CC BY
114
ИСТОРИЯ БИОМЕДИЦИНЫ
К СТОЛЕТИЮ ИММУНОХИМИИ
Иммунохимия: вековой путь от реакции агглютинации до
лигандного иммуноанализа
Сто лет назад, в 1907 г. в г.Нью-Йорке была издана книга под названием "Иммунохимия", пpинадлежавшая пеpу выдающегося шведского химика Сванте Аррениу-са, за три года до этого удостоившегося Нобелевской премии по химии за pазpаботку теоpии электролитической диссоциации. Выход в свет даже небольшой книги с таким названием ознаменовал "pождение" самостоятельной области иммунологии, охватывающей широкий круг вопросов о химической природе антигенов и антител и механизмах их взаимодействия, а также о принципах их использования в диагностике инфекционных заболеваний.
Говоpя о возникновении иммунохимии, нельзя не отметить, что цепь событий, котоpые составили предтечу появления упомянутой выше книги, была тесно связана с бактеpиологией и началась на 20 лет pаньше - с пеpвых лабоpатоpных наблюдений, посвященных изучению механизмов фоpмиpования поствакцинального иммунитета. В этой связи нельзя не вспомнить, что в пеpиод с 1880 г. по 1885 гг. Луи Пасте» pазpаботал вакцины против холеpы куp, сибирской язвы и бешенства и убедительно доказал их эффективность.
Пpовеpяя высказанные pанее пpедположения Дж.Листеpа и других ученых о наличии у крови защитных свойств в отношении патогенных бактерий, в 1886 г. В.К.Высокович установил, что введенные в кровяное русло бактерии быстро исчезают из циркулирующей крови, независимо от вида бактерий и организма животного. Им была высказана мысль о том, что кровь, по-видимому, содержит какие-то вещества, пагубно действующие на бактерии.
В 1887 г. Иосиф Фодор в Будапештском университете впервые доказал, что свежая кровь обладает бактерицидной активностью в отношении сибиреязвенных бацилл. В том же году Шарль Рише и Пьер Эрикур в институте Пастера в Париже, отметив аналогичную активность крови, показали, что она ощутимо повышается после иммунизации (предварительного введения в организм животных этих же микроорганизмов). Независимо от них этот же феномен был описан в 1888 г. Джоном Наттолом в Лондоне.
В 1888 г. румынский бактериолог Виктор Бабеш показал, что сыворотка крови, полученная у собак, подвергшихся иммунизации вакциной Пастера против
бешенства, при введении невакцинированным собакам, способна предохранять последних от заболевания.
Эти факты указывали на то, что иммунизация обусловливает образование в организме каких-то веществ, способных губительно воздействовать на микроорганизмы. Однако, первоначально отмеченную способность крови связали с наличием в ней чувствительного к нагреванию белкового вещества, присутствие которого в сыворотке крови впервые в 1889 г. обнаружил немецкий врач Ганс Бюхнер, назвавший его "алексином" (греч. aleksein-защищать).
В 1889 г. Анри Шари и Жак Роже в институте Пас-тера установили, что сыворотка крови животного, вакцинированного определенным видом бактерий, приобретает способность склеивать эти бактерии, причем эта способность сохраняется после прогревания сыворотки и, потому, не может быть связанной с термолабильным алексином. Это наблюдение подтвердило справедливость гипотезы о том, что в сыворотке крови после вакцинации действительно появляются какие-то вещества, способные эффективно противостоять патогенным микроорганизмам и защищать организм от инфекции.
И, наконец, в 1890 г. ученики Роберта Коха немец Эмиль фон Беринг и японец Шибосабуро Китазато обнаружили, что вскоре после введения животным небольших (несмертельных) доз дифтерийного токсина, в сыворотке их крови появляются вещества, нейтрализующие этот токсин не только in vivo (в организме животных, защищая их от гибели), но и in vitro. Такую сыворотку исследователи назвали "антитоксической сывороткой". Отметим, что позднее, в 1901 г. Беринг был удостоен Нобелевской премии за использование антитоксической сыворотки для лечения дифтерии.
В том же году на Международном съезде врачей в Берлине Э.Беринг выдвинул теорию, согласно которой приобретенный иммунитет формируется в результате появления в сыворотке крови особых факторов, имеющих гуморальную (жидкостную) природу. Эта теория получила название гуморальной теории иммунитета и уже вскоре получила ряд убедительных подтверждений.
В 1891 г. итальянские исследователи Д.Тиццони и Д.Каттани из сыворотки крови животного, иммунизированного столбнячным токсином, методом высали-
вания выделили вещество, "отвечающее" за нетрализа-цию токсина и по свойствам соответствующее белкам. Авторы назвали его "антитоксином". В том же году Эр-лих показал, что введение животным токсинов растительного происхождения также вызывает выработку у них антитоксинов, нейтрализующих эти токсины.
