CC BY
48
УДК 616.523:577.217.5:618.344
М.Т.Луценко
ПРОЦЕССЫ СИНТЕЗА БЕЛКА В СИМПЛАСТЕ ХОРИОНА ПРИ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
ГУ Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН
РЕЗЮМЕ
Изучали на ультрамикроскопическом, люминесцентном и гистохимическом уровне взаимоотношение нуклеиновых кислот, гистонов и кислых белков в ядрах симпласта в плаценте беременных на высоте обострения герпес-вирусной инфекции. Причиной фетоплацентарной недостаточности, развивающейся при герпес-вирусной инфекции, является внедрение в цитоплазму симпласта хориона вирусов герпеса, провоцирующих высокий синтез серотонина и перекисное окисление липидов, нарушение связи ДНК с гистонами и усиливающееся метилирование дезоксирибонуклеиновой кислоты. Снижается синтез РНК в цитоплазме хориального симпласта.
SUMMARY
M.T.Lutsenko
PROTEIN SYNTHESIS IN CHORION SYMPLAST IN HERPES-VIRUS INFECTION
Ultramicroscopic, luminescent and histo-chemical methods were used to study relationship of nucleic acids, histones and acid proteins in symplast nuclei in placentas of pregnant women with acute herpes infection. Fetoplacentar insufficiency can be attributed to herpes virus penetrating into cytoplasm of chorion symplast. This virus results in increased serotonin synthesis, lipid peroxidation, disturbed link between histones and DNA and increased desoxyribonucleic acid methylation. Synthesis of RNA is increased in chorion symplast.
Исследования выполнялись на плацентарном материале от беременных, перенесших герпес-вирус-ную инфекцию (острый период) - 30 беременных. Контрольная группа - плаценты от беременных, у которых не было никаких заболеваний (n=15).
Материал фиксировался в спирт-формалине и заливался в парафин. Одновременно материал фиксировался в 2,5% глютаральдегиде на 0,1М какодилат-
ном буфере с постфиксацией в 2% растворе четырех-окси осмия для ультрамикроскопического исследования на электронном микроскопе Tesla BS-540. Содержание серотонина изучали с помощью люминесцентного анализа с использованием для фиксации 2% раствора глиоксалевой кислоты.
Гистоны окрашивались в 0,125% растворе амидочерного Б при рН 8,2 в течение 20 мин. при температуре 25°С. Окрашивание ДНК проводилась галло-цианином при рН 1,64 в течение 48 часов. Как дополнительный, был использован метод окрашивания хроматина сафранином. Разрыхление хроматина ядер проводилось 4М раствором мочевины при 60°С в течение 60 мин. Удаление гистонов, богатых лизином проводили 0,6 М раствором NaCl при температуре 60°С в течение 60 мин., гистоны богатые аргинином в 1,5 М NaCl при 60°С в течение 60 мин.
Метильные группы окрашивались 0,1% азура А при рН 6,2 37°С в течение 20 мин. Деметилирование проводилось в 1% растворе КОН на 70% спирте в течение 30 мин. при комнатной температуре с последующим окрашиванием в растворе азура А при рН 6,2 в течение 20 мин. Препараты подвергались цито-фотометрическому анализу на цитофотомере фирмы «Mecos».
Механизмы метилирования ДНК
Во всех клетках ДНК содержит метилированные основания двух классов. К одному из них относится тимин, участвующий непосредственно в синтезе ДНК. Другой класс метилированных ДНК составляют основания в качестве 5-метилцитозина и 6-метил-аденина. Эти основания метилируются уже в составе построенного полидезоксирибонуклеотида [3].
5-Метилцитозин и 6-метиладенин содержаться в ДНК бактериофагов Т2, Т4, Т7, Р1. Никакого метилирования ДНК на уровне полинуклеотидов не обнаружено у вирусов папилломы и простого герпеса I. Источником метилирования нуклеиновых кислот является метионин и в основном при участии его S-аденозилметиониновой формы.
S-аденозилметионин формируется из тиминаде-нозинфосфата (ТАФ) и метионина с помощью активирующего фермента S-аденозилметионинсинтетазы
(SAM). Процесс этот протекает следующими образом: метионин+АТФ^^ЛМ^-пирофосфат+Р неорганический. SAM является посредником при очень многих реакциях трансметилирования и является довольно универсальным донором СН3-групп не только при метилировании ДНК и РНК, но и других самых разнообразных веществ - белков: креатина, холина, алколоидов, стеринов, жирных кислот, ряда сульфгидрильных соединений и многих других веществ. В условиях недостатка СН3-групп все эти основания могут конкурировать с нуклеиновыми кислотами за один и тот же донор - СН3-группы.
