CC BY
319
Резюме. Методы иммунохимического анализа широко используются в практике клинико-диагностических лабораторий для идентификации и количественной детекции биомаркеров заболеваний различного генеза. Причиной этому является сочетание высокой чувствительности и специфичности собственно иммунохимического анализа, экспрессности и простоты исполнения. Наибольший интерес представляют различные модификации твердофазного иммуноферментного, иммуносенсорного и иммунохроматографического анализа с использованием тест-полосок. Внедрение иммунохимических методов определения биомаркеров в медицинскую практику позволит на ранних стадиях обнаружить опасные болезни и предотвратить их развитие, значительно снизить затраты на лечение, сократить смертность, увеличить продолжительность жизни населения и повысить ее качество. Ключевые слова: биомаркеры, иммунохимические методы, ELISA, иммуносенсорный анализ, иммунохроматографический анализ.
Алесь
Бураковский,
и.о. завлабораторией
медицинского
микроанализа
Института
биоорганической
химии
НАН Беларуси, кандидат
биологических наук
За последние годы в лабораторной медицине произошли существенные изменения, связанные с резким расширением номенклатуры диагностических показателей (биомаркеров) и высокой производительностью и точностью выполняемых исследований за счет применения современных методов, а также программного и приборного обеспечения. Все чаще полученные таким образом данные становятся ведущими при постановке диагноза и определении тактики лечения.
Одно из наиболее бурно развивающихся направлений лабораторной диагностики -разработка и использование иммунохимических аналитических тест-систем (диагно-стикумов) для идентификации широкого спектра биомаркеров заболеваний различного генеза. Существует более 200 разнообразных методов и их разновидностей, основанных на реакции «антиген - антитело». Наибольший интерес представляют различные модификации твердофазного иммунофер-ментного, иммуносенсорного и иммунохроматографического анализа с использованием тест-полосок. Для них характерны высокая чувствительность и точность результатов, экспрессность, возможность автоматизации.
Биомаркеры. В последнее десятилетие растет интерес к определению маркеров в биологических жидкостях человека для раннего выявления различных заболеваний. Им принадлежит решающая роль в развитии персонализированной медицины. Они могут использоваться для диагностики болезни на молекулярном
уровне (в смысле обнаружения новых путей вмешательства в ее ход), оценки риска ее развития у человека, прогнозирования наиболее вероятного ее течения, разделения пациентов на группы по одинаковому биологическому признаку и вероятности ответа на лечение, мониторинга терапии, определения маркеров безопасности (выявление препаратов с более хорошим профилем переносимости), контроля за действием лекарственных средств.
Под биологическим маркером понимают потенциально детектируемый параметр, измерение которого отличается высокой точностью, надежностью и воспроизводимостью, что позволяет отражать состояние здоровья, напряженность физиологических процессов, величину риска или факт развития заболевания, стадию последнего (клиническая/доклиническая) и его прогрессирование или реверсию [1] (табл. 1).
Использование в диагностике биологических маркеров позволяет экономизировать расходы системы здравоохранения, затрачиваемые на оптимизацию процессов скри-нирования больных, выбора наилучшей стратегии лечения и оценки ее адекватности. Однако для того чтобы удовлетворять эти ожидания, биомаркеры в идеале должны не только отличаться точностью, надежностью и воспроизводимостью при последовательных количественных измерениях, демонстрировать высокую чувствительность и специфичность, но и не зависеть от возрастных, расовых и гендерных различий, а также способствовать возникновению однозначности мнений при интерпретации полученных данных [3]. Далеко не все рекомендуемые к применению в рутинной клинической практике биомаркеры удовлетворя-
Биомаркеры Цель применения
Антецедентные Идентификация риска возникновения заболевания
Скрининговые Верификация субклинических стадий заболевания
Диагностические Установление наличия определенного заболевания
Состояния Характеристика тяжести заболевания
Таблица 1. Классификация и назначение биомаркеров [2]
_ Оценка прогноза развития заболевания, ответа на лечение
Прогностические , , ,
(терапевтическое вмешательство или мониторинг его эффективности)
ют этим характеристикам. Все это создает необходимость, с одной стороны, в поиске новых перспективных показателей, а с другой - в разработке методических подходов к их идентификации и количественной детекции.
Иммунохимические методы в определении биомаркеров. Иммунохимический анализ прочно вошел в повседневную практику работы диагностических лабораторий. Развитие его методов (появление новых принципов детекции сигнала и новых технологий при создании тест-систем) позволило существенно расширить спектр исследований, используемых в клинико-лабораторной практике. При разработке новых модификаций методов имму-нохимического анализа целью является не только повышение чувствительности и специфичности тестов, но и возможность их максимальной автоматизации, а также экспрессность.
