CC BY
60
ИСТОРИЯ БИОМЕДИЦИНЫ
К 45-ТИ ЛЕТИЮ РАЗРАБОТКИ РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА
Радиоиммунологические методы и развитие лигандного иммуноанализа
В конце 1959 г. американские исследователи Розалинд Яллоу и Сэмуэль Берсон разработали принципиально новый серологический метод, пригодный для высокоточного определения в крови человека концентрации инсулина, основанный на использовании в качестве одного из реагентов - инсулина, связанного с радиоактивным изотопом йода I-131, а второго реагента -антител к человеческому инсулину. Авторы назвали этот метод термином "radioimmunassay" (RIA), что в широком смысле означало "радио-иммуноопределение".
На протяжении последующих 15 лет выяснилось, что этот метод, впервые детально описанный в 1960 г. в Journal Clinical Investigation и впоследствие получивший в русскоязычной литературе название "радиоиммунологического" метода (РИМ), открыл необычайно широкие возможности использования иммуносерологичес-ких исследований, с помощью которых стало возможным решить целый ряд весьма важных диагностических и аналитических задач в медицине и биологии. Признание важной научной и методологическое значимости разработки РИМ выразилось в присуждении Р.Яллоу (С.Берсон умер в 1970 г.) - в 1977 г. Нобелевской премии по физиологии и медицине.
Нельзя не отметить, что разработка РИМ оказалось закономерным результатом более, чем сорокалетних изысканий, нацеленных на повышение чувствительности серологических реакций, используемых для диагностики различных инфекционных заболеваний. Следует заметить, что эти исследования велись в трех основных направлениях.
Поскольку предел чувствительности реакций агглютинации и преципитации лимитировался видимым на глаз количеством (и объемом) образующегося осадка, основу первого направления составили изыскания, направленные на поиск возможности увеличения объема образующегося агглютината или преципитата. Эти поиски уже к середине 40-х гг. XX в привели к разработке серологических реакций, основанных на использовании, так называемых, "суспензионных" антигенов и антител, ад-
сорбированных на поверхности инертных частиц различной природы, в том числе - некоторых клеток. Типичной реакцией этого типа была реакция пассивной гемагглютинации, позволявшая посредством феномена осаждения сенсибилизированных эритроцитов визуализировать взаимодействие значительно меньших количеств антигенов и антител.
Второе направление поисков было связано с поиском возможностей облегчения визуализации факта образования иммунного комплекса "антиген-антитело". Их результатом стала разработка во второй половине 40-х гг. прошлого века, так называемых, реакций "иммунодиффузии" - серологических реакций, протекавших в геле-вой среде, которая надолго сохраняла в своей толще образовавшиеся в ней иммунные комплексы, легко визуализируемые в виде четко очерченных в геле зон помутнения.
Началом третьего направления поисков, в итоге приведшего к созданию РИМ, стала разработка Альфредом Кунсом в 1941 г. способа химического связывания (коньюгирования) антител с флюоресцирующими красителями - флю-охромами, при котором коньюгированные антитела не утрачивали способность вступать во взаимодействие с соответствующими антигенами. На основе использования таких антител и был создан метод флюоресцирующих (люминес-цирующих) антител, ставший универсальным им-мунохимическим методом, и по чувствительности, специфичности и широте возможностей практического использования превосходил многие другие серологические методы.
Разработка способов, обеспечивающих сохранение иммунологической активности антител, связанных с флюрохромами, т.е. по существу - первых "меченных" антител, помимо важного утилитарно-диагностического имела и большое научно-методическое значение, поскольку возможность модификации антител без ущерба для их серологической активности подтверждала существование возможности использования в серологических исследованиях антител и антигенов, связанных с "метками" иной природы.
Однако непосредственной предтечей ис-
пользования радиоактивных изотопов (радионуклидов) в иммуносерологических исследованиях стало расширение сферы применения ау-торадиографии и, в первую очередь, успешное использование в биологических исследованиях меченных ими метаболитов (вспомним, что за работы по использованию радиактивных изотопов в качестве индикаторов при изучении химических процессов Д.Хэвеши был удостоен Нобелевской премии по химии еще в 1943 г.).
Здесь уместно вспомнить, что в конце 40-х гг. появились первые предприятия атомной промышленности, побочными продуктами деятельности которых явились различные радионуклиды, некоторые из которых стали доступными для использования в биологических исследованиях. В то время основой привлекательности использования радионуклидов в биологии представлялась возможность, введя один или несколько атомов радионуклида в состав молекулы того или иного вещества, с помощью высокочувствительного счетчика радиоактивности детектировать это вещество в ничтожно малых молекулах и даже мониторировать процессы его превращения в другие вещества.