Реакцию метилирования ДНК можно себе представить следующими образом: ДНК+S-аденозилме-тионин^-ДНК-метилаза^-метил-ДНК+З-аденозилго-моцистеин. Эта реакция необратима. Так после добавления в реакционную среду S-аденозил-гомоцистеина обратного переноса СН3-групп с ДНК не наблюдается. Скорость реакции пропорциональна концентрации фермента. S-аденозилгомоцистеин ингибирует реакцию метилирования.
Сильное увеличение ДНК-метилазной активности наблюдается в клетках, зараженных разными фагами, что, по-видимому, можно объяснить появлением специфических фаговых метилаз, относящихся к так называемым «ранним белкам». Через 2 мин. после заражения фагом Т2 активность ДНК метилазы в клеточных экстрактах увеличивается в 16 раз, а через 15 мин. - в 220 раз по сравнению с незараженными клетками Е.соИ [2].
Вероятно, что появляющейся после заражения фагами и вирусами ДНК-метилазой является вновь образовавшиеся белки, структура которых закодирована в фаговой ДНК. Этот фермент не отличается по своей специфичности от ДНК-метилазы хозяина [5]. Однако, по мнению других исследователей, образующаяся метилаза более стабильна и отличается от метилазы клетки-хозяина.
Метилирование аденина в Nj-положении снижает упорядоченность конформации молекул поли-А, лишает ее матричной активности и способности образовывать комплексы с поли-V. Метилирование углерода пиримидинов в 5-м положении способствует возникновению упорядоченной конформации у одноцепочечных полимеров и значительно стабилизирует двутяжные полинуклеотиды. Замещение даже одного атома водорода в ^-положении СН3-группой является серьезным препятствием для образования нормальных водородных связей и комплементарных взаимодействий полинуклеотидов.
Необходимо оценить, как влияет метилирование на считывание с ДНК информации. Метилированные основания в ДНК могут иметь значение определенных точек начала и конца считывания информации с ДНК [2]. Считывание информации в широком смысле может зависеть от степени модификации ДНК вследствие ее метилирования. Не исключено, что такая модификация ДНК может иметь регуляторное значение при избирательном запуске или наоборот, прекращение считывания информации с определенных генов. Такая ситуация имеет место при клеточ-
ной дифференцировке. У низших организмов метилирование обычно происходит непосредственно при репликации ДНК. У них перед репликацией ДНК должна быть прометилирована. У высших позвоночных синтез высокой организации и дифференцировка клеток возможны на базе неметилированной ДНК.
Плотность ДНК при развитии зародыша не отличается от плотности ДНК гамет вплоть до стадии бластулы и только на стадии поздней бластулы она немного изменяется, становясь более выраженной уже в период гаструляции, приближаясь по своей плотности ДНК диплоидных клеток взрослого организма.
В это же время отмечаются и изменения в метилировании ДНК. Возможно, что эти изменения в эмбриогенезе являются следствием метилирования или действия других энзиматических модификаций ДНК с участием метилаз. Напрашивается гипотеза о химической основе клеточной дифференцировки как следствии последовательной энзиматической модификации ДНК. Последовательности, выполняющие функции стартовых точек для считывания ряда сцепленных генов, могут одновременно быть специфическими местами метилирования цитозина и последующего дезаминирвоания 5-МЦ. Дезаминирование 5-МЦ под влиянием 5-МЦ-аминогидролазы может привести к возникновению тимина. В результате этих изменений в цепи ДНК вместо цитозина окажется тимин и возникает некомплентарная пара оснований Т-Г. Такое нарушение спаривания оснований и может послужить началом считывания информации с ДНК. При репликации одна из цепей такой измененной ДНК дает нормальную дочернюю молекулу с парой Г -Ц, а другая образует отличную ДНК с парой АТ в том же месте немодифицированная молекула при репликации будет сохранять информацию зародышевой линии, а измененная молекула ДНК будет представлять информацию дифференцирующихся клеток.
Вероятно, эта гипотеза объясняет, как программа дифференцировки может быть закодирована в самой ДНК и реализуется при спонтанном синтезе модифицирующих ДНК ферментов. Появление тимина в ДНК может проходить различными путями. В основном он возникает уже в цепи ДНК обычным путем. Минорная же часть видимо может возникать уже на готовой цепи ДНК путем дезаминирования 5-МЦ.