В 1894 г. Рихард Пфейффер и В.И.Исаев установили при внутрибрюшинном ведении холерных вибрионов животным, предварительно иммунизированным этим микроорганизмом, происходит растворение бактериальных клеток (вибриолиз). Это указывало на то, что в крови иммунизированных животных появляются субстанции, названные учеными "лизинами".
В 1896 г. Макс Грубер и Герберт Дурхэм детально изучили ранее описанный А.Шари и Ж.Роже феномен склеивания бактериальных клеток в их суспензии после ее смешивания с сывороткой иммунизированных животных и назвали его агглютинацией. Соответственно, обусловливающие его вещества были названы "агглютининами".
В 1897 г. Рудольф Краус показал, что в сыворотке иммунизированных бактериями (брюшного тифа, холеры и чумы) животных присутствуют вещества, вызывающие помутнение (преципитацию) не только самих бактерий, но и продуктов их жизнедеятельности. Феномен был назван "преципитацией", а обусловливающие его компоненты иммунной сыворотки - "преципитина-ми".
Следует заметить, что к этому времени уже стало очевидным, что в реализации приобретенного иммунитета, направленного не только против живых, но и убитых, микроорганизмов, а также против их токсинов, важную роль играют вышеупомянутые вещества, появляющиеся в сыворотке крови животных и человека только после иммунизации.
Эти вещества, в противовес бактериальным или микробным "телам" (так в тот период именовали бактерии) еще в 1891 г. Пауль Эрлих условно назвал "противотелами" или "антителами" (немец. - апйкогрег; англ.- antibody; лат.-antisoma). Однако термин "антитела" (АТ) прочно закрепился в литературе в указанном выше смысле лишь после публикации в 1897 г. статьи Эрлиха, внесшей немалый вклад в дальнейшем развитии иммунохимии.
В этот же период формировались основы представлений о том, что доступные для визуального наблюдения in vitro феномены - агглютинация, преципитация или лизис бактериальных клеток являются результатом взаимодействия АТ с веществами, стимулирующими их выработку в организме и способными связываться с АТ.
Первоначально эти вещества именовали "агглю-тиногенами" и "преципитогенами", т.е. порождающими агглютинины и преципитины и, отождествляли с бактериями. Однако, вскоре было доказано, что стимулировать выработку АТ способны клетки и вещества небактериального происхождения.
В 1898 г. Ж.Борде продемонстрировал у животных образование агглютининов и лизинов в ответ на введе-
ние им гетерологических эритроцитов, а год спустя Ф.Я.Чистович и, независимо от него, Дж. Наттол показали появление в крови животных преципитинов после введения им сывороток или гомогенатов тканей других животных. В это же время Карл Ландштейнер и И.И.Мечников показали, что вскоре после введения в кровь животному взвеси сперматозоидов их сыворотка приобретает способность парализовать движение этих клеток (действующие таким образом АТ были названы "цитотоксинами"). Кроме того, Мечников идентифицировал АТ, вырабатываемые в ответ на введение животному гетерологических лейкоцитов.
Эти факты косвенно указывали, что стимуляция образования в организме АТ вызывается не самими бактериями или иными клетками, а лишь входящими в их состав некими веществами, которые сами по себе, будучи введены в организм, способны вызывать в нем образование АТ.
Иными словами, в самом конце XIX в. назрела необходимость введения единого собирательного термина для обозначения входящих в состав бактерий и иных клеток и присутствующих в составе продуктов их жизнедеятельности веществ, попадание которых в организм приводит к образованию в нем соответствующих антител. Таковым стал впервые использованный венгерским бактериологом Ладиславом Дейчем в 1899 г. обобщающий термин "антиген" (АГ), по сути, являвшийся удобной аббревиатурой латинского словосочетания "antisoma-genus", означающего "порождающий антитело".
Надо признать, что дефициния антигенности как способности веществ, с одной стороны, вызывать, при парентеральном введении в организм, образование в них антител, а с другой стороны, связываться с этими антителами как in vivo, так и in vitro, оставалась незыблемой на протяжение почти 60 лет. Лишь успехи в изучении роли клеточных факторов иммунитета, достигнутые к середине 60-х гг. ХХ в. расширили смысловое содержание термина "антиген" и показали, что иммунология охватывает более широкий круг проблем, выходящих далеко за рамки учения о невосприимчивости к инфекционным заболеваниям.
Характеризуя начальный этап развития иммунохимии, нельзя не отметить, что важный вклад в ее развитие и, в итоге, гуморальной теории иммунитета внесли исследования Жюля Борде, работавшего в институте Пастера и впоследствии (в 1919 г.) удостоенного Нобелевской премии.
