CC BY
127
УДК 612.35:615.244:591.1
Ключевые слова: гистоморфологическая характеристика печени, антиоксиданты, гепатопротекторы, крысы, шрот семян винограда
Key words: histomorphologic characteristic of liver, antioxidants, hepatoprotectors, rats, grape seed meal
Павлова О. Н., Гарипов Т. В., Григорьева Ю. В., Желонкин Н. Н., Первушкин С. В.
реактивные изменения ткани печени крыс в результате нагрузки шротом семян винограда
reactive changes in rat liver tissue caused by the load of grape seed meal
ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Адрес: 443099, Россия, г. Самара, ул. Чапаевская, 89
Samara State Medical University of the Ministry of Health Care of the Russian Federation Address: 443099, Russia, Samara, Chapaevskaya street, 89
Павлова Ольга Николаевна, к. б. н., доцент каф. естественнонаучных дисциплин
Pavlova olga N., Ph.D. in Biology Science, Associate Professor of the Dept. of Natural Sciences Гарипов Талгат Валирахменович, д. в. н., проф., зав. каф. физиологии Garipov Talgat V., Doctor of Veterinary Medicine, Professor, Head of the Physiology Dept. Григорьева Юлия Владимировна, к. м. н., доцент каф. гистологии, цитологии и эмбриологии grigorieva Yulia V., Ph.D. in Medical Science, Associate Professor of the Dept. of Histology,
cytology and Embryology Желонкин Николай Николаевич, к. фарм. н., ст. преподаватель каф. фармацевтической технологии Zhelonkin Nikolai N., Ph.D. in Pharmaceutical Sciences, Senior Lecturer of the Dept. of Pharmaceutical Technology Первушкин Сергей Васильевич, д. фарм. наук, профессор, зав. каф. фармацевтической технологии Pervushkin Sergei V, Doctor of Pharmacy, Professor, Head of the Dept. of Pharmaceutical Technology
Аннотация. В статье рассмотрена структура ткани печени крыс в эмбриогенезе и онтогенезе на фоне дополнительной нагрузки внутрижелудочно шротом семян винограда в виде суспензии. Выявлено, что на нагрузку суспензией шрота семян винограда организм крыс отвечает отсутствием апоптоза в гепатоцитах периферической части долек печени, повышенной синтетической активностью клеток, синтезирующих альбумины и белки плазмы крови, а также усиленной пролиферацией клеток центральной части печени, что является фактором повышения дезинтоксикационной функции органа. Реактивные изменения ткани печени крыс в результате нагрузки шротом семян винограда на клеточном уровне подтверждают гепатопротекторный эффект шрота. Summary. The paper describes the structure of the rat liver tissue in embryogenesis and ontogenesis against the additional intragastric load of grape seed meal in the form of a suspension. It has been revealed that the rat organism reacted to the load of the suspension with the absence of apoptosis in hepatocytes located at the periphery of the hepatic lobules, synthetic overactivity of cells synthesizing albumins and plasma proteins as well as intensive proliferation of cells located in the central part of the liver which is a factor of the increase of desintoxicative function of the organ. Reactive changes in the rat liver tissue caused by the load of grape seed meal at the cellular level confirm the meal's hepatoprotective effect.
Введение
В последние годы особую актуальность приобрела проблема роста патологий гепа-тобилиарной системы, которые негативно влияют на физиологический статус всего организма в целом. Печень, являясь центральным органом регуляции гомеостаза и биотрансформации лекарственных веществ, вовлечена во многие патологические процессы, и ее повреждения вызывают серьезные нарушения метаболизма, иммунного ответа, детоксикации и антимикробной защиты ор-
ганизма. Наиболее часто повреждения печени реализуются через химические и иммунологические механизмы [8, 9].