Нарушения в считывании информации ДНК могут играть не последнюю роль в процессе старения [2]. Искажения в метилировании ДНК вносят ошибки при считывании информации, что приводит к преждевременному старению организма в целом [14]. Метилирование локусов, связанных в 5' промоторных регионах Срв-островков коррелирует с молчанием экспрессии эстрагеновых рецепторов, что приводит к дисгормональным явлениям, создающим предпосылки к злокачественному росту клеток молочной железы [16].
Таким образом, метилирование, удаление или трансформация «минорных» оснований ДНК имеют весомое значение в процессах клеточной дифферен-цировки, мутагенеза и канцерогенеза. Возможно, что метилирование цитозина с последующим его дезами-
нированием и превращением в тимин могло бы явиться одним из путей регуляции частоты или удаления мутаций на пути превращения ГЦ-пар в АТ-пары. Регуляция и контроль за такого рода энзиматическими системами может быть одной из возможных функций гена-мутанта.
Некоторые алкилирующие агенты: диметилнитро-замин, метилметансульфонат, Ы-метил-Ы-нитрозуретан и другие увеличивают частоту мутаций и являются сильными канцерогенами. Их действие в направлении вызывания канцерогенеза связывают с метилированием различных оснований в нуклеиновых кислотах. В ДНК они метилируют в основном гуанин и образуют Ы-метилгуанин [9, 11, 12, 13, 20, 22].
Ы-метилгуанин при репликации ДНК или образовании иРНК может спариваться с тимином вместо цитозина. После такого метилирования возможны ошибки, как при репликации ДНК, так и при считывании с нее информации. В нуклеиновых кислотах опухолей сильно возрастает количество «минорных» оснований, особенно это обнаруживается в тРНК. Предполагается, что метилазы нуклеиновых кислот могут играть роль своеобразных естественных канцерогенов. Это может осуществляться ферментами, которые вносятся в клетки одноклеточными вирусами или же при генетической рекомбинации.
Исследования генетического материала клетки показывает, что мутация в определенном локусе во многом зависит не только от генетических, но и от эпигенетических факторов - наследственные и ненаследственные изменения в экспрессии конкретного гена без каких-либо соответствующих структурных изменений в его нуклеотидном коде.
В настоящее время большое внимание уделяется процессам метилирования ДНК, которые приводят к нарушению клеточной дифференцировки, инактивации Х-хромосомы и изменяют процесс репликации ДНК.
Большая роль в этом отводится Срв-островкам в промоторных районах, которые в таких условиях аномально метилируются и подвергаются полной инактивации. Даже без изменения нуклеотидной последовательности гена он теряет свою активность, что можно назвать функциональной делецией [4].
В процессе метилирования меняется только одно основание ДНК-цитозин с помощью ДНК-метилтрансферазы, которые переносят метильную группу 8-аденозилметионина. Метилцитозин в свою очередь удаляется из ДНК ферментом гликозилазой или ДНК-демитилазой. В этом процессе осуществляется деметилирование, не нарушая целостности ДНК.
Тканеспецифические гены не имеют в своих промоторах Срв-островков, в них имеются одиночные Срв-динуклеотиды, степень метилирования которых варьирует в широких пределах в разных клетках и тканях и препятствует связыванию факторов транскрипции.
Метилирование способствует инактивации экспрессии генов свойственной своей наследственной направленности, так как метильные группы внедряясь в ДНК препятствуют связыванию специфических элементов транскрипции. Точнее метильные группы
связывают транскрипционный репрессор МеСР2, который содержит корепрессор и диацетилазу гисто-нов.
Деацетилирование гистонов приводит к более плотной упаковке нуклеосом и вызывает инактивацию гена. Таким образом, метилирование ДНК и де-ацетилирование гистоновых белков являются взаимодополняющими процессами, участвующими в изменении структуры хроматина и приводящими соответственно к отсутствию экспрессии генов без их структурных нарушений.
Метилирование ДНК - основной эпигенетический механизм, обеспечивающий передачу распределения генной активности между клетками в ходе развития
Согласно новейшим сведениям [6] у высших организмов важным эпигенетическим процессом может быть химическая модификация ДНК. В управлении генетическим переключением в развивающихся клетках может участвовать присоединение метиль-ной группы к цитозиду. По-видимому, от одного поколения клеток к другому передаются без изменений не какие либо белки, а метильные группы в составе ДНК. Наличие или отсутствие метильных групп служит сигналом для регуляторных белков. Эти белки в последующем взаимодействуют с ДНК в дочерних клетках так же, как в родительской клетке. Метилированный цитозин становится неактивным и блокирует присоединение к ДНК активаторов транскрипции или же содействует связыванию репрессоров.