Любой метод диагностики описывает какой-либо биологический феномен в человеческом организме. Для того чтобы его выявление могло быть использовано в клинических целях, оно должно быть воспроизводимо и изучено применительно к стандартным клиническим задачам в разных популяциях больных. Диагностический тест представляет собой определение показателя с помощью конкретного лабораторного метода, аналитические параметры которого остаются на постоянном уровне при условии контроля качества выполнения. Вне за-
висимости от характера получаемых данных (качественные или количественные) результаты каждого исследования могут быть условно разделены на положительные и отрицательные (обычно для этого используется одна из границ нормы).
Основу иммунохимическо-го анализа составляет способность антител образовывать прочные высокоспецифичные комплексы с определенными антигенами (гаптенами). Реакция «антиген - антитело» проходит в строго количественном соотношении и используется в анализе для определения одного из этих реагентов. Измеряя количество антигена, который провзаимодействовал или не провзаимодействовал с антителами (либо наоборот), зная кинетику процесса иммунной реакции, можно рассчитать количество искомого анализируемого биомаркера. В зависимости от природы применяемой метки и способа ее детекции существует несколько видов иммунохимического анализа. Эти методы просты и высокочувствительны, не требуют дополнительной очистки или обогащения образцов, удобны при проведении серии тестов, особенно при работе с готовыми промышленными иммуно-диагностическими наборами реагентов. Все это позволяет отдавать им предпочтение при рутинной работе [4].
Выбор того или иного иммунохимического метода для проведения исследований зависит от задач последнего, экономических возможностей
Рис. 1.
Наиболее часто используемые форматы ELISA
и оснащения лаборатории. В клинических условиях рекомендуется применять инструментальные методы, такие как твердофазный гетерогенный иммуноферментный анализ, который отличается чувствительностью, специфичностью и пр. Используемые при этом стандартное оборудование и реактивы существенно повышают надежность диагностики, а полученные количественные результаты позволяют проводить более рационально дальнейший выбор схемы исследований. Для скринингового поиска биомаркеров во внелабо-раторных условиях используют иммунохроматографические тесты, но результат необходимо обязательно подтверждать.
Возможным направлением повышения диагностической эффективности молекулярных маркеров может стать одновременное определение их группы в сыворотке крови и моче [5]. Это даст в будущем возможность улучшить и оптимизировать выявление и прогнозирование заболеваний различного генеза, будет способствовать развитию новых направлений таргетной и клеточной терапии.
Иммуноферментный анализ (ИФА). Используется в разных отраслях медицины для качественного и количественного определения различных биомаркеров. Более чем за 40 лет своего существования ИФА в «классическом» формате
96-луночного микропланшета сумел прочно укрепиться на позициях «рабочей лошадки» в диагностических лабораториях различного профиля и масштаба. Причиной является уникальное сочетание в методике специфичности собственно иммунохимического анализа и высокой чувствительности детекции ферментативной метки, обеспечивающее надежность и информативность результата исследования.
В основе ИФА лежат специфичные взаимодействия антител и антигенов, называемые иммунологическими реакциями. Если в тестируемом образце нужно определить антигены, то в состав тест-системы должны входить соответствующие антитела, и наоборот. К счастью, сегодня лабораториям не приходится даже задумываться об этом, поскольку на рынке доступны многочисленные коммерческие наборы, в которые производителями включено все необходимое для проведения ИФА.
Данный вид анализа относится к методам связывания, отличительной особенностью которых является возможность определять количество анализируемого вещества не по биологической (функциональной) активности, а по количеству комплекса, образовавшегося при взаимодействии этого вещества со связывающим агентом и последующем
измерении его распределения между «свободной» и «связанной» фазами [6], для чего вводится ферментная «метка». Это стало возможным благодаря разработке процедур химического конъюгирования ферментов с иммунореагентами (прежде всего с антителами), которые сочетают высокий выход продукта, сохранение им иммунореактивности и высокой каталитической активности метки в составе получаемого конъюгата. Основным преимуществом использования в ее качестве фермента является то, что одна его молекула катализирует превращение в продукт многих молекул субстрата, тем самым существенно увеличивая регистрируемый сигнал [7].
Наиболее популярен до сих пор вариант последовательного гетерогенного ферментзависимо-го иммуносорбентного анализа -ELISA (рис. 1). В ходе исследования антиген, представляющий интерес, иммобилизуется путем прямой адсорбции в лунках микропланшета или связывается с иммобилизованными на его поверхности антителами. Затем он может быть определен с использованием первичных антител (прямая детекция) либо подобранного набора немеченых первичных и вторых антител (непрямая детекция), которые в обоих случаях конъюгированы с ферментной меткой [8].