В соответствии с современными принципами лечения заболеваний печени, программа комплексной терапии такой патологии включает два основных направления. Первое представляет этиотропную терапию, направленную на подавление патологического возбудителя, его элиминацию и санацию организма. Второе направление соответствует патогенетической терапии, имеющей целью
адекватную фармакологическую коррекцию универсальных, мультифакторных и разновременных звеньев патогенеза. При этом нужно отметить, что универсализм основных звеньев патогенеза различных поражений печени и позволяет при всей полиэтиологич-ности данной патологии использовать достаточно близкую патогенетическую терапию, основу которой могут составлять лекарственные средства с направленным действием на печеночные клетки [3, 8, 9].
В целом ассортимент лекарственных средств, применяемых в комплексной терапии заболеваний печени и желчевыводящих путей, насчитывает более 1000 наименований, но, несмотря на значимость изучаемой проблемы, в настоящее время отсутствуют высокоэффективные препараты с отчетливым гепатопротекторным эффектом, с чем и связаны неудачи в лечении острых и хронических заболеваний органов гепатобилиар-ной системы [2, 5].
Большинство существующих гепатопро-текторов не имеют четко очерченных механизмов действия и представлены в основном препаратами растительного происхождения, содержащими антиоксиданты, полифенолы и другие биологически активные соединения, способствующие нормализации гоме-остаза в системе перекисного окисления липидов-антиоксидантов печени, так как активация процессов липопероксидации является ведущим патогенетическим механизмом в развитии патологий гепатобилиарной системы [3, 8, 9].
На наш взгляд, шрот семян винограда можно использовать в качестве гепатопро-тектора, так как он содержит биологически активные фенольные соединения и имеет богатый набор ценных минеральных компонентов [1, 4, 7]. Одним из важнейших антиоксидантов, содержащихся в шроте семян винограда, является ресвератрол -природный фитоалексин, обладающий выраженным противоопухолевым, противовоспалительным и кардиопротекторным действием [1, 4, 7].
В связи с вышесказанным цель нашего исследования состояла в изучении реактивных изменений ткани печени крыс на фоне
нагрузки суспензией шрота семян винограда как потенциального гепатопротекторного средства.
Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие задачи: провести гистологический анализ ткани печени крыс в эмбриогенезе и онтогенезе на фоне дополнительной нагрузки внутрижелудочно шротом семян винограда в виде суспензии.
Материалы и методы
Исследования проводили на 20 белых беспородных крысах массой 190-210 г, которые были поделены поровну на контрольную (интактную) и опытную группы.
Материалом для гистоструктурного анализа послужила печень от эмбрионов, находящихся на 15 и 21 сутки развития, и взрослых половозрелых самок, которые в течение 30 дней до наступления беременности и до родов в качестве дополнительной нагрузки внутрижелудочно получали суспензию шрота семян винограда в дозе 10 мг / 100 г веса тела, объемом 1 мл, приготовленную на дистиллированной воде [6].
Контролем послужил материал от интакт-ных крыс аналогичных сроков развития.
Для получения самок с датированным сроком беременности использовали 4-4,5-месячных крыс, которым с учетом эстрального цикла вечером подсаживали самцов, а утром брали влагалищные мазки. Первым днем беременности считали день обнаружения спермы в мазке.
По окончании эксперимента животных подвергали декапитации после ночного голодания, а затем извлекали печень. Фиксацию печени взрослых крыс и эмбрионов проводили в 10%-ном забуференном формалине, затем осуществляли проводку гистологического материала с помощью аппарата гистологической проводки замкнутого типа Tissue-Tek® Vip 5 junior, а после заливали в парафиновые блоки, из которых готовили срезы толщиной 6-7 мкм. Срезы ткани печени окрашивали гематоксилином и эозином.
Также проведено иммуногистохимиче-ское исследование печени с применением набора моноклональных антител к ингибитору апоптоза (Bcl-2) и антигену пролиферации
(Кь67). Типирование проводили с использованием антител фирмы DACO.
Экспериментальные исследования проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».