В организме группы клеток подвергаются координированным изменениям в ответ на внеклеточные сигналы, называемые индукторами. Сигналы воспринимаются клеточной мембраной и передаются в ядро, где они влияют на транскрипцию генов. Экспериментальные исследования показали, что присутствие метильных групп связано не просто со снижением уровня генной экспрессии, но почти всегда с полной инактивацией. Изменения же нуклеотидной последовательности в промоторных участках, где инициируется транскрипция, часто имеют модулирующий эффект, это тоже указывает, что сигнал в виде метиль-ной группы - более специфичный регулятор гена [7,
8, 9, 10, 15, 17, 21].
Подтверждается факт наследуемости характера метилирования ДНК. Так введенная в культуру клеток инородная ДНК сохраняла этот характер во многих клеточных поколениях. Процесс деметилирования происходит в отсутствие репликации ДНК и регулируется тканеспецифичными белками, тем самым выполняя задачи избирательной активации генов. Если подействовать на клетки химическими реагентами, вызывающими деметилирование ДНК (лекарственный препарат 5-азацитидин), который включается в ДНК вместо цитидина, происходит ингибирование метилазы и не осуществляется включение ме-тильных групп в ДНК.
После воздействия на клетки азацитидином активность генов возрастала на 10-30%. Таким образом
можно утверждать, что метилирование ДНК - важный эпигенетический фактор в развитии высших организмов. Кроме нарушения нормальных процессов метилирования, оно играет большое значение в развитии старения клеток и превращения нормальных клеток в раковые.
Значимость метилирования цитозина для происходящих в клетке процессов подтверждается тем, что оно наблюдается у многих видов животных. Однако при этом нельзя не учитывать, что этот процесс протекает в комплексе с другими явлениями клеточного метаболизма, в числе которых нужно учитывать и взаимодействие ДНК с белками, передачу сигнала с клеточной мембраны на хромосомы, межклеточные взаимодействия.
Подходя к вопросу регуляции процессов развития зародыша и плода у высших млекопитающих, нас, прежде всего, привлекает внимание при этом состояние чрезвычайно важной структуры, условно разделяющей организм матери и плода и одновременно постоянно обеспечивающей единство фетоплацентарной системы - фетоплацентарного барьера.
Особо построенная морфологическая структура -хориальный симпласт, обеспечивает с одной стороны удаление ненужных продуктов метаболизма от развивающегося плода, с другой стороны обеспечивает постоянно поступление жизненноважных продуктов, обеспечивающих построение и регуляцию роста плода. Благополучие этого гомеостаза будет зависеть от морфофункционального состояния ДНКП ядерного аппарата симпласта и отвечающей этим условиям работы цитоплазматической системы. Очень часто возникающие поломы в формировании зародыша на ранних стадиях развития, безусловно, зависят в основном от функционально-генетического благополучия фетоплацентарного барьера. Нарушения энзиматического статуса в хориальном симпласте, вызываемые эпигенетическими факторами, к числу которых, прежде всего следует отнести появляющиеся нейрогормо-нальные или метаболические нарушения в организме беременной - резко меняют условия диффе-ренцировки и роста зародившегося материала. Как мы излагали выше, эпигенетические воздействия на ДНК вызывают к действию перестройку локу-сов генетического аппарата ядер симпласта, выражающегося в перераспределении процентного содержания на цитозиновых нуклеотидных метиль-ных групп.
Избыточное метилирование ДНК в данной ситуации крайне тревожное явление, так оно влечет за собой изменения в транскрипции белков, обеспечивающих в привычных для нормы, функционирование фетоплацентарного барьера.
В условиях развития человеческого организма еще более грозным осложнением для фетоплацентарной системы становится активизация представителей третьего мира, постоянно присутствующих в нашем организме - персистирующих вирусов. Нам известно, что основные нервные центры и ядра человека наводнены 8 серологическими группами герпесной инфекции, склонной к активизации в период на-
чинающейся беременности.
Очень важно представлять себе, каковы пути распространения герпесной инфекции не только в организме хозяина, но и как она пересекает фетоплацентарный барьер в сторону развивающегося плода.
При переходе фетоплацентарного барьера вирусами герпеса развивается либо «мирный» вариант, при котором не задеваются интересы генетического аппарата ядер симпласта, или происходит повреждение и мутация генного аппарата ядерных элементов хориона, что известно приведет к репликации ДНК вирусов на ядрах симпласта.