К этому времени уже были, с одной стороны
- разработаны методы конъюгирования радионуклидов с биомолекулами, а с другой стороны
- создана специальная прецизионная аппаратура (сцинциляционные счетчики) для количественного определения интенсивности ионизирующего излучения, генерируемого атомами радионуклидов, введенных в качестве "меток" в состав биомолекул. Эти обстоятельства также стали предпосылками для расширения возможностей использования меченных радионуклидами биомолекул, в основном, в биохимических и молекулярно-биологических исследованиях.
Отметим, что среди полученных в начале 50-х годов первых белковых молекул, в состав которых были введены радионуклиды, был и человеческий инсулин, связанный с радионуклидом 1-131. Используя препарат такого инсулина, С.Берсон и Р.Яллоу еще в 1956-1958 гг. показали, что в крови больных сахарным диабетом, получающих инъекции инсулина, регулярно выявляется белок, связывающий инсулин.
Изучив природу этого белка, исследователи впервые показали, что он представляет собой антитела к инсулину. Этот факт навел их на мысль о том, что, добавляя в кровь большие количества немеченного инсулина, можно добиться вытеснения меченного инсулина из состава комплекса "инсулин-антитела к инсулину".
Экспериментально подтвердив такую возможность, авторы вплотную подошли к идее о возможности использования меченного инсулина в качестве реагента, конкурирующего в серологической реакции с нативным инсулином за связывания с антителами к инсулину, выступающими в качестве реагента, извне вводимого в
систему серологической реакции (используемые при этом в качестве реагента антитела к человеческому инсулину были получены путем иммунизации морских свинок инсулином человека). В этом случае, количественно оценив степень такой конкуренции, можно было бы судить о концентрации в крови нативного инсулина. В дальнейшем именно эта идея и была реализована ими при разработке метода количественного определения в крови концентрации инсулина, основанного на использовании в качестве реагентов упоминавшихся выше антител к инсулину человека и препарата, содержащего известное количество инсулина, связанного с изотопом йода (1-131) с известной радиоактивностью.
Идентичность иммунологической специфичности и серологической активности меченного инсулина и содержащегося в тестируемой сыворотке нативного инсулина обеспечивала возможность их конкуренции между собой в процессе связывания с антителами к инсулину. При последовательном внесении в тестируемую сыворотку меченного йодом инсулина, а затем известного количества антител к инсулину, присутствующий в сыворотке нативный инсулин, конкурируя с меченным инсулином, снижал связывание последнего с антителами. Если при этом взаимодействие инсулина и антител к нему рассматривать как обратимую бимолекулярную химическую реакцию синтеза, протекающую в строгом количественном соотношении, то изменения концентраций реагентов и конечного продукта реакции "антиген-антитело" должны были подчиняться закону действия масс. В силу этого и при условии постоянства концентрации антител в реакционной системе соотношение концентраций свободного и меченного инсулина, оставшихся в растворе, и соотношение их количеств в образовавшемся комплексе "антиген-антитело" оставались пропорциональными их первоначальным концентрациям.
Поэтому, зная первоначальную концентрацию меченного инсулина и его удельную радиоактивность (которой обладает единица массы вещества), можно было, измерив радиоактивность образовавшегося комплекса "антиген-антитело", вычислить его удельную радиоактивность и установить соотношение в нем меченного и немеченного антигена, т.е., по существу - долю меченного антигена в составе этого комплекса. Это позволяло, сравнивая радиоактивность пробы и соответствующих контролей, количественно оценивать конкуренцию между немечен-ным (нативным) и меченным антигеном, а значит - и определять концентрацию нативного антигена в исследумой пробе.
Реализовав эту идею, авторы разработали принципиально новый тип имимуносерологичес-кого метода, позволившего с высокой точностью определять в крови концентрацию веществ, об-
ладающих антигенными и, даже, гаптенными свойствами. Этот подход открыл новые возможности серологических реакций: если один из реагентов связать с такой меткой, то, определив интенсивность излучения образовавшегося комплекса "антиген-антитело", можно было вычислить количество второго реагирующего компонента. В этом случае точность определения всецело зависела от чувствительности метода регистрации интенсивности ионизирующего излучения, генерируемого радионуклидной "меткой", и полностью зависела от технических возможностей (т.е., чувствительности) используемого радиометрического прибора.