Изучая свойства различных антител, он еще в 1898 г. показал, что одни и те же АТ могут обусловливать как агглютинацию, так и преципитацию, в зависимости от особенностей объектов, содержащих соответствующие АГ. Заключение Борде о том, что одни и те же АТ способны обусловливать несколько различных по проявлениям биологических эффектов уже в 1915 г. легло в основу "теории единства антител" развитой Гансом Цин-сером в США.
Кроме того, Борде еще в 1895 г. показал, что для разрушения (лизиса) бактериальных клеток под
действием АТ (лизинов) ш vitro абсолютно необходимо наличие в пробирке еще одного дополнительного компонента нормальной (неиммунной) сыворотки. Им оказался упоминавшийся выше алексин, который Борде назвал "комплементом" (от лат. сотр1етепШт - дополнение).
Оказалось, что лизины, сами по себе, не способны разрушать бактерии или иные чужеродные клетки - содержащая их иммунная сыворотка приобретает бактерицидное действие только благодаря присутствию в ней комплемента. Более того, в присутствии комплемента свойства лизинов могут проявлять как агглютинины, так и преципитины.
Борде доказал, что процессы лизиса бактерий и других клеток, несущих на себе АГ, сыворотками иммунизированных животных являются результатом совместного действия двух веществ: термостабильного и специфического, присутствующего только в сыворотках иммунизированных этими клетками животных (АТ), и термолабильного и неспецифического, присутствующего в нормальных сыворотках (комплемент). При этом, АТ, связываясь с соответствующим АГ, формируют комплекс, способный сорбировать из сыворотки и связывать комплемент, который разрушает оболочку бактерий и других клеток. Этот феномен Борде назвал "связыванием комплемента".
Необходимо особо подчеркнуть, что развитие концепции АГ, как противоположности АТ, с самого начала приобрело неоценимое практическое значение. Реально ощутимыми плодами ее развития врачи смогли воспользоваться уже в конце 90-х гг XIX в - ими стали разработанные серологические реакции, значительно облегчившие лабораторную диагностику некоторых инфекционных заболеваний.
Самую первую из них - реакцию агглютинации в 1896 г. Феликс Видаль предложил использовать в диагностике брюшного тифа. Позднее реакцию преципитации для диагностики сибирской язвы предложил использовать итальянец Альберто Асколи. В 1901 г. в Германии Пауль Уленгут на основе реакции преципитации предложил метод, позволяющий отличить кровь человека от крови животных, пригодный для проведения судебно-биологической экспертизы.
В 1901 г. Ж.Борде и Октав Жангу разработали принципиально новую серологическую реакцию для диагностики коклюша, в основу которой был положен феномен связывания комплемента. При взаимодействии АГ бордетелл с АТ к нему образовывался комплекс, связывающий комплемент сыворотки и, тем самым, лишающий ее способности лизировать вводимые в реакцию эритроциты. С помощью этой реакции стало возможным выявлять и количественно оценивать содерждание в сыворотках даже таких АТ и АГ, которые не обладали способностью вызывать видимые на глаз агглютинацию или преципитацию соответствующих антигенов. Отметим, что вариант этой реакции, разработанный в Германии в 1903 г. Августом Вассерманом долгие годы во всем мире использовался для диагностики сифилиса.
Эти, по существу эмпирические разработки, зало-
жили основы чрезвычайно перспективного направления лабораторной диагностики инфекционных болезней, позднее названного "серологической диагностикой" и ознаменовали рождение нового направления прикладной иммунологии - иммуносерологии или просто серологии.
Вскоре выявилась еще одна обширная и не менее важная область применения серологических реакций -определение групп крови человека. В 1901 г. австриец К.Ландштейнер, используя реакцию агглютинации эритроцитов, показал существование трех, отличающихся в антигенном отношении, групп крови. Это не только разъяснило причины неудачных гемотрансфу-зий, но и открыло новые возможности для использования метода переливания крови, положив начало использованию серологических реакций в гематологии. За исследования в этой области в 1930 г. Ландштейнер был удостоен Нобелевской премии.
Позднее выяснилось, что серогические реакции могут успешно использоваться при изучения таксономических взаимооотношений организмов и определения видовой принадлежности белков.
Наряду с важным прикладным значением, концепция антигенов и антител в дальнейшем стала одной из важнейших концепций иммунологии. Будучи исключительно плодотворной в научно-методическом отношении, она создала необходимые предпосылки для последующего бурного развития иммунологии, в целом.