Возможен и другой вариант, когда на первой стадии анализа антитела (антиген), адсорбированные на нерастворимом носителе или ковалентно связанные с ним, взаимодействуют с антигеном (выявляемым биомаркером) с образованием иммунокомплекса; последующее добавление конъюгата вторых антител с пероксидазой хрена, специфичных к другому эпитопу анализируемого маркера, приводит к образованию «сэндвич»-комплекса.
После отмывки несвязав-шихся компонентов реакционной смеси вносится субстрат для осуществления индикаторной ферментативной реакции. Подсчет результатов проводят с помощью калибровочного графика, отражающего зависимость оптической плотности раствора от концентрации изучаемого маркера [9].
Хотя «классический» ИФА и завоевал популярность в клинической лабораторной диагностике, актуальными остаются разработка и внедрение новых высокочувствительных, селективных и, что немаловажно, экспрессных методов определения биомаркеров.
Иммуносенсорные системы. Иммуносенсорные технологии сегодня находят широкое применение в целом ряде отраслей науки, промышленности, сельского хозяйства, медицины и здравоохранения, так как позволяют быстро и качественно анализировать сложные, многокомпонентные смеси веществ. Такие системы имеют преимущество при выполнении анализов, когда требуется высокая чувствительность определения. Это необходимо в медицинской практике для диагностики различных биологически активных соединений, для контроля качества продуктов питания, для проверки объектов окружающей среды на наличие остаточных количеств загрязнителей [10].
Иммуносенсоры состоят из двух компонентов: системы биохимического распознавания и преобразователя первичного сигнала (трансдьюсера), которые должны находиться в прямом контакте. Использование в качестве биораспознающего реагента антител или антигенов в иммобилизованном состоянии обусловливает уникальные особенности иммуносенсо-ров - высокую специфичность,
позволяющую количественно определять индивидуальное вещество (биомаркер) либо группу родственных веществ в смеси, а также способность осуществлять узнавание без дополнительных затрат энергии (повышения температуры, наложения потенциала и т.д.).
Наиболее просты в методическом отношении варианты систем, в которых формирующийся иммунный комплекс детектируется без специальных маркеров. Однако эти прямые сенсоры в большинстве случаев существенно уступают по пределу обнаружения аналита аналогичным системам, использующим ферментное или иное усиление.
Иммуноанализ на чипе по последовательности стадий совпадает с классическим твердофазным иммуноанали-зом. Принципиальное отличие состоит в том, что антитела иммобилизованы на крайне малом участке поверхности носителя (силикона, кварца, тефлона, поликарбоната и др.), имеющем площадь порядка 100 мкм2. Миниатюризация системы, в которой осуществляется исследование, приводит к сокращению времени, необходимого для формирования детектируемых комплексов. В результате длительность анализа может составлять 10-15 мин, вполне соответствуя современным представлениям об экспресс-ности.
Предложено немало модификаций иммуносенсоров, одной из которых является иммунобиосенсор на основе использования феномена поверхностного плазмонного резонанса [11]. На поверхности сенсорного чипа с напыленным слоем золота происходит взаимодействие иммунохимических компонентов реакции с образованием иммунокомплекса. Появляясь, дополнительный слой изменяет диэлектрические характеристики адсорбционного слоя, что приводит к транс-формармации в отраженном свете, который фиксируется детектором и преобразуется в резонансный сигнал (рис. 2А). Форма и амплитуда изменений последнего, которые происходят в результате связывания и диссоциации молекул с поверхностью сенсорного чипа, могут быть использованы для определения общей концентрации и кинетики взаимодействия (рис. 2Б). Ранее одним из ограничений этого метода являлась необходимость наличия сложного и дорогостоящего оптического оборудования, поэтому создание недорогих портативных приборов способствует более быстрому внедрению иммуночипов в практику.
Несмотря на то что современные технологии позволяют выявлять в биологических жидкостях специфические маркеры, уровень их чувствительности и точности недостаточен
Рис. 2.
Биосенсор на основе явления поверхностного плазмонного резонанса
Рис. 3.
Принцип
взаимодействия
иммунореагентов
на иммуно-
хромато-
графической
мембране
для определения чрезвычайно низких концентраций соответствующих веществ, характерных для начальной стадии заболевания [12]. Экспрессность, высокая чувствительность, возможность одновременного тестирования большого количества образцов и отсутствие особой необходимости предварительных операций по очистке и концентрированию анализируемого соединения вызвали пристальное внимание к возможности применения иммуносенсоров со стороны специалистов по клинической лабораторной диагностике.