Нами обнаружено на электронно-микроскопическом уровне внедрение возбудителя в цитоплазму хориального симпласта, изменение ее нормальной структуры, что выражается в разрушении митохондрий и появлении мелкопузырчатых образований. Вирусные частицы вступают в контакт с оболочкой ядер (рис. 1, 2).
В цитоплазме симпласта вырабатывается большое количество серотонина (рис. 3). В симпласте хориона отмечается интенсивная реакция на гистамин (рис. 4) и перекисное окисление липидов (рис. 5).
Белки хроматина
В составе хроматина большая часть приходится на гистоны, они вступают через ионные связи с ДНК. Катионные группы гистонов нейтрализуют фосфатные группы ДНК. Для того, чтобы в ДНК кислотные группы были полностью связаны с основными белками должно быть соотношение 1,35:1. Группы гис-тонов отличаются друг от друга по аминокислотному составу: первая группа гистонов богата лизином и бедна аргинином, вторая фракция содержит эти ами-
Рис. 1. Фетоплацентарный барьер ворсинки хориона из плаценты беременной, перенесшей на 24 неделе вспышку герпес-вирусной инфекции. Участок с частицами возбудителя, тесно контактирующей с ядерной оболочкой. Увеличение х 40000.
Рис. 2. Фетоплацентарный барьер. Ворсинки хориона плаценты беременной, перенесшей на 24 неделе вспышку герпес-вирусной инфекции. В цитоплазме симпласта многочисленные вакуоли с частицами возбудителя. Увеличение х 40000.
Рис. 4. Фетоплацентарный барьер. Ворсинки хориона плаценты беременной, перенесшей на 24 неделе вспышку герпес-вирусной инфекции. В цитоплазме симпласта накопление гистамина. Реакция по Шампи. Увеличение 40 х 15.
Рис. 3. Участок плаценты беременной, перенесшей на 24 неделе вспышку герпес-вирусной инфекции. В цитоплазме симпласта накопление серотонина. Люминесцентная микроскопия. Увеличение 15 x 20.
Рис. 5. Ворсинки хориона плаценты беременной, перенесшей на 24 неделе вспышку герпес-вирусной инфекции. Реакция на перекиси жирных кислот в симпласте хориона. Реакция по Винклеру. Увеличение 15 x 40.
нокислоты в равных количествах; третья и четвертая группы отличаются бедным содержанием лизина и богаты аргинином.
Используя растворы различной ионной силы можно последовательно извлекать из ДНК различные гистоны. Так 0,6 М раствором №С1 можно извлекать только гистоны первой фракции (гистоны богатые лизином). Раствором 0,8-1,5 М №С1 экстрагируют гистоны второй фракции. И, наконец, гистоны III и
IV фракций экстрагируют более высокими концентрациями солей. Это позволяет оценивать роль различных фракций гистонов в работе ДНКП.
Матричная активность ДНК в составе хроматина зависит от количества связанного с ней гистона. Простая экстракция гистона из хроматина приводила к повышению синтеза ДНК в ядре (рис. 6). Синтез ДНК прямо пропорционален его количеству не связанному с гистоном. Следовательно, гистоны являются репрессорами матричной активности ДНК в составе хроматина. Было обнаружено, что в зоне гистонов содержится РНК от 0,01 до 0,05% от массы ДНК, отличной от других известных типов РНК. Эта хромосомная РНК, по-видимому, связана с белком, так как устойчива к действию РНКазы. Хромосомная РНК отделяется от ДНК хроматина нагреванием растворов, что может свидетельствовать о ее комплементарной связи с ДНК.
Хромосомная РНК комплементарно связана с белком, который с помощью водородных связей комплексируется с гистонами. Специфичность репрессирующего действия гистонов определяется специфичностью отдельных молекул хромосомной РНК, которая связывается с определенными местами на ДНК. К такому комплексу затем присоединяется гис-тон. Чтобы вызвать полную диссоциацию ДНК и гистонов, нужно на них подействовать 2 М №С1.
Гистоны действительно могут закрывать ДНК в
хроматине и прекращать ее работу в качестве матрицы для синтеза РНК, но этот эффект неспецифичен. Но нужно учесть, что и другие негистоновые белки ответственны за обнажение специфических последовательностей на ДНК [18].