Следует вновь повторить, что в формировании этой концепции, основ иммунохимии и, в итоге, в развитии гуморальной теории иммунитета Беринга-Коха неоценимый вклад внесли научные исследования выдающегося немецкого ученого Пауля Эрлиха. В его, упоминавшейся выше статье, изданной в 1897 г. автор охарактеризовал основные биологические свойства АТ, которые он рассматривал как особый вид белковых молекул, вырабатываемых в определенных клетках в ответ на попадание в организм АГ и способных, распознавая их, вступать с ними в серологическое взаимодействие. Он полагал, что АТ обладают постоянной химической структурой и особой пространственной конфигурацией (конформацией), благодаря которым обеспечивается строгая специфичность и избирательность взаимодействия АТ с конгруентными (пространственно комплементарными) им фрагментами молекул АГ - в результате их строго взаимного пространственного соответствия по типу "ключа и замка". Позднее, проводя аналогию между взаимодействием АГ с АТ и химической реакцией, Эрлих впервые наметил реальные пути для количественного изучения этого процесса. И, наконец, в этой статье были представлены основы первой научно обоснованной теории о механизме выработки АТ, вошедшей в литературу под названием "теории боковых цепей".
Заметной вехой в развитии концепции АГ и АТ стало издание упоминавшейся выше книги Аррениуса "Иммунохимия", давшей название новому разделу иммунологии. Ее автор, рассматривая взаимодействие АГ и АТ с позиции химика, впервые широко использовал
ставшие впоследствие общепринятыми, словосочетание "реакция АГ-АТ" и термин "валентность" в отношение АТ. Он проводил аналогии между этой реакцией и химической реакцией, полагая что она протекает в со-оответствии с законом действия масс. Считая ее полностью обратимой, он проводил параллель между этой реакцией и реакцией нейтрализации слабой кислоты слабым основанием. Более того, он математически рас-читал основные параметры этой реакции и рассмотрел условия ее протекания, указав на основные факторы, способные влиять на этот процесс и проанализировал возможности количественной оценки серологической активности АТ и АГ.
Выход этой книги ознаменовал окончательное формирование научных основ иммунохимии, которая стала тем теоретическим базисом, на котором происходило не только совершенствование существовавших в тот период серологических методов, но и дальнейшее, на протяжение почти полувека, развитие всей иммунологии, как науки.
В то же время, книга явилась лишь развитием взглядов Эрлиха, который в начале ХХ в. считался не только лидирующим сторонником гуморальной теории иммунитета, но и ее главным идеологом, а сегодня должен быть по праву признан создателем иммунохимии.
В 1908 г П.Эрлиху за развитие гуморальной теории и И.И.Мечникову за развитие клеточной теории иммунитета была присуждена Нобелевская премия, что стало официальным признанием ценности обеих теорий иммунитета. Именно поэтому многие авторитетные ученые считают 1908 г. годом, когда иммунология окончательно сформировалась в самостоятельную науку.
Однако, необходимо подчеркнуть, что именно развитие иммунохимии и ее прикладных областей на протяжении более полувека обеспечило прогресс в иммунологии в целом. И поскольку именно успехи иммунохимии, в основном, обеспечили создание научно-методической основы современной клеточной иммунологии, ниже мы коснемся ее важнейших достижений за минувшее столетие.
В первую очередь, отметим успехи в изучении природы АТ и их химической структуры. Принадлежность АТ к глобулиновым белкам была очевидна уже в конце XIX века. Однако, гетерогенность АТ по молекулярной массе была доказана лишь в 30-е гг. ХХ в, когда благодаря использованию метода ультрацентрифугирования, было показано, что существуют два типа АТ, отличающихся по седиментационным свойствам, имеющие константы седиментации 7S и 19S. В 1937-1939 гг. шведский биохимик Арне Тизелиус с помощью электрофореза в геле разделил сывороточные белки крови на фракции и показал, что АТ относятся к гамма-глобулинам. С того времени АТ долго именовали "гамма-глобулинами". Позднее выяснилось, что в составе гамма-глобулинов сыворотки АТ представлены несколькими субфракциями - в 1948 г. Р.Дерр две основные из них предложил обозначить буквами G (general) и M (major) и назвать их "иммуноглобулинами". Выясни-
лось также, что иммуноглобулин М по свойствам близок к макроглобулину, описанному Бен-Джонсом у больных миеломной болезнью еще в середине XIX в.
Молекулярную структуру АТ удалось "расшифровать" лишь через двадцать лет. В 1958 г. англичанин Родни Портер установил молекулярную структуру 7S-антител и дал общую характеристику их строения, а в 1959 г. американец Джеральд Эдельман определил аминокислотную последовательность в тяжелых цепях этих антител. Оба этих исследователя в 1972 г. были удостоены Нобелевской премии.