Необходимо особо подчеркнуть, что разработанный ими метод количественного анализа удачно сочетал в себе свойственную серологическим реакциям специфичность и характерную для радиометрических исследований высокую чувствительность и точность.
В 1960 г. аналогичный подход для количественного определения в крови тироксина предложил английский исследователь Роберт Экинс, который, предвидя широкие возможности, таящиеся в конкурентном принципе использования "меченных" радионуклидами антигенов, назвал этот метод "сатурационным (насыщающем) анализом". Однако данный термин в отношении радиоизотопных меток не прижился, а в научной литературе закрепилось обозначение RIA.
Использование РИМ, по чувствительности в десятки тысяч раз превосходящего реакцию агглютинации, обусловило настоящую революцию не только в серологии, но и в таких областях, как эндокринология, биохимия и многих других, т.к. обеспечило возможность определять нано- и даже пикограммовые количества многих антигенов различного происхождения, белков и многих других веществ, обладающих иммунологической активностью или, по крайней мере, свойствами гаптенов.
Однако, несмотря на превосходные аналитические характеристики РИМ, его широкому использованию препятствовало отсутствие эффективных способов отделения образовавшихся иммунных комплексов от свободных (как меченных, так и немеченных) антигенов и антител. Первоначально с этой целью использовались такие сложные и трудоемкие методы, как высокоскоростное центрифугирование, электрофорез, осаждение антигенов и антител различными растворами солей и органических веществ, гель-фильтрация, хроматография и др. К тому же, эти методы зачастую оказывались недостаточно эффективными и не обеспечивали полного отделения иммунных комплексов от непрореагировавших между собой антигенов и антител, остававшихся свободными в среде протекания серологической реакции.
Частично эта проблема была решена посредством "метода двойных (или вторичных)
антител", разработанного Р.Ютигером еще в 1962 г.: используя противовидовые антитела, можно было агрегировать и осаждать присутствующие в растворе иммунные комплексы. Это значительно облегчило их последующее отделение с помощью центрифугирования или гель-фильтрации. Однако, полностью проблема разделения продуктов, образующихся в процессе воспроизведения РИМ, была решена лишь благодаря использованию "иммобилизованных" антигенов и антител, представляющих собой соответствующие иммунологически активные реагенты, тем или иным способом фиксированные на поверхности различных носителей.
Наиболее плодотворным оказался предложенный в 1967 г. К.Кэттом и Дж.Треджером подход, основанный на использовании антигенов и антител, адсорбированных на поверхности пластиковых носителей (пробирок, шариков). Такие "сенсибилизированные" поверхности обретали способность избирательно сорбировать из растворов и жидких смесей соответствующие гомологичные антигены или антитела - в результате последние иммуносорбировались и фиксировались на этих поверхностях, условно называемых "твердой фазой" (отсюда РИМ, основанный на описанном принципе отделения свободных реагентов от иммунных комплексов, получил название "твердофазного" (Solid-phаse RIA). Данный подход необычайно упростил процедуру отделения комплексов "антиген-антитело" от свободных иммунных компонентов, так как твердофазная иммуносорбция вместе с последующим промыванием "твердой фазы" (для удаления несвя-завшихся антигенов и антител с ее поверхности) уже сами по себе обеспечивали достаточно тонкое и специфичное разделение свободных антигенов и антител от иммунных комплексов, иммобилизованных на поверхности "твердой фазы".
Дальнейшему развитию РИМ в значительной степени способствовала разработка методов связывания антител с радионуклидами. Так, в 1963 г. Ф.Гринвуд и У.Хантер предложили весьма простой, но эффективный хлораминовый метод йодирования пептидов, позволивший вводить радионуклиды йода (I-131, I-125) в состав самых разнообразных белков и, в том числе, иммуноглобулинов.
В свою очередь, возможность "метить" антитела позволила Л.Майлсу и К.Холсу в 1968 г. разработать вариант РИМ, в котором вместо меченного антигена использовались "меченные" антитела, что значительно расширило аналитические возможности метода и, главное, позволило, наряду с принципом конкуренции, использовать и весьма плодотворный принцип последовательного насыщения детерминантных групп антигенов и активных центров антител соответствующими серологически активными компонентами и последующей регистрации радиоактивности сформировавшегося иммунного комплекса.