Вероятно ацетилирование гистонов более сильный фактор, регулирующий синтез новых РНК на ранее репрессированных генных локусах. Другой признак активного хроматина - фосфорилирование серина в ядерных белках, в том числе в гистонах. Фосфорилирование связанных с хромосомами белков влияет на взаимодействие ДНК с гистонами и приводит к сдвигу от компактного неактивного состояния к диффузному активному. Дефосфорилирование может снова привести к плотному скручиванию комплекса ДНК-гистон.
Гистоны связываясь с ДНК, вызывают агрегацию хроматина в условиях растворов с ионной силой близкой к физиологическим растворам (0,05-0,2 М №С1). Это свойство гистонов может отражать их структурную функцию. Удаление части гистонов с помощью 0,6 М №С1 приводит к растворению осадка хроматина. Обработка хромосом трипсином приводит к их набуханию и диспергированию [1]. Все приведенные выше факты свидетельствуют, что гистоны поддерживают и определяют структуру хроматина и хромосом, а точнее они, взаимодействуя с ДНК функционируют не только как репрессоры, но и как факторы структуризации хроматина. Гистоны могут образовывать мостики между молекулами ДНК, что может приводить к скручиванию ДНК в составе хроматина и хромосом. Структуризация ДНП и репрессия матричной активности связаны между собой. Обработка ДНП 4 М раствором мочевины приводит к растворению ДНП без потери его белковых компонентов. При этом нити ДНП утончаются. Вероятно, мочевина нарушает слабое взаимодействие типа водородных связей и возможно гидрофобные взаимодействия, ответственные за образование сшивок между разными участками молекулы ДНП или между молекулами ДНП.
Гистоны играют большую роль в структуризации хроматина не только на уровне макромолекул. Известно, что ядра многих клеток обладают двумя формами хроматина: компактным-плотным и диффуз-ным-рыхлым. В ядрах лимфоцитов образование компактных масс хроматина связано с высоким содержанием в них лизинового гистона. Зоны плотного хроматина, как правило, неактивны в отношении синтеза ДНК, в то время как диффузные зоны хроматина предшественники РНК.
Если экстрагировать гистоны, богатые лизином, то хромосомы разрыхляются и под электронным микроскопом они имеют вид сетчато-фибриллярных структур. Добавление к хромосомам гистонов богатых аргинином не приводит к восстановлению структуры хромосом. Считают, что гистоны, богатые лизином, образуют поперечные сшивки между фибриллами ДНП.
У беременных женщин, не выявлявшихся признаков герпесной инфекции во время гестации в симпласте хориона определялось до 25% ядер, содержавших
=&■
■ т
I т,? „25&
■ ^
Рис. 6. Фетоплацентарный барьер. Ворсинка хориона плаценты беременной, перенесшей на 8 неделе вспышку герпес-вирусной инфекции. В симпласте хориона интенсивный синтез ДНК в ядрах симпласта. Окраска амидочерным. Увеличение 40 х 15.
62,8±1,3 усл.ед. ДНК. После проведенной реакции деметилирования и подсчета ДНК на условную единицу ядерного вещества содержание ее составило 172,2±3,4 усл.ед. Число таких ядер определялось в пределах 70-75%. Окраска проводилась двумя методами: сафранином и галлоцианином. Применяя деметилирование, мы освобождаем хроматин ядра от ме-тильных групп и определяем истинное содержание ДНК, которое избирательно окрашивается галлоциа-нином или сафранином.
У беременных, перенесших вспышку герпесной инфекции на 24 неделе, было установлено, что до этапа деметилирования в среднем на единицу хроматина ядра приходилось до 54,6-55,0±1,8 усл. ед. ДНК. После проведенного деметилирования содержание ДНК определялось до 141,0±3,9 усл. ед. Таким образом, до метилирования плотность хроматина в ядрах симпласта хориона была в 2 раза выше, чем в ядрах симпласта контрольных исследований. Соотношение плотности ядер между неметелированным и демети-лированным в симпласте в контрольной группе со-
62,8 ед. 115П „ ф
ставил---------= 1,15. При герепесной инфекции этот
54,6 ед.
б 172 ед. 12
показатель был практически тот же---------= 1,2.
141 ед.
Таким образом, истинное содержание ДНК в ядрах симпласта практически было одно и тоже, речь шла только о присоединении к ДНК большого количества метильных (блокирующих) групп при обострении герпес-вирусной инфекции.
Метилирование ДНК в ядрах влияет на связь ДНК с гистонами. Как показывают наши исследования, при вспышке герпесной инфекции в симпласте фетоплацентарного барьера число гистоновоокрашенных ядер увеличивалось до 85,0±2,8%. При контрольных исследованиях число амидоокрашенных ядер не превышало 10,0±0,7%. Эти показатели совпадали и при окрашивании препаратов плаценты и азуром I.