В 1964 г. комитет экспертов ВОЗ рекомендовал выделить 3 класса АТ, а для их обозначения в дальнейшем использовать, ранее предложенный Дерром термин "иммуноглобулины" и соответствующие аббревиатуры -IgG ^-антител), IgM (для ^-антител) и IgA. Сегодня термин "иммуноглобулины" рассматривается как полный синоним термина "АТ". В 1966 г. японец Кими-сиге Исидзака выявил в сыворотке крови IgE и продемонстрировал его идентичность "реагинам", АТ участвующим в развити аллергии. Позднее был идентифицирован еще один иммуноглобулин - IgD.
Без определенного ответа долго оставался вопрос о том, какие клетки вырабатывают АТ, хотя И.И.Мечников еще в 1903 г. высказал предположение об их продукции фагоцитирующими клетками. Позднее образование АТ связывали с клетками ретикуло-эндотелиальной системы. И только в 1948 г. Астрид Фагреус доказала, что ведущую роль в выработке АТ играют плазматические клетки. В 1963 г. Нильс Ерне и Алекс Нордин разработали весьма простой метод непосредственного выявления in vitro и подсчета антитело-образующих клеток. Было установлено, что непосредственными предшественниками этих клеток являются особые лимфоциты, которые с 1969 г. стали называться В-лимфоцитами.
К этому времени уже был достигнут существенный прогресс в понимании истинной роли АТ в функционировании иммунной системы. Вспомним, что первым теоретическим "мостиком", связавшим гуморальную и клеточную теории иммунитета стал, отмеченный Ж.Дени и Ж.Лекле еще в 1894 г. и детально описанный в 1904 г. англичанином Элмротом Райтом феномен усиления фагоцитоза под влиянием иммунной сыворотки, названный им "опсонизацией фагоцитоза", а АТ, которые обусловливали такое действие сыворотки -"опсонинами".
Спустя 65 лет, после того как были раскрыты основные принципы кооперации Т- и В-лимфоцитов, стало ясно, что АТ являются не только важнешим фактором гуморального иммунитета, но и непосредственно участвуют в формировании большинства реакций, развиваемых элементами клеточного звена иммунной системы.
Были разработаны высокопрецизионные методы очистки антител на основе гель-хроматографии, аффинной хроматографии и электрофореза. Разработаны подходы к оценке серологической активности антител и объективному определению степени их сродства к соответствующим АГ - т.е. количественной оценке свойства
АТ, в свое время названного Р.Краусом "авидностью".
Существенно углубилась и на основе новых иммунологических концепций расширилась и теоретическия база иммунохимии.
Понятие специфичности АТ было сформулировано Эрлихом еще в 1900-1904 гг., однако механизмы ее обеспечения оставались неясными до начала 60-х гг. ХХ в. Первым шагом в теоретическом осмыслении основ специфичности явилась разработка клонально-селекци-онной теории образования антител Ф.Бернета, который в 1960 г был удостоен Нобелевской премии за исследования в области иммунологии. Вслед за ним существенный вклад в познание генетических механизмов детерминации разнообразия АТ и обеспечения специфичности их иммуннологической активности внес работавший в Швейцарии японский иммунолог Сусуми Тонега-ва, удостоенный Нобелевской премии в 1987 г, а также Питер Догерти и Рольф Цинкернагель, также удостоенные Нобелевской премии в 1996 г. за исследования механизмов специфичности иммунного ответа.
Особого упоминания заслуживает разработка технологии получения моноклональных антител (МАТ), за которую их создатели Джордж Келер и Сезар Мильш-тейн, которые вместе с Н.Ерне, в 1984 г. стали лауреатами Нобелевской премии.
Основываясь на результатах работ Окада и Барского, еще в конце 50-х гг. ХХ в. установивших способность клеток животных, при участии вируса Сендай, сливаясь друг с другом, образовывать жизнеспособные гибридные клетки. К 1975 г. Келер и Мильштейн осуществили гибридизацию миеломной клетки и В-лимфоци-та, выделенного из организма, иммунизированного определенным АГ. Полученные клетки-гибриды обладали способностью бесконечно размножаться в питательной среде (за счет пролиферативного потенциала миеломной клетки) и вырабатывать соответствующие АТ со строго определенной специфичностью (за счет стимулированного В-лимфоцита). Продуцируемые этими клетками АТ, названные МАТ, обладали необычайно высокой специфичностью, исключавшей возможность перекрестных реакций. Технология получения МАТ, названная гибридомной, позволила получать их в практически неограниченных количествах, а их применение резко повысило специфичность серологических исследований и расширило их аналитические возможности.