Фотографическую съемку образцов ткани печени проводили с помощью светового микроскопа «Микромед» при увеличении 40*, 100х и 200*.
Визуализацию препаратов проводили при помощи светового микроскопа «Микромед» и цифровой фотовидеокамеры.
Результаты и обсуждение
Исследование реакции ткани печени на нагрузку суспензией шрота семян виногра-
да показало, что в целом развитие органа в эмбриогенезе и онтогенезе соответствует физиологической норме. На 15 сутки эмбриогенеза балочное строение печени находится в стадии формирования (рис. 1).
Дольчатое строение печени не развито. Капилляры синусоидного типа, ветвящиеся, с выраженными расширениями, которые заполнены эритробластами и другими дифференцирующимися клетками эритроцитарно-го ряда. Наблюдаются участки эритропоэза и лимфопоэза (рис. 2).
Печень крыс, получавших в качестве дополнительной нагрузки шрот семян винограда, на 15 сутки эмбриогенеза находится в стадии формирования, развитие печени соответствует физиологической норме.
Рис. 1. Печень на 15 сутки эмбриогенеза. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение *40.
Рис. 3. Ткань печени опытных крыс на 21 сутки эмбриогенеза. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение *100.
Рис. 2. Печеночные балки с расширенными капиллярами, заполненными дифференцирующимися клетками эритроцитарного ряда. Окраска гематоксилин-эозином. Увеличение *200.
Рис. 4. Ткань печени опытных крыс на 21 сутки эмбриогенеза. Двуядерные клетки, клетки лимфоци-тарного ряда. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение *200.
Рис. 5. Ткань печени опытных крыс на 21 сутки эмбриогенеза. Дольки печени. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х200.
Рис. 6. Ткань печени опытных крыс на 4 месяц онтогенеза. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х100.
К 21 суткам эмбриогенеза наблюдается сформированное балочное строение печени, встречаются участки лимфо- и эритропоэза. Междольковая соединительная ткань и портальные тракты не развиты (рис. 3).
Встречаются двуядерные гепатоциты и клетки лимфоцитарного ряда (рис. 4).
Междольковая соединительная ткань и портальные тракты не развиты, но центральные вены сформированы, дольки печени угадываются.
Отмечается формирование соединительной ткани по ходу междолевых и сегментар-
иаГлЗ *
О Л
% ^'
Рис. 8. Печень экспериментальной крысы на 4 месяц онтогенеза. Иммуногистохимическое исследование антител к ингибитору апоптоза Вс1-2. Увеличение х200. В клетках лимфоидного ряда выраженная экспрессия антигена.
А.,
Рис. 7. Печень экспериментальной крысы на 4 месяц онтогенеза. Иммуногистохимическое исследование экспрессии антигена пролиферации Кь67. Увеличение х100. Положительная экспрессия маркера в ядрах отдельных гепатоцитов и ядрах эндотелия сосудов.
Рис. 9. Печень экспериментальной крысы на 4 месяц онтогенеза. Иммуногистохимическое исследование антител к ингибитору апоптоза Вс1-2. Увеличение х200. В гепатоцитах по периферии печени выраженная экспрессия антигена.
ных желчных протоков, вокруг вен отмечается более плотное скопление гепатоцитов (рис. 5).
В онтогенезе (в 4-месячном возрасте) в печени экспериментальных крыс отмечается сформированное четкое балочное строение, портальные тракты выражены, желчные капилляры не видны, гемопоэз отсутствует (рис. 6).
Иммуногистохимические исследования тканей печени крыс на 15 и 21 сутки эмбриогенеза с применением моноклональных антител к антигену пролиферации (Кь67) не выявили экспрессии, но в тканях печени 4-месячных крыс наблюдалась пролиферация эндотелия сосудов и пролиферация отдельных гепатоцитов (на 100 клеток 12-18 пролиферируют) (рис. 7).