Наконец мы применили реакции, показывающие уровень синтеза и связи образующихся в симпласте хориона РНК. Для этой цели в контрольных исследованиях и при герпес-вирусной инфекции мы обрабатывали препараты плаценты в течение 60 мин. 0,6 М раствором №С1. После такой обработке в контрольной группе беременных на единицу площади симпласта приходилось 137 усл.ед. РНК. У лиц, перенесших герпесную инфекцию, количество РНК на единицу площади симпласта определялось в пределах 115-120 усл. ед. Содержание РНК в ядре определяли до и после обработки препаратов последовательно вначале в 4 М мочевине в течение 1 часа, а затем в 0,6 М №С1 в течение 60 мин.
Мочевина применялась с целью разрыхления белков, связанных с ДНК. До воздействия мочевины и №С1 плотность ядра на единицу площади составила в контроле 230 ед., после экстракции белков с помощью 0,6 М №С1 - 119 ед. Коэффициент элюции составил 1,9. При герпес-вирусной инфекции плотность ядерного вещества симпласта до элюции составила 165 усл. ед., после - 150 усл. ед., коэффициент элю-
ции - 1,1.
Обращает на себя внимание, что уже до экстракции белков из ядра их содержание в хроматине ядер симпласта хориона при герпесной инфекции было на 30% меньше по сравнению с контролем, а после экстракции удалялось в контроле до 50% белков. При герпес-вирусной инфекции белков в ядре оставалось меньше, поэтому процент экстракции составил не более 9-10%. Таким образом, синтез РНК в ядре, по-видимому, при герпесной инфекции в ядре снижен почти в 4 раза.
Заключение
Фетоплацентарый барьер при вспышке герпесвирусной инфекции в период беременности подвергается атаке со стороны возбудителя инфекции. В симпласте хориона отчетливо при электронномикроскопическом анализе обнаруживаются вирусные тельца. Это приводит к ряду глубоких ферментативных и структурных изменений. Прежде всего, следует обратить внимание на следующие перестройки в симпласте хориона:
1. Активизация синтеза серотонина.
2. Увеличение содержания катехоламинов и НАДФН-синтазы.
3. Накопление в цитоплазме симпласта гистамина.
4. В ядрах симпласта нарушается связь ДНК с гистонами, делая открытой дезоксирибонуклеиновую кислоту для синтеза ДНК возбудителя.
5. Подавляется синтез РНК в цитоплазме симпласта.
6. Увеличиваются количество метильных групп на молекулах ДНК, инактивируя тем самым ее участие для метаболических процессах.
ЛИТЕРАТУРА
1. Буш Г. Гистоны и другие ядерные белки.-М.: Мир, 1967.-285 с.
2. Ванюшин Б.Ф. Метилирование ДНК и его биологическое значение//Успех современной биоло-гии.-М.: Наука, 1989.-Т.65, вып.2.-С.163-185.
3. Дэвидсон Дж. Биохимия нуклеиновых кислот.-М.: Мир, 1976.-412 с.
4. Залетаев Д.В., Немцова М.В., Бочков Н.П. Метилирование ДНК как этиологический фактор канце-рогенеза//Иммунология.-2002.-Т.19.-С.6-11.
5. Хесин Р.Б., Богданова Е.С. Биохимия.-М.: Наука, 1999.-405 с.
6. Холлидей Р. Эпигенетическая наследственность (В мире науки).-М.: Мир, 1989.-№8.-С.30-38.
7. Crooks P., Triber M., Pinney R. Inhibition of bacterial DNA cytosine-5-methyltransferase by S adeno-syl-L-homocysteine and some related compounds//J.Pharm. Pharmacol.-1984.-Vol.36, №2.-P.85-89.
8. Goorha R., Granoff A., Willis D., Murti K. The role of DNA methylation in virus replication: inhibition of frog virus 3 replication by 5-azaoytidine//Virology.-1984.-Vol.138, №1.-P.94-102.
9. Goto K., Numata M., Komura J. et al. Expression of DNA methyltransferase gene in mature and immature neuron as well as proliferating cells in mice//Tohoku University, Japan. Differentiation.-1994.-Vol.56, №1-2.-
P.39-44.
10. Harris L.G., Remack J.S., Brenet T. In vitro methylation of the human 0-6-methylguanine-DNA methyltransferase promoter reduces transcrip-tion//Biochim. Biophys. Acta.-Vol.1217, №2.-P.141-146.