Значение этого открытия трудно переоценить и сегодня, поскольку именно применение МАТ позволило совершить переворот не только в иммунологии, но и в таких областях медицины, как онкология, гематология и транспланталогия. Для демонстрации общенаучного значения МАТ достаточно лишь отметить, что вся современная классификация иммуноцитов и мембран-но-клеточных рецепторов основана на их иммунофено-типировании с помощью МАТ.
За минувшие годы были существенно пересмотрены представления об АГ и их отдельных свойствах.
Уже за первое десятилетие ХХ в. было установлено, что категория специфичности АГ не абсолютна.
Еще в 1904 г Ф.Обермейер и С.Пик, обрабатывая белковые АГ некоторыми веществами, наблюдали измение их специфичности. В 1907 г. П.Уленгут показал, что организмы, принадлежащие к разным биологическим видам, могут обладать общими АГ, а 1909-1911 г. шведский ученый Джон Форссман изучая такие АГ, назвал их "гетерогенными". Уже позднее, в 1938 г. когда Дж.Маррек ввел понятие об "антигенных детерминантах", стало ясно, что такие АГ не являются структурно тождественными, а имеют лишь несколько сходных антигенных детерминант - степень такого сходства достаточна для перекрестного взаимодействия с гомологичными АГ. Это и обусловило появление их второго названия - "перекрестнореагирующие" АГ.
К 1917 г. К.Ландштейнер показал существование неполноценных АГ и назвал их "гаптенами" - они вызывали образование АТ только в случае, если до введения в организм их присоединить к, тем или иным, макромолекулам, например, к альбумину. Необходимо отметить, что изучение АГ самого организма, начавшееся с работ Ландшнейнера по исследованию АГ эритроцитов и идентификации групп крови человека, в итоге обеспечило зарождение иммуногенетики и создало теоретический базис для развития транспланталогии.
Основными вехами развития этого направления иммунохимии можно считать открытие в 1940 г. Ландштейнером и Винером эритроцитарных АГ, определяющие резуспринадлежность крови и идентификация АГ тканевой совместимости: они впервые были идентифицированы в США в 1948 г Джорджем Снеллом у мыши (система Н2), а в 1957 г. во Франции Жаном Доссе у человека (система ^А). В 1980 г. авторы этих открытий, сместе с Б.Бенацеррафом были удостоены Нобелевской премии. Позднее американец Пол Терасаки создал досточно простой серологический метод для определения этих антигенов, значительно упростивший подбор органов и тканей для пересадки конкретному реципиенту.
В 1953 г. Э.Витебский, развивая гипотезу о патогенезе аутоиммунных заболеваниях, четко очертил понятие об аутоантигенах.
Большие успехи были достигнуты в технологии выделения АГ и их очистки. Первоначально антиген-ность приписывали только белкам. Однако уже в 1917 г. А.Доше и О.Эйвери, а вслед за ними и другие авторы показали наличие у пневмококков АГ, относяшихся к полисахаридам. В 1933 г. Андре Буавен впервые химическим методом выделил соматический АГ грам-отрицательных бактерий, являвшийся липополиса-харидлом. Были выделены и АГ других бактерий и вирусов, а в конце 70-х гг. ХХ в - и из опухолевых клеток (существование опухолеспецифических АГ было показано еще в конце 40-х гг ХХ в.). Технология выделения и очистки АГ позволила широко использовать их в разработке тест-систем для серологических реакций.
Изучение химической природы многих АГ позволило осуществить химический синтез некоторых из них. После разработки методов генной инженерии некоторые из белковых АГ были получены путем кло-
нирования соответствующих генов в прокариотных клетках.
К середине 60 гг. прошлого века, когда клеточная иммунология начала свое бурное развитие, представление об АГ было частично пересмотрено. Если первоначально под антигенностью понимали способность вызывать в организме выработку специфических антител, то в новой трактовке образование антител в ответ на АГ стало рассматриваться лишь как одна из иммунологических реакций, иницируемых АГ. При этом, определяющим свойством АГ была признана генетическая чу-жеродность.
Кроме того, были детально изучены кинетические параметры реакции "АГ - АТ" и раскрыты механизмы их взаимодействия. Были разработаны основные принципы исследования этого процесса и влияние на него целого ряда факторов различной природы.
Так, на смену представлениям Аррениуса о строгом соответствие количественных показателей реакции АГ-АТ химическим законам, в 1920 г. пришла концепция Борде о том, что АГ и АТ способны соединяться в различных пропорциях. Далее в 1934 г. в Лондоне была издана книга Дж.Маррека "Химия антигенов и антител", в которой он заложил основы гипотезы о поливалентности АГ и предложил концепцию соединения АГ и АГ в "решетку". В конце 30-х гг. ХХ в эта гипотеза получила развитие в работах М.Хейдельберга и особенно такого крупного ученого как Лайнус Полинг, выдвинувшего теорию о том, что продуктом реакции АГ-АТ является молекулярный "каркас".