В результате иммуногистохимического исследования тканей печени крыс на 15 и 21 сутки эмбриогенеза, а также печени 4-месячных крыс с применением набора моно-клональных антител к ингибитору апоптоза (Вс1-2) было выявлено, что на 15 сутки эмбриогенеза экспрессии антигена не наблюдается. На 21 сутки угнетения апоптоза гепато-цитов также не наблюдается, но имеет место выраженная экспрессия в клетках лимфоид-ного ряда и в эндотелии (рис. 8).
В тканях печени 4-месячных крыс имеет место выраженная экспрессия антигена, наблюдается ингибирование апоптоза в гепато-цитах по периферии печени (рис. 9).
Выводы
По результатам эксперимента можно сделать следующие выводы. На нагрузку суспензией шрота семян винограда организм крыс отвечает отсутствием апоптоза в гепа-тоцитах периферической части долек печени, повышенной синтетической активностью клеток, синтезирующих альбумины и белки плазмы крови. В то же время, усиленная пролиферация клеток центральной части печени является фактором повышения дезинтокси-кационной функции органа. Таким образом, реактивные изменения ткани печени крыс в результате нагрузки шротом семян винограда на клеточном уровне подтвердили гепато-протекторный эффект шрота, обнаруженный
нами в предыдущих исследованиях ферментов системы перекисного окисления липи-дов-антиоксидантов печени на экспериментальной модели токсического гепатита [3, 5].
Список литературы
1. Еремина, А. В. Биологически активные вещества винограда: классификация, фармакологические эффекты, лекарственные препараты и БАД на их основе / А. В. Еремина, Е. А. Дегтярева, В. Ю. Решетняк // Натуротерапия и гомеопатия. - 2003. - № 4 (4). -С. 27-30.
2. Кузмицкая, О. Н. Иммуномодуляторы, антиок-сиданты и гепатопротекторы в коррекции функциональной активности гепатоцитов при воздействии постоянного магнитного поля / О. Н. Кузмицкая, Н. А. Быстрова, А. И. Конопля, В. П. Гаврилюк // International Journal on Immunorehabilitation (Международный журнал по иммунореабилитации). -2010. - Т. 12. - № 2. - С. 227-228.
3. Логинов, Г. П. Исследование противотоксиче-ских свойств фитогепатопротектора «ВинСпир» / Г. П. Логинов, О. Н. Павлова // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н. Э. Баумана. - Казань, 2010. - Т. 204. -С. 135-140.
4. Магомедова, Е. С. Фенольные вещества и витамины винограда в зависимости от экологических факторов / Е. С. Магомедова, З. К. Бахмулаева // Виноград и вино России. - 2000. - № 2. - С. 14-15.
5. Павлова, О. Н. Исследование гепатопротек-торного действия биологически активной добавки «ВинСпир» / О. Н. Павлова, Н. Н. Желонкин, С. В. Первушкин, П. П. Пурыгин, М. О. Тархова // Известия Самарского научного центра Российской академии наук «13 конгресс "Экология и здоровье человека"» - Самара : Самарский научный центр Российской академии наук, 2008. - Т. 2. - С. 253-257.
6. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под общ. ред. Р. У Хабриева. - 2 изд., перераб. и доп. - М. : Медицина, 2005. - 832 с.
7. Стуруа, З. Ш. Фенольный состав винограда и продуктов его переработки / З. Ш. Стуруа, И. А. Мехузла // Виноград и вино России. - 1997. -№ 3. - С. 26.
8. Удут, В. В. Влияние гепатопротекторов фос-фолипидной природы на процессы апоптоза при экспериментальной патологии печени, вызванной изониазидом и парацетамолом / В. В. Удут, А. И. Венгеровский, А. М. Дыгай // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. -Т. 154. - № 11. - С. 568-571.
9. Христенко, Н. Е. Гепатопротекторы - путь к улучшению качества жизни / Н. Е. Христенко, С. Я. Ананько // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2012. - № 1. -С. 63-64.