В последние годы рассматриваются возможности использования иммуносенсор-ных технологий для раннего определения заболеваний (задолго до появления первых симптомов) и мониторинга иммунных реакций. Сигнальные трансдьюсеры иммуносенсо-ров основаны на взаимодействии «антиген - антитело», аналогичном другим методам иммуноанализа. Однако такие особенности, как моментальное и многократное получение информации, открывают перспективы для применения иммуносенсоров в неотложной
медицине для экспресс-мониторинга критических состояний, диспансеризации населения, эпидемиологических обследований, выявления отравлений, наличия наркотиков и лекарственных соединений, вирусных заболеваний, биологически активных соединений и др.
Иммунохроматографи-ческий анализ. Альтернативой «классическим» методам является иммунохроматогра-фический анализ, основанный на применении окрашенных мелкодисперсных маркеров, связывание которых в определенных зонах мембраны детектируется непосредственно в ходе движения жидкости. Наиболее распространенный показатель - частицы коллоидного золота диаметром от 5 до 50 нм [13, 14].
На пористой мембране иммобилизуют антиген либо специфичные к исследуемому антигену антитела и антивидовые антитела, позволяющие контролировать «работоспособность» теста. На другой участок тест-полоски наносят конъюгат специфических антител с коллоидным золотом. При погружении ее в пробу жидкость
поднимается под действием капиллярных сил и смывает конъюгат. Меченые антитела начинают с ее фронтом перемещаться по мембране.
Контролем сохранения тест-полоской функциональных свойств служит связывание избытка коллоидного конъю-гата с антивидовыми антителами, которое регистрируется по образованию окрашенной полосы в контрольной зоне. В случае иммобилизованных в аналитической зоне антител, формирование на тест-полоске одной окрашенной полосы свидетельствует об отрицательном результате анализа, двух - о положительном (антиген присутствует в концентрации не ниже контролируемой) (рис. 3А). Когда аналитическая зона представлена иммобилизованным антигеном, то появление одной полосы будет соответствовать положительному результату, а двух полос - отрицательному (рис. 3Б).
В отличие от других методов иммуноанализа имму-нохроматография не требует никаких дополнительных реагентов, поскольку все необходимые компоненты заранее нанесены на мембрану, и контакт тест-полоски с пробой инициирует всю описанную последовательность процессов. Возможность за короткое время получить результаты в виде визуально детектируемой качественной («да-нет») информации обусловливает интенсивное развитие этого направления и производства коммерчески доступных тестов [15].
Стабильность иммунохро-матографических тест-систем, однозначность интерпретации результатов и, как следствие, достоверность анализа обеспечиваются за счет многокомпонентного состава тест-полоски. Аналитическая мембрана изготовлена из нитроцеллюлозы,
которая эффективно связывает (адсорбирует) белки без дополнительной обработки, что позволяет формировать аналитическую и контрольные зоны. В зависимости от особенностей определяемого антигена и иммунореагентов выбираются мембранные носители, отличающиеся по размерам пор, сорбционной емкости и другим параметрам [16]. Следствием этого является определенная вариабельность продолжительности анализа. Тем не менее мембранная иммунохромато-графия, как правило, позволяет проводить исследование в течение 5-10 минут.
Иммунохроматографиче-ские тест-системы просты и удобны в использовании (позволяют получить результат без специального оборудования и навыков), надежны (достоверность достигает 92-99%, при этом каждая имеет встроенный внутренний контроль), экономичны (требуют минимальных затрат на проведение обследования). Являясь эффективным средством диагностирования, экспресс-тесты позволяют визуально в течение нескольких минут определить и оценить содержание широкого спектра биомаркеров.
Перспективы развития средств иммунохимического анализа. Использование биологических маркеров многими экспертами видится в области, прежде всего, дополнительного скрининга заболеваний различного генеза. С этой целью предлагается система муль-тимаркерной диагностики с параллельным выполнением тестов по нескольким показателям, начиная с наиболее чувствительных и заканчивая наиболее специфичными, что позволяет повысить диагностическую и прогностическую ценность иммунохимического анализа [17].
Иммуноферментный, иммуносенсорный и иммуно-хроматографический методы широко применяются во всех основных областях медицины (онкологии, иммунологии, неврологии, эндокринологии, кардиологии, акушерстве, аллергологии, токсикологии и др.) и в других направлениях биологических дисциплин, экологии, фармакологии и т.д. Они являются родственными, имеют общую схему методологического решения: взаимодействие иммунореагентов, процедура мечения антител (антигенов), формирование детектирующих иммунных комплексов путем связывания и др.