И, наконец, широкое применение иммунохимичес-ких методов в иммунологических исследованиях создало основу для доказательств реального существования самостоятельных иммунологически обусловленных механизмов, не связанных с распознаванием АГ и участием в них АТ, но не менее важных по значению для организма.
Впечатляющие успехи были достигнуты и в области совершенствования серологических методов и их применения в иммунодиагностике инфекционных заболеваний.
Еще в начале ХХ в. была показана способность АТ и многих АГ адсорбироваться на поверхности инертных частиц различной природы (и в том числе, некоторых клеток) - последние при этом приобретали соответствующие серологические свойства. Однако разработка серологических методов на основе использования таких частиц, сенсибилизированных АГ и/или АТ (они получили название суспензионных АГ и АТ) началась лишь с середины 40-х гг.
Использование в реакции агглютинации суспензионных реагентов обеспечивало ощутимое увеличение объема образующегося агглютината (что позволяло визуализировать результаты реакций с участием значительно меньших количеств АГ и АТ) и, соответственно, повышение чувствительности исследования. Такие реакции назвали реакциями непрямой (пассивной) агглютинации. Наиболее известными среди них стали различные варианты реакции пассивной гемагглюти-
нации, впервые разработанные в 1946 г. М.И.Соколовым и А.Т. Кравченко, и независимо от них, УБойденом в 1949 г.
Не менее важный вклад в развитие методического арсенала иммунохимии внесли реакции иммунодиф-фузии. Возможность протекания серологических реакций в гелевой среде была впервые показана еще в 1903 г., однако первый вариант такой реакции, пригодный для использования в практике был разработан в США Джоном Удиным лишь в 1946 г. Более перспективном оказалась реакция двойной иммунодиффузии в геле, разработанная в 1948 г. шведским ученым Орианом Оухтерлони. Позднее, на ее основе в 1963 г. Г.Манчини с коллегами разработали широко использовавшийся метод количественного определения иммуноглобулинов в сыворотке крови. Уместно заметить и то, что именно воспользовавшись этой реакцией в 1963 г. Б.Бламберг впервые идентифицировал поверхностный АГ вируса гепатита В и за это открытие в 1976 г. был удостоен Нобелевской премии. Эти серологические реакции и сейчас успешно используются для решения многих диагностических и аналитических задач.
Прогресс в иммунохимии в немалой степени был обусловлен привлечением в ее арсенал новых физических, химических и биохимичеких методов исследования.
К примеру, Теодор Андерсон и Уиндел Стенли еще в 1941 г. посредством электронного микроскопа визуализировали процесс взаимодействия АТ с АГ вируса табачной мозайки. На основе этого феномена в 1969 г. американская исследовательница Джун Альмейда разработала новый высочувствительный метод исследования - иммуноэлектронная микроскопия. Кстати уместно отметить, что с помощью именно этого метода в 1972-1973 гг. были впервые идентифицированы рота-вирус - возбудитель вирусного гастроэнтерита, а также открыт вирус гепатита А.
В 1949-1951 гг. в институте Пастера Пьер Грабар разработал метод иммуноэлектрофореза, ставшего новым препаративным методом, сочетавшим в себе достоинства электрофореза и преимущества реакции имму-нодиффузии в геле. Этот метод в свое время широко применялся для скрининга крови на АГ вируса гепатита В. Позднее, в 1979 г. Джордж Таубин на основе электрофоретического разделения белковых АГ разработал метод иммуноблотинга, позволяющий выявлять АТ к отдельным белкам и сегодня остающийся одним из основных методов в серологической диагностике ВИЧ-инфекции.
Важной вехой в развитии иммунохимии явилась разработка метода химического связывания (конью-гирования) АТ с флюоресцирующими красителями, осуществленная Альфредом Кунсом в 1941 г. На основе использования таких АТ и люминисцентного микроскопа им был разработан "метод флюоресцирующих АТ", оказавшийся универсальным иммунохимическим методом, превосходившим многие другие серологические методы как по чувствительности и специфичности, так и по широте возможностей и областей практическо-
го использования.
Помимо утилитарного значения, эта разработка имела и ценное научно-методическое значение, поскольку косвенно продемонстрировала реальность возможности использования в иммунохимических исследованиях АТ, связанными с "метками" иной природы.