11. Hoffman R. Altered methionine metabolism, DNA methylation and oncogene expression in carcinogenesis. A review and synthesis//Biochim. Biophys. Acta.-1984.-Vol.738.-P.49-87.
12. Laird P., Jaenisch R. DNA methylation and can-cer//Hum. Nol. Genet.-1994.-№3.-P.1487-1494.
13. Leteurtre F., Kohlhagen G., Fesen M., Tani-zawa A. Effects of DNA methylation on topoisomerase I and II cleavage activities//J. Biol. Chem.-1994.-Vol.296, №11.-P.7893-7900.
14. Mazin A. Enzymatic DNA methylation as an aging mechanism//Mol. Biol.-1994.-Vol.28, №1.-P.21-51.
15. Monpellier C., Burgeois C., Rokalj V. Detection of methylcytosine rich in heterochromatin on banded chromosomes. Appcication to with cells various status of DNA methylation//Cancer Genet. Cytogenet.-1994.-Vol.78, №1.-P.87-93.
16. Ottaviano V.L., Issa J.P., Pazl F., Smith H. Methylation of the estrogen receptor gene CpG island marks loss of estrogen receptor expression in human breast cancer cells//Cancer Res.-1974.-Vol.54, №10.-P.2552-2555.
17. Parker M., Judge K., Gevers W. Loss of type I procollagen gene expression in SV40-transformed human fibroblasts is accompanied by hypermethylation of these genes//Nucleic. Acids. Res.-1982.-Vol.10, №19.-P.5879-5891.
18. Paul J. General theory of chromosome structure and gene activation in eukaryotes//Nature.-1972.-Vol.238.-P.444-446.
19. Rhodes K., Rippe R., Umezava A., Nehls M. DNA methylation represses the murine alpha 1-collagen promoter by an indirect mechanism//Mol. Cell. Biol.-1994.-Vol.14, №9.-P.5950-5960.
20. Rideout W., Eversole C., Spruck C., Hustad C. Progressive increases in the methylation status and het-erochromatinization of the myo D CpG island during oncogenic transformation//Mol. Cell. Biol.-1994.-Vol.14, №9.-P.6143-6152.
21. Szyf M., Avraham-Haetzni K., Reifman A. DNA methylation pattern is determined by the intracellular level of the methylase//Proc. Nat. Acad. Sci. USA.-1984.-Vol.81, №11.-P.3278-3282.
22. Weitzman S., Turk B., Milkowski D., Kozlowski K. Free radical adducts induce alteration in DNA cytosine methylation//Proc. Nat. Acad. Sci., USA.-1994.-Vol.91, №4.-P.1261-1264.
□ □□
УДК 618.2:578.825.11:611-018 И.В. Довжикова
ГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АКТИВНОСТИ НАДФН-ДИАФОРАЗЫ (МАРКЕРА 1ЧО-СИНТАЗЫ), АДЕНИЛАТ- И ГУАНИЛАТЦИКЛАЗ В ПЛАЦЕНТЕ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ, ОСЛОЖНЕННОЙ ГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИЕЙ
ГУ Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН
РЕЗЮМЕ
С помощью гистохимических методов определения ведущих клеточных регуляторов: гуа-нилатциклазы, аденилатциклазы, КО-синтазы были исследованы 66 плацент от практически здоровых женщин и беременных с герпетической инфекцией. В плацентах от матерей, перенесших герпес отмечалось повышение активности КО-синтазы, являющееся важной частью компенсаторно-приспособительных и защитных реакций плаценты в ответ на вирусное заболевание. В то же время переизбыток свободнорадикальных продуктов N0 оказывает разрушающее действие на плацентарный барьер. Выявлено повышение активности гуани-латциклаза и уменьшение интенсивности работы аденилатциклазы.
SUMMARY
I.V.Dovdgikova
HISTOCHEMIC CHARACTERISTICS OF NADPH DIAPHORASE (NO-SYNTASE MARKER), ADENILATE- AND GUANILATECYCLASE IN PLACENTA OF PATIENTS DURING PREGNANCY COMPLICATED WITH HERPETIC INFECTION
Histochemic methods for determining main cellular regulators guanilatecyclase, adenilatecy-clase, NO-syntase were used to study 66 placentas of healthy patients and patients with herpetic infection. Placentas of mothers with herpetic infection showed increase in activity of NO-syntase which is responsible for compensatory and protective reactions to virus disease in placenta. But