Тенденции в разработке новых иммуноаналитиче-ских систем и рост объемов их производства в мире позволяют считать, что в ближайшие десятилетия иммунохимический анализ будет крайне востребован для решения многих задач аналитической химии, включая такие важные области, как медицинская диагностика, охрана окружающей среды, контроль качества продуктов питания и многие другие. Иммунобиотех-нология сегодня обеспечивает производство не только наборов для выявления биомаркеров, но и различных компонентов (антигенов-стандартов, антител, меченых антигенов, разделяющих систем, буферных растворов, иммобилизованных реагентов и т.д.) и оборудования для проведения исследования.
Внедрение иммунохими-ческих методов определения биомаркеров позволит обнаружить опасные заболевания на ранних стадиях и предотвратить их прогрессирование, значительно снизить затраты на лечение, сократить смертность населения, увеличить продолжительность его жизни и повысить ее качество.
Иммуноанализ продолжает развиваться в соответствии с новыми научными и технологическими решениями и находит новые области применения. Можно ожидать, что будущее принадлежит двум направлениям: совершенствованию методик иммуноанализа с высокой чувствительностью и многопараметрическому анализу.
See:
http://innosfera.org/2014/06/immunochemical
Литература
1. Dowd J.B., Zajacova A. Does self-rated health mean the same thing across socioeconomic groups? Evidence from biomarker data // Ann. Epidemiol. 2010, №20(10). P. 743-749.
2. Biomarkers Definitions Working Group. Biomarkers and surrogate endpoints: preferred definitions and conceptual framework // Clin. Pharmacol. Ther. 2001, №69. P. 89-95.
3. Wang J., Balu N., Canton G. et al. Imaging biomarkers of cardiovascular disease // J. Magn. Reson. Imaging. 2010, №32(2). P. 502-515.
4. Изотов Б.Н., Козлов А.А., Диденко Е.С. и соавт. Методы химико-токсикологической диагностики в мониторинге ситуации с потреблением наркотиков в России // Наркология. 2004, №8. С. 33-36.
5. Баныра О.Б., Строй А.А., Шуляк А.В. Маркеры опухолевого роста в диагностике рака почки // Экспериментальная и клиническая урология. 2011, №4. С. 72-78.
6. Пивень Н.В., Бураковский А.И. Методы иммунохими-ческого анализа с использованием меченых реагентов // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2012, №1. С. 93-102.
7. Иммуноферментный анализ / под ред. А.М. Егорова. - М., 1988.
8. Пивень Н.В., Орлова Е.Е., Лухверчик Л.Н. Иммуноферментный анализ аутоантител к декарбоксилазе глютаминовой кислоты - маркера сахарного диабета 1 типа // Вестник фонда фундаментальных исследований. 2009, №1. С. 70-77.
9. Пивень Н.В., Бураковский А.И. Современные модификации иммунохимических диагностикумов: экспресс-методы // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2012, №3. С. 6-12.
10. Преснова Г.В., Рубцова М.Ю., Егоров А.М. Электрохимические биосенсоры на основе пероксидазы хрена//Рос.хим. ж. 2008. Т. 52, №2. С. 60-65.
11. Бураковский А.И. Методы иммунобиосенсорного анализа: принципиальные основы и возможности практического использования // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2008, №1. С. 11-15.
12. Дембски С., Пробст Й., Геллерманн К. и соавт. Многофункциональные наночастицы для биомедицины // Нано-индустрия. 2012, №2(12). С. 56-59.
13. Проблемы аналитической химии. Биохимические методы анализа / под ред. Б.Б. Дзантиева. - М., 2010.
14. Wang S., Zhang C., Zhang Y. Lateral flow colloidal gold-based immunoassay for pesticide // Methods Mol. Biol. 2009, №504. P. 237-252.
15. Posthuma-Trumpie G.A., Korf J., van Amerongen A. Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey // Anal. Bioanal. Chem. 2009, №393(2). P. 569-582.
16. Бызова Н.А., Сафенкова И.В., Чирков С.Н. и соавт. Разработка иммунохроматографических тест-систем для экспрессной детекции вирусов растений // Прикл. биохимия и микробиология. 2009, №45. С. 225-231.
17. Березин А.Е. Клиническое и прогностическое значение биологических маркеров в стратификации пациентов с кардиоваскулярными заболеваниями // Укр. Мед. Часопис. 2010, №6(80). С. 79-85.