Эта возможность реализовалась уже в конце 50-х годов, когда была показана возможность использования в качестве такой "метки" радиоактивных изотопов. Интересно, что метод, основанный на использовании АТ и АГ, связанных с радиоактивными изотопами, получивший название радиоиммунологического метода, впервые был предложен не для серологической диагностики, а для количественного определения в крови гормонов и, лишь позднее стал использоваться в диагностике инфекций, в основном, вирусной этиологии.
Этот метод, по чувствительности в десятки тысяч раз превосходящий реакцию агглютинации, произвел настоящую революцию не только в серологии, но и в таких областях, как эндокринология, биохимия и многих других и обеспечил возможность определять нано-и пикограммовые количества многих АГ различного происхождения, белков и многих других веществ, обладающих не только антигенной, но и гаптенной активностью.
Не останавливаясь на деталях, демонстрирующих исключительное научно-методологическое значение создания этого метода, представленное в посвященной этому методу Юбилейной статье (Биомедицина, 2004, N.3), здесь мы лишь отметим, что в 1977 г один из его авторов - Розалинд Яллоу была удостоена Нобелевской премии.
Особо отметим, что принципы использования меченных радионуклидами АТ и АГ, в дальнейшем легли в основу целого поколения новых высокочувствительных иммунохимических тестов, получивших общее название методов "лигандного иммуноанализа" - ligand-binding assays. Эти методы объединяю две важнейшие особенности.
Во-первых, они основаны на использовании АТ и АГ, тем или иным способом, связанных с какими-либо "метками" - веществами, присутствие и количество которых в системе реагирующих компонентов может быть определено с помощью соответствующих физических, биохимических и даже биологических методов. В разное время в этом качестве предлагалось использовать хемолюминисцентные вещества, рассеивающие электроны, свободнорадикальные соединения, а также физиологически и фармакологически активные вещества, и в первую очередь, ферменты. Во-вторых, несмотря на различную природу меток, они основаны на общем принципе постепенного насыщения антител, связанных с соответствующей меткой (меченный лиганд) антигеном, в качестве которого выступает определяемая биосубстанция (свободный лиганд).
В конце 60-х гг. были разработаны принципы получения АТ и АГ, иммобилизованных (фиксированных) на поверхности твердых пластиковых или иных носителей. Использование таких носителей, обобщенно обоз-
начаемых как "твердофазных" значительно облегчило процедуру разделения связанного и сободного лиган-дов. Радиоиммунологический метод, воспроизводимый на таких носителях получил название "твердафазного" или "радиоиммуносорбентного".
Самым популярным методом лигандного иммуноанализа стал иммуноферментный метод, технологическая основа которого была создана в 1966 г., когда были разработаны первые методы получения энзиммеченных АТ - ковалентного связанных с пероксидазой АТ, сохраняющих свои серологические свойства. С этой целью в качестве "сшивающего" агента Сол Эвреймес во Франции предложил глутаральдегид, а Пол Накейн в США - перийодат натрия.
Уже в 1971 г. Ева Энгвалл в Швеции и С.Эвреймес в Париже независимо друг от друга разработали твердофазный иммуноферментный метод, пригодный для количественного определения концентрации IgG в сыворотке крови. Дальнейшее совершенствование этого метода привело к тому, что сегодня он практически полностью вытеснил другие серологические методы из широкой лабораторной практики и уже повсеместно применяется не только в серологической диагностике инфекционных и ряда неинфекционных заболеваний, но и в качестве высокоточного метода определения десятков биохимических и иммуноактивных субстратов (гормоны, опухолевые маркеры и др.).
Итак, иммунохимия, как учение о химической природе АГ и АТ и механизмах их взаимодействия, сформировалась сто лет назад на основе результатов проведенных бактериологами еще в конце XIX в. эмпирических наблюдений за взаимодействием бактерий и иммунных сывороток. И если столетие назад иммунохимия практически полностью исчерпывала содержание иммунологии, как науки в целом, то сегодня она является лишь одним из разделов современной иммунологии.
Вместе с тем, констатируя этот факт, следует признать, что иммунохимия, оказалась одним из самых плодотворных разделов иммунологии, а ее развитие обогатило науку открытием новых ранее неизвестных физико-химических и биологических свойств АТ, АГ и их комплексов. Пройдя путь от изучения реакции агглютинации до широкого применения во многих областях биологии и медицины современных методов иммунохи-мического анализа, она оказала мощное стимулирующее влияние на развитие многих других разделов иммунологии и полностью изменило лицо современной иммунологической диагностики инфекционных и многих неинфекционных заболеваний.
В заключение следует подчеркнуть, что развитие этого направления продолжается и наверняка приведет нас к новым технологиям диагностики и терапии, способным решить задачи, все еще стоящие перед медицинской наукой и практической медициной.
М.К.Мамедов Национальный центр онкологии, г.Баку