При этом, степень связывания меченных антител определяемым антигеном прямо отражала его количество и могла быть непосредственно определена, исходя из радиоактивности комплекса "антиген-антитело". На основании этого авторы назвали такой вариант РИМ - immunoradiomet-ric assay (IRMA) или "иммунорадиометрическим анализом". А поскольку образующийся при постановке IRMA иммунный комплекс мог иметь сложную структуру наподобие многослойного "сэндвича", такой подход существенно расширил конструктивные возможности проводимого иммуноанализа, причем, при необходимости одна и та же тест-система могла совмещать в себе реализацию как конкуретного, так и насыщающего вариантов проведения анализа.
Менее чем за 10 лет РИМ произвел настоящий переворот в области не только серологической диагностики, но и биологического имму-ноанализа. Так, благодаря РИМ, удалось резко повысить надежность и чувствительность серологической диагностики целого ряда инфекционных, и прежде всего, вирусных заболеваний. С другой стороны, в качестве высокочувствительного метода количественного анализа РИМ оказался не только пригодным, но и весьма удобным для определения в крови и других биожидкостях разнообразных биологически активных веществ и даже некоторых лекарственных препаратов.
Уже в самом начале 70-х гг. появились первые коммерческие наборы (kits) для постановки РИМ как метода серологической диагностики: американская компания "Abbott" на основе полистироловых шариков с адсорбированными на них антителами к "австралийскому" антигену (HBsAg) изготовила набор "AusRIA", предназначенный для лабораторной диагностики вирусного гепатита В, а также коммереческие наборы для определения в крови концентрации раково-эмбрионального антигена, альфа-фе-топротеина и пептидных гормонов.
В дальнейшем ассортимент таких наборов быстро увеличился, что ознаменовало начало повсеместного внедрения таких наборов в клинико-диагностическую практику, в частности, для определения присутствия в растворах и суспензиях разнообразных антигенов и антител и высокоточного определения их концентрации. Более того, появление таких наборов позволило не только упростить ранее существовавшие весьма трудоемкие и недостаточно точные методики определения многих веществ на основе их биологической активности, но и открыло возможности количественно определять концентрацию веществ, для которых ранее не существовало способов определения.
В заключение, необходимо особо подчеркнуть, что появление РИМ в арсенале имму-носерологических методов, помимо утилитарно-
го, имело и весьма важное общетеоретическое и методологическое значение. В частности, основные принципы использования "меченных" радионуклидами антител и антигенов в дальнейшем легли в основу целого семейства новых высокочувствительных иммунохимических тестов, основанных на использовании в качестве меток для антител и антигенов веществ и объектов с определенными физическими, химическими или биологическими свойствами, благодаря которым осуществляется идентификация факта серологического взаимодействия. В качестве таких меток в разное время было предложено использовать вещества, рассеивающие электроны, свободнора-дикальные соединения, хемолюминисцентные вещества, а также физиологически и фармакологически активные вещества, и в первую очередь, ферменты и их простетические группы и др.
Все эти методы, несмотря на различную природу меток, были основаны на едином принципе постепенного насыщения определяемой биосубстанцией (называемой свободным лиган-дом) агента, связанного с соответствующей меткой (меченный лиганд). В связи с этим, данная группа методов в литературе была объединена под общим названием методов "лигандного им-муноанализа" (ligand-binding assays).
Один из таких методов - твердофазный имму-ноферментный метод (ИфМ) - полностью вытеснил РИМ из широкой лабораторной практики и сегодня повсеместно применяется не только в серологической диагностике инфекционных и ряда неинфекционных заболеваний, но и в качестве высокочувствительного метода определения десятков биохимических и иммуноактивных субстратов (гормоны, опухолевые маркеры и др.). В равной степени сказанное относится и к другому типу лигандного иммуноанализа - имму-нохемолюминесцентному методу, который по основным характеристикам практически не уступает РИМ и ИфМ и все шире применяется в различных диагностических исследованиях. При этом приходится признать, что оба упомянутых метода, обладающих по сравнению с РИМ целым рядом преимуществ, были созданы на теоретических основах РИМ.
Вот почему, оценивая общенаучное значение создания РИМ, нельзя забывать, что отмеченное за последние почти полвека бурное развитие одной из важных отраслей диагностической медицины - иммунохимического анализа было инциировано не только разработкой РИМ, как такового, но и, главное, созданием на его базе идеологии лигандного иммуноанализа, которая в свое время открыла новые перспективы и горизонты, как оказалось, весьма плодотворного научного поиска в этих областях биологии и медицины.
С.М.МамедоВа, М.К.МамедоВ
