатова, В.В.Клушкина, О.В Исаева., М.Е.Игнатьева, В.В. Романенко, Н.Д.Ооржак, Е.Ю. Малинникова, К.К.Кюрегян, М.И. Михайлов // Журнал инфектологии. -том 9. -№2. -2017. -С. 56-64.
6. Khalikov Sh.Kh., Sharipova D., Zafarov S.Z., Umarkhon M., Jalalifar M. Synthesis of a-Amino Acid Derivatives of Fullerene C60 with Antiviral Properties / Sh.Kh. Khalikov, D. Sharipova, S.Z. Zafarov, M.Umarkhon, M. Jalalifar // International Journal of Modern Chemistry. -8(1). -2016. - С.1-18.
7. Халиков Ш.Х., Алиева С.В., Ашуров С.Г. Синтез новых фрагментов белка VPi вируса ящура типа А12 / Ш.Х.Халиков, С.В.Алиева, С.Г. Ашуров // Ж. Биоорганической химии. -Том 20. -№4. -1994. -С.399-406.
8. Khalikov Sh.Kh., Sharipova D., Umarkhon M., Zafarov S.Z., Kodirov M.Z. Сonnесtions to fullerene of С60 of alkyldiamino-, amino- and imino acids with different molecular structures and the nucleophility / Sh.Kh. Khalikov, D. Sharipova, M.Umarkhon, S.Z. Zafarov, M.Z. Kodirov // International Journal of Modern Chemistry, Флорида. -8(1). -2016. -С.50-60.
